PLoS ONE: Reduktion af CD16-CD56bright NK Cell Subset Precedes NK Cell dysfunktion i prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Naturlig cytotoksicitet, medieret af naturlige dræberceller (NK-celler) spiller en vigtig rolle ved inhibering og eliminering af maligne tumorceller. For at undersøge immunregulerende rolle NK-celler og deres potentiale som diagnostiske markører blev NK-celle-aktivitet (NKA) analyseret i prostatakræft (PCA) patienter med særlig fokus på NK-celle delmængde distribution.

Metoder

Prospektive data for NKA og NK-celle-undergruppe distributionsmønstre blev målt fra 51 patienter oprindeligt diagnosticeret med PCa og 54 raske kontroller. NKA var repræsenteret af IFN-y-niveauet efter stimulering af det perifere blod med Promoca®. For at bestemme fordelingen af ​​NK-celle delmængder, blev PBMC’er farves med fluorochrom-konjugerede monoklonale antistoffer. Derefter CD16

+ CD56

dim og CD16

-CD56

lyse celler gated på CD56

+ CD3

-. Celler blev analyseret ved hjælp af et flow-cytometer

Resultater Salg

NKA og andelen af ​​CD56

lyse celler var signifikant lavere i PCA patienter sammenlignet med kontroller (430,9 pg /ml vs. 975,2 pg /ml og 2,3% vs. 3,8%, henholdsvis;

s 0,001

). Begge havde en tendens til gradvist falde efter kræft fase progression (

s

for trend =

0,001

). En signifikant højere CD56

dim-til-CD56

lyse celle-forholdet blev observeret i PCA-patienter (41,8 vs. 30,3;

s 0,001

) sammen med en gradvis stigning i henhold til kræft fase progression (

s

for trend =

0,001

), hvilket indebærer en betydelig reduktion af CD56

lyse celler i forhold til ændring af CD56

dim celler. Følsomheden og specificiteten af ​​NKA vedrørende PCa afsløring var 72% og 74%, henholdsvis (bedste cut-off værdi på 530,9 pg /ml, AUC = 0,786).

Konklusioner

Reduktion af CD56

lyse celler kan gå forud for NK-celle dysfunktion, hvilket fører til nedsat cytotoksicitet mod PCA celler. Disse observationer kan forklare en af ​​mekanismerne bag NK-celle dysfunktion observeret i PCa mikromiljø og yde støtte til udviklingen af ​​fremtidige kræft immunterapeutiske strategier

Henvisning:. Koo KC, Shim DH, Yang CM, Lee SB, Kim SM , Shin TY, et al. (2013) Reduktion af CD16

-CD56

lyse NK Cell Subset Precedes NK Cell dysfunktion i prostatakræft. PLoS ONE 8 (11): e78049. doi: 10,1371 /journal.pone.0078049

Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA

Modtaget: Juni 12, 2013; Accepteret: September 8, 2013; Udgivet: November 4, 2013 |

Copyright: © 2013 Koo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2012 til 0.000.807). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. En forfatter, SMK, er en medarbejder på ATgen der hjalp med den eksperimentelle proces. Det betyder dog ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Naturlig killer (NK) celler tjener en stor rolle i det medfødte og adaptive immunresponser mod tumoren transformation eller patogen-inficerede celler [1]. NK-celler udøver naturlige cytotoksicitet at eliminere maligne celler uden forudgående sensibilisering eller klasse I MHC restriktion [1], [2]. Endvidere NK-celler stimulerer den adaptive immunreaktion ved at udskille proinflammatoriske cytokiner til at modvirke escape mekanismer fremmes af tumorceller [3]. Der er gjort fremskridt i forståelsen af ​​biologi NK-celler; ikke desto mindre, er fortsat yderligere afklaring vedrørende anti-tumor effekter af NK-celle aktivitet (NKA) og mønstre af delmængde distribution i PSA.

NK-celler defineres fænotypisk ved deres udtryk for CD56 og mangel på CD3 udtryk [4]. Ifølge membran tætheder af CD56 og CD16, er NK-celler klassificeret i CD16

+ CD56

dim og CD16

-CD56

lyse delmængder [5]. De fleste er CD56

dim celler, der hovedsageligt udøver potent cytotoksicitet [6]. I modsætning hertil CD56

lyse celler medierer lav cytotoksicitet men erhverve større cytolytisk aktivitet end CD56

dim celler efter aktivering på grund af frigivelse af proinflammatoriske cytokiner, såsom IFN-γ [7]. Niveauet af IFN-γ, dvs. NKA, er generelt forbundet med onkologisk prognose, hvilket indebærer den væsentlige rolle differentiel NK-celle delmængde ekspression i immun- regulering af tumorceller [8]. NKA har vist sig at tjene en vigtig rolle i overvågning og i afskaffelsen af ​​tumorceller [9]. Undersøgelser har vist, at lav NKA fører til høje niveauer af tumor forekomst og metastase, og at dens grad korrelerer med invasivitet af malignitet [10]. Tværtimod har høj NKA vist sig at korrelere med lavere forekomst af tumorer, og deres infiltration i visse tumorer, dvs., melanom, hoved og hals pladecellecarcinomer, er en indikator for en bedre onkologisk resultat [11], [12] .

der er akkumulerende beviser for, at nedsat immunforsvar er en afgørende faktor i patogenesen af ​​prostatakræft (PCA) [13], [14]. NK-celle dysfunktion har været impliceret i PCa sammen med en række tumorer [15], [16]. Trods flere foreslåede mekanismer, herunder reduceret antal, immunosuppressive cytokiner og receptor repertoire ubalance, er patofysiologien af ​​NK-celle dysfunktion hos PCa ikke fuldt forstået [5]. Med hensyn til rolle NKA i tumor undertrykkelse, udnyttelse af mekanismerne i NK-celler kunne klart være en vigtig komponent for en vellykket immunterapi mod PSA. Prostata-specifikt antigen (PSA) er den mest udbredte serummarkør der har revolutioneret tidlig påvisning og behandling af PSA. Men den relative mangel på kræft-specificitet og manglen på en øvre eller nedre grænseværdi er store ulemper.

For at løse disse problemer, NKA og fordelingerne af CD56

dim og CD56

lyse undersæt blev analyseret mellem PCA patienter og kontroller. Vores resultater viser, at immunoregulering i PCa er forringet på grund af en reduktion i NKA Forud omfordeling af NK celle delmængder. Desuden er vurderingen af ​​den diagnostiske ydeevne NKA afslørede, at den kan anvendes som en støttende markør foruden PSA.

Materialer og metoder

1. Patienter og kontroller

Dette prospektive tværgående analyse involverede 51 patienter med nyligt diagnosticeret biopsi-verificeret PCa grundet en PSA elevation noteret på helbredsundersøgelser fra marts til december, 2012. 54 aldersmatchede kontroller var selv Frivillige raske individer, hvis prostata volumen, PSA, og DRE var inden for normale accepterede intervaller. Ingen af ​​patienterne havde fået behandling for PCa, var kendt for at have immunologisk eller andre maligne tilstande, og alle var fri for aktiv infektion eller inflammation som vurderet af hvide blodlegemer 10.000 celler /mikroliter og C-reaktivt protein 1,0 mg /l (tabel 1). Alle kontroller var fri for inflammatoriske tilstande uden forudgående udsættelse for immunosuppressive midler. Uafhængig godkendelse blev opnået fra Yonsei University Ethics Committee (4-2011-0660), med alle blodprøver efter forudgående informeret samtykke til radikal prostatektomi. Alle deltagere forudsat skriftlige samtykke til at deltage i den aktuelle undersøgelse.

2. NK celle aktivitet

Cytotoksisk aktivitet af NK-celler blev bestemt ved anvendelse af NK Vue-Kit® (ATgen, Sungnam, Korea). Fuldblod blev indsamlet ved brug BD Vacutainer® heparin

N1 rør. 1 ml fuldblod blev inkuberet i 24 timer, ved 37 ° C under 5% CO

2 med angivne dosis Promoca® og 1 ml RPMI 1640-medier. Cellefrie supernatanter blev høstet, og IFN-y-niveauer blev bestemt ifølge producentens protokoller.

3. NK Cell Subset Distribution

3.1. Udarbejdelse af PBMC’er.

3 ml hepariniseret veneblod blev opnået og analyseret inden 4 timer for indsamlingen. PBMC’er blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse CPT® celleforarbejdningsprocesser rør (BD Vacutainer®) ved 1600 g i 20 minutter ved 20 ° C. De indsamlede PBMC’er (1-2 × 10

6 celler /ml) blev vasket og resuspenderet i 5% føtalt bovint serum (FBS) + phosphatbufret saltvand (PBS).

3.2. Antistoffarvning.

I ekspressionen af ​​CD3, CD16, og CD56 på NK-celler, PBMC’er blev farvet med Alexa-anti-CD3, PE-anti-CD16 og FITC-anti-CD56 fluorokromkonjugerede monoklonale antistoffer (BD Biosciences). Efter farvning i 30 minutter ved 4 ° C blev cellerne vasket grundigt og fikseret i 1% paraformaldehyd-PBS indtil vurdering.

3.3. Flowcytometri.

For at bestemme den samlede procentdel af NK-celler gated i CD3

-CD56

+ cellepopulation blev mindst 10.000 målceller erhvervet af LSRII flow-cytometri (BD Biosciences). Fordelingen af ​​CD16

+ CD56

dim NK-celler og CD16

-CD56

lyse NK-celler gated fra CD3

-CD56

+ cellepopulation præsenteres som den procentdel af den samlede NK-celler. For hver prøve blev dataene yderligere analyseret af FlowJo 8.1.1.1 (Tree stjerne, Inc., Ashland, OR, USA).

4. Kræft Stage Klassifikation

PCa iscenesættelse blev bestemt efter 7

th amerikanske fælles udvalg om kræft (AJCC) TNM system. Stage distribution og patologiske egenskaber er vist i tabel 2. Patologi blev bekræftet af en enkelt patolog.

5. Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført under anvendelse Mann-Whitney U tests, når man sammenligner uparrede to-gruppe data og Kruskal-Wallis test med Bonferroni post-hoc korrektion ved sammenligning mere end to grupper. Nøjagtigheden af ​​NKA og CD56

dim-til-CD56

lyse forhold i detektering PCa blev bestemt ved Receiver Operating egenskaber afledt areal under kurven (AUC). Korrelation analyse blev anvendt til at evaluere sammenslutninger blandt NKA, CD56

dim-til-CD56

lyse forhold og klinisk-patologiske variabler. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS (v.18.0).

Resultater

1. Demografisk data

Alle patienter og kontroller blev klinisk og patologisk undersøgt med hensyn til faktorer, der er vist i tabel 1. Faktorer, der kan påvirke ens immunstatus manifesteret ingen forskel mellem grupperne.

2. Hyppigheden af ​​NK-celler og Fordeling af CD56

dim og CD56

lyse NK celledelmængder

Repræsentant flowcytometrisk data viser fordelingen af ​​den samlede NK-celle population repræsenteret CD3

-CD56

+ celler (fig. 1A) og to store delgrupper CD16

+ CD56

dim og CD16

-CD56

lyse, udtrykt som en procentdel af de samlede NK-celler (fig. 1B). Total NK cirkulerende frekvenser ikke variere mellem patienter og kontroller eller mellem kræft fase grupper (figur 2A;. Tabel 2). Imidlertid blev en privilegeret fald i hyppigheden af ​​CD56

lyse celler noteret hos patienter. Desuden CD56

lyse celler tendens til gradvist falde ifølge cancer fase progression, dvs. extracapsular forlængelse, LN eller tilstødende organer metastase (figur 2B;. Tabel 2). En signifikant højere CD56

dim-til-CD56

lyse NK-celle-forholdet blev observeret hos patienter sammenlignet med kontroller, med en tendens til at stige i henhold til trin progression (

s

for trend =

0,001

) (tabel 2).

(B) Repræsentative flowcytometriske data for to store NK-celle delmængder påvist i perifert blod. Venstre, øvre kasse: CD16

+ CD56

dim NK-celle delmængde. Right, nederste boks:. CD16

-CD56

lyse NK-celle delmængde

Ingen signifikante forskelle i total NK befolkning blev noteret mellem patienter og kontrolpersoner, og inden stage grupper. (B) Boxplot diagrammer, der viser flowcytometriske fordeling resultater af CD56

dim og CD56

lyse subset uddelingerne i alt NK-celler mellem kontroller og patienter, grupperet efter kræft scenen. * P 0,05, ** p 0,01 i forhold til kontrol

3.. NK-celleaktivitet

opnåede resultater er vist i fig. 3 og tabel 2. Som angivet patienter viste signifikant lavere NKA. Ifølge scenen progression, dem med højere stadier viste en større reduktion af NKA (

s

for trend

0,001

).

** p 0,01 i forhold til kontroller.

4. Analyse af ROC kurver

ROC kurver og bedste afskæringsværdier blev anvendt til at beregne sensitivitet og specificitet af NK celle-relaterede parametre (tabel 3). Følsomheden og specificiteten af ​​NKA med hensyn til PCa afsløring var 72% og 74%, henholdsvis, mens CD56

dim-til-CD56

lyse celle-forholdet viste en følsomhed på 66% og en specificitet på 71% ( fig. 4A). I yderligere analyse, blev følsomheden og specificiteten af ​​NKA bestemt ifølge to PSA-værdierne grupperet som 4 til 10 ng /ml, hvilket er den diagnostiske gråzone, og mængder større end 10 ng /ml. Ved en indstillet specificitet på 74%, NKA for PSA værdier inden den grå-zone viste højere følsomhed (73% vs. 70%) og AUC (0,82 ± 0,06 vs. 0,76 ± 0,07) i forhold til PSA-værdier større end 10 ng /ml (fig. 4B).

(AUC = Areal under kurven). (B) ROC kurver sammenligne opførelser af NK-celle aktivitet måling i henhold til PSA grupperet som; 4 til 10 ng /ml og større end 10 ng /ml. (AUC = arealet under kurven).

5. NK celle aktivitet og CD56

dim-til-CD56

lyse Cell Ratio Ifølge klinisk-patologisk variabler

NKA viste negative korrelationer med PSA, kræft scene, og CD56

dim-til-CD56

lyse forhold. På den anden side viste CD56

dim-til-CD56

lyse celle-forhold positive korrelationer med PSA og kræft fase (tabel 4). NKA og CD56

dim-til-CD56

lyse forhold blev sammenlignet mellem kontroller og patienter grupperet efter klinisk-patologiske variabler (tabel 5). Selvom CD56

dim-til-CD56

lyse forhold undladt at diskriminere patienter med Gleason score 7 og dem uden extracapsular udvidelse fra kontrol, alle andre undergrupper var skelnes fra kontroller ved NKA og CD56

dim-til -CD56

lyse forhold. Analyse i-mellem patient undergrupper viste signifikant højere CD56

dim-til-CD56

lyse forhold til patienter med patologisk bekræftet LN metastaser (

p = 0,043

, data ikke vist).

diskussion

Formålet med denne undersøgelse var at præcisere, hvilken rolle NK-celler i immunrespons mod PSA. Der er blevet foreslået adskillige mekanismer PCA udvikling og progression, herunder hormonelle, metaboliske ændringer, og immunrespons [6], [17]. Der er akkumulerende beviser for, at forskellige lymfocytpopulationer er involveret i cellemedieret immunsuppression, som fører til forekomst og progression af PCa [13], [18], [19]. Men der er begrænset information om funktionelle rolle af NK-celler i immunresponset på PSA. For at løse dette problem, vi undersøgte NKA som en markør for IFN-γ niveauer og fordelingen af ​​NK celle-undergrupper i PCA patienter. Resultaterne af vores undersøgelse viser, at forringet NKA formodentlig indledes med en reduktion i CD56

lyse celler, og at niveauet af NKA kunne udnyttes som en støttende diagnostisk markør for PSA.

1. Differentieret Reduktion af CD56

lyse NK Celler i PCA Patienter

NK-celler er funktionelt klassificeret i CD56

dim og CD56

lyse delmængder. CD16

+ CD56

dim celler er effektorceller med høje mængder af cytolytiske granuler, der udtrykker potent cytotoksicitet mod tumorceller [4]. CD16

-CD56

lyse celler frigiver proinflammatoriske cytokiner såsom IFN-γ, der driver inflammatoriske mekanismer, der regulerer tumor initiering, immunoevasion, overlevelse, og udvækst [20], [21]. Nylige opdagelser har afsløret, at CD56

lyse celler udgør størstedelen af ​​NK-celler i lymfevæv og at de ikke er blot en mindre subpopulation blandt NK-celler, men er umodne precursorer af CD56

dim celler [22]. Dette arbejde fokuserer på netop denne delmængde, om dens betydning i reguleringen af ​​NK cellemedieret respons mod tumorceller.

Undersøgelse om fordelingsmæssige mønstre af NK celle-undergrupper viste et signifikant fald i CD56

lyse celler uden ændring af CD56

dim celler. Tidligere undersøgelser om forskellige tumor-bærende værter har rapporteret temmelig distinkte indbyrdes forhold mellem CD56

dim og CD56

lyse delmængder. I modsætning til vores resultater, blev en reduktion i CD56

dim celler uden ændring af CD56

lyse celler bemærket i gastriske og esophageal cancere [23]. På den anden side, blev der observeret en reduktion i CD56

lyse celler i bryst, hoved og hals kræft, og en ligelig fordeling af CD56

dim celler i PCa; resultater, der er i overensstemmelse med den nuværende undersøgelse [7], [17].

2. Ændring af CD56

lyse NK-celler som en reaktion mekanisme til Tumor mikromiljø

Vores undersøgelse observerede primært en præferentiel reduktion af CD56

lyse celler uden ændring af CD56

dim celler. Selvom den underliggende årsag er endnu ikke klart defineret, kan to mulige forklaringer hæves; modningsproces og rekrutteringsproces.

Som nævnt, er CD56

lyse celler accepteret som forstadier til CD56

dim celler, hvor hver delmængde repræsenterer en distinkt modning fase [24]. Muligvis kan en stor efterspørgsel efter effektor celler som reaktion på tumor har provokeret en overgang af umodne CD56

lyse celler i CD56

dim celler. En lignende forklaring er blevet foreslået til reduktion af CD56

lyse celler hos patienter med hoved og hals kræft [7]. Men dette forudsætter en samtidig stigning i CD56

dim celler, som ikke blev observeret i den foreliggende undersøgelse.

En alternativ forklaring uden demonstration er at perifere CD56

lyse celler kan have været rekrutteret til lymfoide vævssteder som metastatiske LN at erhverve cytotoksicitet. Denne idé blev baseret på tidligere observationer, at CD56

lyse celler fortrinsvis ophobes i T-celle område LN indtil blive aktiveret til at producere proinflammatoriske cytokiner [7], [22,22]. Desuden den observation, at CD56

lyse celler isoleret fra humane LN bliver cytotoksisk kraftigt ved stimulering med IL-2 viser, at NK-celler rekrutteret til LN, eventuelt er en umoden pulje af effektorceller [25]. En signifikant højere CD56

dim-til-CD56

lyse celle-forhold i patienter med patologisk bekræftet LN metastase blev observeret i vores undersøgelse indicerer, at disse cirkulerende celler kan være blevet rekrutteret til patologiske eller sekundære LN som respons på tumoren. Dette er relevant, fordi LN er som regel de primære metastatiske steder og CD56

lyse celler er den primære delmængde findes i LN, der modvirker de metastatiske celler [26]. For at bekræfte dette problem, ville det være interessant at undersøge, om CD56

lyse celler akkumuleres i metastatiske LN efter LN dissektion.

3. NK celle dysfunktion som følge af reduktion af CD56

lyse NK-celler

NKA blev undersøgt for at bestemme indflydelsen af ​​reduktion af CD56

lyse celler på cytolytisk aktivitet mod tumorceller. Sideløbende med observationer med CD56

lyse celler, blev NKA observeret at være lavere i PCA patienter, sammen med en tendens til gradvist falde efter kræft fase progression. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viste NKA er kompromitteret i et bredt spektrum af hæmatologiske og solide tumorer [8], [10], [27]. er blevet foreslået adskillige mekanismer kompromitteret NKA, såsom nedsat antal tumor-infiltrerende NK-celler [23], øgede overflade receptorer for immun suppressor faktorer [28], og inaktivering af effektor celler [10].

Korrelationer observeret mellem NKA og CD56

dim-til-CD56

lyse celle-forholdet kan være af direkte relevans for foreslå en mekanisme, som svage NKA er en konsekvens af reduceret CD56

lyse celler. CD56

lyse celler vides at være vigtige kilder til IFN-γ [22], som observeret i

in vitro

undersøgelser, hvor CD56

lyse celler blev vist til fortrinsvis formere i co-kultur med umodne dendritiske celler og lipopolysaccharider til at producere IFN-γ [29]. Også, stimulering af CD56

lyse celler med transducerede carcinomceller resulterede i en forøget evne til at producere IFN-γ og bibringe høj [6] cytotoksicitet. Endvidere

in vivo

undersøgelser har vist, at tonsillar CD56

lyse celler producerer IFN-γ før modning til effektorceller [25]. Omvendt blev en reduktion af CD56

lyse celler observeret at inducere nedsat sekretion af IFN-γ i patienter med allergisk rhinitis [30]. I betragtning af disse støttende fund, at udskillelse af IFN-γ afhænger direkte på CD56

lyse celler, foreslår vi, at reduktionen af ​​CD56

lyse celler er en potentiel mekanisme er involveret i lav NKA, hvilket fører til nedsat cytotoksicitet mod PCA celler.

4. NK celle aktivitet, en støttende diagnostisk markør for PSA

ROC kurver viste, at NKA kan tjene som en støttende markør for PSA i diagnosticering PCa. Selv om det er klart, at PSA giver den højeste diagnostiske værdi til PCA, en stor begrænsning er dens mangel på cancer-specificitet, der forårsager unødvendige risici og omkostninger, især i den diagnostiske gråzone [31]. Selvom aktuelle udfordringer stræber efter at udvikle nye metoder til PCa afsløring, har ingen klart opvejes af fordelene mod ulemperne [14]. Denne undersøgelse rejser muligheden for, at NKA kan anvendes i kombination med PSA at tilvejebringe yderligere diagnostisk værdi, især for dem, der i det diagnostiske gråzone.

Denne undersøgelse var baseret på kontrol versus patienter diagnosticeret med PCa skyldes forhøjet PSA på en rutinemæssig helbredsundersøgelse. Derfor er fraværet af PCA patienter med normal PSA ( 4 ng /ml) var den største begrænsning ved denne undersøgelse, som hæmmes en direkte sammenligning af diagnostiske udbytte mellem PSA og NKA. En udvidet befolkningsundersøgelse er nødvendig for at bekræfte vores foreløbige resultater og vurdere omkostningseffektivitet.

Konklusioner

Denne observationsstudie forudsat nye fund, at CD56

lyse celler tjener en vigtig rolle i adaptiv respons mod PCA celler. Dette begreb giver yderligere støtte, som langsgående undersøgelser vedrørende NK celle immunosurveillance klart fortjener yderligere forskning til potentielt føre til nye immunterapeutiske strategier for at øge onkologiske resultater af PSA.