PLoS ONE: DNA Methyltransferase Inhibitors forbedre effekten af ​​kemoterapeutiske stoffer i SW48 og HT-29 Kolorektal Cancer Cells

Abstrakt

DNA methylering er en epigenetisk fænomen kendt for at spille en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​menneskelig kræft. Enzym ansvarlig for denne proces er DNA methyltransferase en (DNMT1), der opretholder et ændret methylering mønster ved at kopiere det fra forældre til datter DNA-strenge efter replikation. Afvigende methylering af promotorområder af gener kritiske for normale cellulære funktioner er potentielt reversibel. Derfor inaktivering af DNMT1 synes at være et værdifuldt mål for udviklingen af ​​behandlinger mod kræft. I øjeblikket er de mest populære DNMT hæmmere (DNMTi) er cytidinanaloger som 5-azacytidin, 5-aza-2′-deoxycytidin (decitabin) og pyrimidin-2-on ribonucleosid (zebularin). I kolorektal cancer, epigenetiske modifikationer spiller en væsentlig rolle på hvert trin i carcinogenese. Derfor har vi rettet den hypotese, at DNA methyltransferase-inhibitorer kan forstærke inhiberende virkninger af klassiske kemoterapeutiske midler, såsom oxaliplatin og 5-fluorouracil (5-FU), der almindeligvis anvendes i kolorektal cancer terapi. Her vores rapport viser, at DNMTi kan have positive interaktioner med standard kemoterapeutika i kolorektal cancer behandling. Brug farmakologiske modeller for lægemiddelinteraktion analyse har vi vist, at kombinationen af ​​decitabin med 5-FU eller oxaliplatin viser den mest attraktive interaktion (synergi), mens effekten af ​​zebularin i kombinationer med kemoterapeutika er moderat og kan afhang genetiske /epigenetisk baggrund af en cellelinie eller sekundært stof anvendes i kombination. Vores resultater tyder på, at DNMTi administreret i kombination med standard kemoterapi kan forbedre behandlingen af ​​patienter med tarmkræft

Henvisning:. Flis S, Gnyszka A, Flis K (2014) DNA Methyltransferase Inhibitors forbedre effekten af ​​kemoterapeutiske stoffer i SW48 og HT-29 Kolorektal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (3): e92305. doi: 10,1371 /journal.pone.0092305

Redaktør: Caterina Cinti, Klinisk Institut Fysiologi, c /o Toscana Life Sciences Foundation, Italien

Modtaget: 18 oktober, 2013; Accepteret: 20 februar 2014; Udgivet: Marts 27, 2014

Copyright: © 2014 Flis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud nr. N405 139.139 fra National Science Center Polen (https://www.ncn.gov.pl/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den anden mest almindelige kræftform i den ikke-ryger befolkning på verdensplan. Det anslås, at over 600000 mennesker dør af det globalt hvert år [1]. Det betyder, at colorektal cancer er en førende årsag til kræft dødsfald. Desværre, CRC udvikler i lang tid uden nogen symptomer; derfor sygdommen indregnes til fremskredne stadier. Generelt er risikoen for CRC stiger med alderen og er forårsaget ikke kun af genetiske ændringer involverer onkogener og tumorsuppressorgener, men er også drevet af epigenetiske ændringer indebærer ændringer i genekspression mønstre, som ikke afhængig af ændringer i DNA-sekvensen. En af de epigenetiske begivenheder skyldes DNA-methyltransferaser (DNMTs), som katalyserer den kovalente addition af methylgruppen til 5′-stillingen af ​​cytosin i CpG-dinukleotidet fra donoren

S

-adenosylmethionine. Cytosin methylering forekommer i genomiske regioner kaldet CpG-øer, og det er kendt at ændre kromatinstrukturen fører til gene silencing. Under kolorektal cancer progression, er en global genom demethylering kombineret med selektiv hypermethylering af tumorsuppressorer, celle cyklus regulatorer og proapoptotiske gener observeret [2]. Fordi epigenetiske modifikationer er potentielt reversible, de udgør en interessant terapeutisk strategi med brug af DNMT hæmmere (DNMTi).

Decitabin og zebularin er DNMT inhibitorer, der potentielt kan vende epigenetiske ændringer resulterer i reaktivering af tavshed gener, blokering kræft celleproliferation og /eller inducere apoptose [3], [4]. Begge midler synes at være meget interessant og værdifuldt til behandling af faste tumorer. Decitabin, en cytidin analog, er blevet godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) til behandling af blodkræftsygdomme [5], mens zebularin i forhold til andre cytidinanaloger er mere stabilt, mindre giftige og kan oralt [6 ].

Det synes at være rimeligt at anvende demethylere agenter i kombination med kemoterapeutiske midler. Interessant, blev opmuntrende resultater opnået med en kombination af decitabin og carboplatin hos patienter med solide tumorer [7]. Forfatterne konkluderede, at decitabin kombinerer sikkert med carboplatin og at kuren forårsager epigenetiske ændringer. I en anden fase I studie, en kombination af cisplatin med decitabin resulterede i en delvis respons hos patienter med livmoderhalskræft og to mindre reaktioner: en i patient med ikke-småcellet lungekræft og den anden i patient med livmoderhalskræft [8]. Men på trods linjer af beviser for, at demethylering agenter kan forbedre anticancer aktivitet af klassiske kemoterapeutiske midler, den viden til at bruge dem til solide tumorer er stadig utilstrækkelig og skal evalueres yderligere.

Derfor, for at teste denne hypotese, CRC-cellelinien overlevelse model blev valgt at studere disse interaktioner. Ved hjælp af denne model og farmakologiske analyse har vi designet undersøgelse for at finde ud af resultatet af samspillet mellem DNMT hæmmere, decitabin eller zebularin, og klassiske anticancer kemoterapeutika anvendes i behandlingen af ​​CRC såsom oxaliplatin, en inter- og intra- DNA krydsbindingsmiddel, og 5-fluorouracil, en thymidylatsyntase-inhibitor. Undersøgelserne af samspillet mellem kemoterapeutiske stoffer og DNMTi agenter synes at være rimeligt, fordi alle disse forbindelser er blevet testet for deres cytotoksiske egenskaber mod normale celler [5], [9], [10] og alle dem undtagen zebularin er godkendt af US FDA til medicinsk brug.

Materialer og metoder

Cell kultur og medicinsk behandling

Som en model af tyktarmskræft celler, HT-29 og SW48 human kolorektal cancer celle linier, opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), blev anvendt. Cellerne blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco, Paisley, UK) suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS, Gibco), 2 mM Glutamax (Gibco), 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 250 ng /ml amphoterycin (Gibco) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Celler blev inkuberet med lægemidler i 24, 48 og 72 timer, men kun resultater observeret efter 72 h behandling præsenteres som deres positive bliver mere udtalte.

Drugs Salg

Følgende lægemidler blev undersøgt : 5-fluoruracil (5-FU), oxaliplatin, zebularin og decitabin (Sigma, St. Louis, MI, USA). Koncentrationerne af lægemidlerne var i området op til 100 uM. Alle midler blev opløst i dimethylsulfoxid Hybri-Max (DMSO, Sigma) og derefter fortyndet i medierne til eksperimenter. Slutkoncentrationen af ​​DMSO, uden at påvirke celleoverlevelse, blev holdt på 0,2%. I alle eksperimenter blev kontrolceller inkuberet med DMSO.

MTT assay

Assayet beror på evnen af ​​levedygtige celler til metabolisk reducere en gul tetrazoliumsalt til et violet formazanprodukt. Denne reaktion kræver aktive mitokondriske reduktase-enzymer. Salg

Celler blev dyrket i 96-brønds plader (1 × 10

4 celler /200 pi /brønd). Efter inkubation med reagenserne blev mediet fjernet, og cellerne blev behandlet med 50 pi 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid opløsning (MTT, Sigma) i 4 timer ved 37 ° C. Dernæst blev 150 pi solubilisering opløsning (10% natriumdodecylsulfat, SDS) tilsat, og blandingen blev inkuberet ved 37 ° C natten over. Det solubiliserede formazanprodukt blev spektrofotometrisk kvantificeret under anvendelse af en mikrotiterpladelæser, Power Wave XS (Bio-Tek, Winooski, VT, USA), ved 570 nm bølgelængde. Salg

Analyse af lægemiddelinteraktioner Salg

Celler af SW48 og HT-29 cellelinier blev samtidigt inkuberet i 72 timer med kemoterapeutiske midler og DNMT inhibitorer eller med alene hvert middel. Karakteren af ​​samspillet mellem lægemidler undersøgte blev analyseret ved hjælp af izobologram [11] og kombinationen-indeks (CI) metoder, der er afledt af median-effekt princip Chou og Talalay [12], [13]. De opnåede fra cytotoksicitet forsøgene data blev anvendt til matematiske og kvantitative evaluering af lægemiddelinteraktioner.

isoboler blev defineret af virkningerne af de parrede narkotika undersøgt. De opnåede ved halvmaksimal inhiberende koncentration effekter (IC

50) af enten lægemidlet i parret dannede grundlag for additivitet linje; synergi eller antagonisme var til stede, da den samme virkning blev opnået ved en kombination af lægemidler i lavere eller højere doser henholdsvis.

En kommerciel softwarepakke, CalcuSyn ver. 2.0 (Biosoft, Cambridge, Storbritannien), blev anvendt til median-effekt-analyse. Vi beregnede CI værdier baseret på formlen: CI = (D)

1 /(D

x)

1 + (D)

2 /(D

x)

2 for gensidigt udelukkende lægemidler. I nævneren, (D

x) er for D

1 “alene”, der hæmmer et system

x

%, og (D

x)

2 er for D

2 “alene”, der hæmmer et system

x

%. I tællere, (D)

1 + (D)

2 “i kombination” også hæmme

x

%. Cl-værdier blev genereret ved forskellige effektniveauer (Fa, det påvirkes af D fraktion, dvs. procent hæmning /100) fra 0,05 til 0,95 (5-95% celle kill). Synergi er angivet med Cl-værdier 1, additivitet af Cl-værdier = 1 og antagonisme af Cl-værdier . 1

Flowcytometrianalyse

For cellecyklus analyse cellerne (~ 1 × 10

6) blev suspenderet i 4 ml 80% ethanol (-20 ° C) og inkuberet ved -20 ° C i 24 timer, vasket to gange i phosphatbufret saltvand (PBS) og farvet med 50 ug /ml propidiumiodid (PI) og 100 pg /ml RNase i 0,1% PBST-opløsning (PBS suppleret med 0,1% Triton X-100) i 30 minutter i mørke ved 4 ° C. Prøverne blev derefter målt under anvendelse af en BD FACSCalibure flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). DNA histogrammer blev analyseret ved anvendelse ModFit software (BD Biosciences).

Apoptose af cellerne blev målt, ifølge producentens anvisninger ved anvendelse af en annexin V-FITC Kit (BD Biosciences). Cellerne blev opsamlet efter behandlingen, vasket to gange med PBS og centrifugeret. Cellepelleten blev resuspenderet i iskold bindingsbuffer. De annexin V-FITC og PI opløsninger blev tilsat til cellesuspensionen og blandet forsigtigt. Prøverne blev derefter inkuberet i 15 minutter i mørke før flowcytometrianalyse.

I immunfluorescensfarvning blev celler fikseret i 1,5% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) og permeabiliseret med kold methanol i 20 minutter ved 4 ° C. Efter vask blev cellerne inkuberet med ønsket primært antistof (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) mod phospho-ATR [(P) -Ser428, kat. No. 2853] og phospho-ATM [(P) -Ser1981, kat. No. 5883] ved 1: 100 fortynding i 0,5% BSA /PBS i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev passende sekundært antistof konjugeret med FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) tilsat ved 1: 500 fortynding i 0,5% BSA /PBS og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask blev cellerne analyseret ved flowcytometri.

I alle applikationer 10.000 begivenheder pr prøve blev analyseret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS).

Semi-kvantitativ RT-PCR

mRNA niveauer af

CCNE1

,

ATM

GAPDH

blev analyseret ved RT-PCR under anvendelse af totalt RNA fra HT-29 og SW48-celler isoleret ved anvendelse af GenElute ™ Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma), som beskrevet af producenten. Et hundrede ng af total RNA blev anvendt i revers transkription-reaktion med Omniscript revers transkriptase (Qiagen, Hilden, Tyskland) og oligo (dT)

18 primer (Fermentas, Vilnius). PCR-amplifikationer blev udført i et 50 pi totalvolumen ifølge fabrikantens instruktioner ved anvendelse HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 3 pi cDNA som en skabelon og de følgende primere parvis:

CCNE1

(5′-AACTCAACGTGCAAGCCTCG-3 ‘, 5′-CATCTCCTGAACAAGCTCCA-3’),

ATM Hotel (5′-GCCTTGAGTCTGTGTATTCG-3 ‘, 5′-CCACTCAGAGACTCCACAGC-3’) og

GAPDH

(5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3 ‘, 5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3’).

GAPDH

mRNA niveauer blev brugt som interne kontroller. De amplificerede fragmenter blev separeret på 2% agarosegeler, farvet med ethidiumbromid og fotograferet under UV-lys.

Fremstilling af proteinlysater og Western blotting

Cellerne blev vasket med kold PBS-buffer og derefter proteiner fra fem cellulære rum blev isoleret ved anvendelse af Subcellulær Protein og Fraktionering Kit til dyrkede celler (Pierce, Rockford, IL, USA). proteinkoncentration i prøverne blev målt ved anvendelse af BCA protein assay kit (Pierce). Prøver indeholdende 60 ug protein blev denatureret og fraktioneret med 7, 12 eller 15% SDS-PAGE. Efter elektroforese blev proteinerne overført til en nitrocellulosemembran og probet med anti-humane antistoffer er specifikke for: cyclin A1 og D1, PARP, caspase-3 og -8 (Santa Cruz Biotechnology); (. Cat No. 610.982, BD Biosciences) p21 (. Cat No. 554.228), p53 (. Cat No. 610.183), Bax; β-actin (. Cat No. A1978, Sigma); og DNA Damage Antibody Sampler Kit (phospho-Chk1 [(P) -Ser296], phospho-Chk2 [(P) -Thr68], phospho-histon H2A.X [γH2A.X, (P) -Ser139], phospho- p53 [(P) -Ser15], og phospho-BRCA1 [(P) -Ser1524]. Cat No. 9947; Cell Signaling Technology). Alle antistoffer i DNA Damage Antibody Sampler Kit genkende deres mål proteiner, når ændres på de angivne steder. Derfor blev antistoffer mod ikke-modificerede proteiner ikke brugt.

Anti-Bax antistoffet genkender human Bax-α formular. En alternativ splejsning af Bax præ-mRNA producerer integralet membranformen Bax-α og de to cytosoliske former p og γ. Dette antistof er anbefalet af BD selskab til påvisning af apoptose. Anti-p53 antistof genkender den C-terminale område af proteinet (det 195-393 a.a. blev anvendt som et antigen) og er i stand til at genkende både vildtype og R273H af p53. Dette antistof er også anbefalet af BD selskab til påvisning af apoptose.

Signalet på blots blev opdaget af en kolorimetrisk metode ved hjælp af KN /DAB Substrat Kit (Pierce) og SignalBoost immunreaktion Enhancer Kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA).

Mitokondriel membranpotentiale (ΔΨ

m) måling

Δ

Ψ

m

blev målt ved flowcytometri bruge 10 mg /ml 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolo- carbocyanin iodid (JC-1 farvestof, Sigma), der farver mitokondrier i levende celler. Hos raske celler, farvestoffet akkumuleres i mitokondrierne, danner aggregater, der udsender rød fluorescens, mens farvestoffet i apoptotiske celler forbliver i monomer form i cytoplasmaet og udsender grøn fluorescens. Celler blev behandlet med kemoterapeutika, DNMT inhibitorer eller deres kombinationer i 72 timer og farvet som beskrevet af Mahyar-Roemer

et al.

[14] og derefter undersøgt ved FACSCalibure flowcytometer. Mitokondrier indeholdende røde JC-1 aggregater i raske celler var detekterbare i FL2-kanalen, mens de grønne JC-1 monomerer i apoptotiske celler var detekterbare i FL1-kanalen.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som gennemsnit værdier ± SD. Statistiske sammenligninger mellem grupper blev udført ved t-test eller envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey

post hoc

test. Signifikans blev antaget på

P

0,05 (markeret med stjerner på grafer).

Resultater

Vækst undersøgelser og effekter af kombinationsbehandlinger af kemoterapeutiske stoffer med DNMTi

Som det første skridt, vi undersøgte effekten af agenterne anvendes alene på SW48 og HT-29 cellelevedygtighed. Cellerne blev behandlet med 10 til 100 uM af de evaluerede agenter. Resultaterne af MTT celleviabilitetstest indikerede, at CRC-celler inkuberet med oxaliplatin og 5-FU viste den mest potente inhibering af cellevækst efter 72 h inkubationstid (figur 1). De hæmmende virkninger af kemoterapeutika var dosisafhængig og korrelationskoefficienterne (anslået fra hæmmende dosis-respons kurver) var over 0,9. Demethylering agenter, decitabin og zebularin, har vist forskellige måder hæmning:. Decitabin allerede hæmmende på start koncentration (20 uM) og zebularin viste hæmmende effekt fra 80 og 40 uM for SW48 og HT-29 celler, henholdsvis

cellerne blev behandlet enkeltvis eller i kombinationer med de tiltalt doser af midler til 72; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabin; og ZEB, zebularin. Hvert punkt repræsenterer middelværdien ± SD (n = 5), stjerner angiver en betydning på

P

. 0,05 til sammenligning med oxaliplatin eller 5-FU alene

Vi testede også behandling af kemoterapeutiske midler i kombination med DNMTi på CRC-celler overlevelse (figur 1). Decitabin potenseret de inhiberende virkninger af oxaliplatin ved koncentrationen fra 20 uM til 100 uM, hvorimod dens indvirkning på 5-FU-aktivitet begynder ved 80 uM. Zebularin testet ved koncentrationer op til 100 uM lidt potenserede de inhiberende virkninger af enten kemoterapeutika (figur 1).

Den type lægemiddelinteraktioner to evaluerede sammensatte grupper blev analyseret ved hjælp af isobolografiske og Median effekt metoder. De isobologrammer viser resultater for enkelt 50% effekt niveau og viser, at samspillet mellem decitabin med kemoterapeutiske stoffer medfører synergistisk effekt, mens administration af zebularin med oxaliplatin eller 5-FU resulterer i synergistiske eller lidt additive virkninger (figur 2A).

A. Isobologrammer på en effekt niveau 50%. Koncentrationer af bestemte lægemidler er angivet på x og y-aksen. De isobologrammer blev konstrueret ved at forbinde IC

50 værdier demethylere midler (på ordinaten) med IC

50 af oxaliplatin eller 5-FU afbildet på abscissen. Når doser af to midler i kombination er lavere eller højere end de additive doser synergien eller antagonisme er til stede, henholdsvis. B. Kombination indeksværdier (CI) med et 95% konfidensinterval på alle effektniveauer som beregnes ved den CalcuSyn software. En CI-værdi betydeligt mindre end 1 indikerer synergi, en CI-værdi ubetydeligt forskelligt fra 1 angiver tilsætning og en CI signifikant højere end 1 indikerer antagonisme.

Analyse udføres ved hjælp af median virkning metode bekræftede, at kombinationen af ​​decitabin og kemoterapeutiske stoffer i begge cellelinier producerede synergistiske virkninger ved 50% celle kill niveau (Fa = 0,5), opnå CI (kombinationsindeks) værdier 0,9 (figur 2B).

Kombination af zebularin og kemoterapeutika for Fa = 0,5 angivne små synergistiske eller additive effekter.

Analyse af DNA-skader

For at belyse mekanismen af ​​apoptose vi analyserede phosphoryleringsstatussen af ​​proteiner er af store signalering checkpoints i respons på DNA-skade.

Ved sensing DNA-skader, række cellulære signalveje begivenheder med henblik på at bevare integriteten og korrekt funktion af celler og biologiske veje er involveret. Proteinerne valgt til test af Western blotting indlede kaskader af begivenheder, der blokerer cellecyklusprogression enten at give tid til at reparere beskadiget DNA eller aktivere celledød veje, hvis for meget skade er blevet afholdt. Phosphoryleret histon H2A.X lokaliserer til de steder i DNA-skader og aktiverer ATM /ATR kinaser, de centrale mediatorer af DNA skade responset. Til gengæld, ATM /ATR kinaser indlede kaskader, der inhiberer progression til mitose gennem aktiveringen af ​​CHK kinaser (Chk1 for ATR og Chk2 for ATM) eller tumor suppressor protein p53, hvilket fører til enten cellecyklusstandsning og DNA-reparation eller apoptose gennem regulering af p53 nedstrømseffektorer. BRCA1, som vogter af genomisk stabilitet, også phosphoryleres med ATM, ATR, og Chk2 som svar på DNA-skader og kan co-lokalisere med andre proteiner på DNA skader sites [15].

Vi observerede en signifikant phosphorylering af histon H2A.X ved Ser139 som reaktion på kemoterapeutiske midler og deres kombinationer med DNMTi, især i HT-29-celler. Lavere niveauer af γH2A.X (phospho-H2A.X) blev observeret i celler behandlet med kun DNMTi agenter. Vi observerede også forhøjede niveauer af phosphorylering af proteiner som ATR ved Ser428, ATM på Ser1981, p53 på Ser15, BRCA1 ved Ser1524 samt kinaser Chk1 og Chk2 på Ser345 og Thr68 henholdsvis (figur 3A og B). Phosphorylering status kinaser Chk1 og Chk2 var mere udtalt i HT-29 og derefter i SW48 celler. I SW48-celler, phosphorylering niveauer af Chk1 og Chk2 kinaser var højere efter den kombinerede behandling med oxaliplain og decitabin sammenlignet med behandling med begge kemoterapeutika og DNMTi anvendes enkeltvis (figur 3B).

A. Kvantificering af ATR og ATM fosforylering niveau efter 72 (MFI) blev anvendt. Data repræsenteret middelværdien ± SD (n = 3). Signifikant forskel på

P

≤0.05 er angivet med en stjerne (*). B. Analyse af proteinphosphorylering niveauer ved hjælp af Western blotting-metoden. Påvisningen af ​​β-actin blev anvendt som en gel loading kontrol. OXA, oxaliplatin; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabin; ZEB, zebularin; au, arbitrære enheder.

Kombinationer af kemoterapeutika med DNMTi påvirke cellecyklusprogression og inducere apoptose

I kontrolgruppen kultur, procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen var stabile, mens de testede forbindelser havde forskellige effekter på cellecyklusprogression og apoptose. Behandling med de kemoterapeutiske resulterede i en konsekvent stigning i antallet af celler i S-fasen på bekostning af G1-fasen. Decitabin stop for cellecyklus i G2 /M eller S-fase i SW48 og HT-29 celler. Zebularin ikke udøvede statistisk signifikante ændringer i begge cellelinier i sammenligning med kontrollerne.

Kombinationen af ​​decitabin med oxaliplatin eller 5-FU inducerede en cellecyklusstandsning i S /G2 /M-fase-grænsen og på S-fasen, henholdsvis i begge cellelinier (figur 4). Kombinationen af ​​zebularin med oxaliplatin forøget procentdel af HT-29-celler i S /G2 /M-fase-grænsen, hvorimod kombinationen af ​​zebularin med 5-FU større procentdel af disse celler i S-fase fra 12% til 36% i forhold til kontrol. I tilfælde af SW48-celler, kombinationer af zebularin med kemoterapeutika forårsagede anholdelsen af ​​celler i G2 /M eller S-fase (Figur 4A).

A. Ændringer i cellecyklusfordeling af SW48 og HT-29-celler efter 72 timers behandling med de evaluerede midler. Cellerne blev farvet med propidiumiodid (PI) og derefter analyseret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved anvendelse ModFit LT ™ (version 3.0). Hver søjle repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse. (N≥4). Signifikant forskel på

P

0,05, er angivet med stjerne (*). B. Analyse af

CCNE1

og

ATM

mRNA niveauer ved semi-kvantitativ RT-PCR-metode efter 72 h inkubation af CRC celler med kemoterapeutiske stoffer, DNMTi og deres kombinationer ved koncentrationer som angivet. M, markør [bp];

GAPDH

, transkriptet kodende glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, et konstitutivt udtrykt gen, anvendes som en intern kontrol. C. Western blotting analyse af regulerende proteiner. Den β-actin blev anvendt som en gel loading kontrol. OXA, oxaliplatin; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabin; ZEB, zebularin.

Analysen af ​​genekspression viste, at kombinationen af ​​decitabin med oxaliplatin, sammenlignet med oxaliplatin alene, øget mRNA-niveau på

ATM

i begge cellelinier såvel som

CCNE1

i SW48 cellelinje (figur 4B). Kombinationerne af demethylering midler med 5-FU viste en lignende tendens, men på et lavere niveau end de kombinationer med oxaliplatin. Analysen af ​​proteiner specifikke for cellecyklusprogression afslørede, at kombinationen af ​​DNMTi med kemoterapeutika, sammenlignet med oxaliplatin /5-FU alene, steg niveauet af cyclin A1 og protein p53 og faldt niveauet af cyclin D1 (men ikke i SW48 celler) (figur 4C og 5b). Kombinationen af ​​zebularin med kemoterapeutika øget niveau af p21 i SW48-celler (figur 4C).

A. Påvisning af apoptose ved annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC) /porpidium iodid (PI) analyse. Data er udtrykt som midlet ± standardafvigelse. (N≥4). En stjerne (*) indikerer, at induktion af apoptose af de evaluerede agenter var signifikant sammenlignet med kombinationen af ​​kemoterapeutiske stoffer og DNMT hæmmere

versus

kemoterapeutiske midler anvendes alene (

P

0,05 ). B. Western blotting-analyse af pro-apoptotiske protein niveauer. Den β-actin blev anvendt som en gel loading kontrol. C. Repræsentative cytogrammer af flowcytometri eksperimenter, der demonstrerer ændringer i Δ

Ψ

m

i CRC cellelinier efter 72 timer inkubation med kemoterapeutiske stoffer, DNMT hæmmere og kombinationer. Celler blev farvet med JC-1. Celler i R2 kvadrant blev talt som celler berøvet mitochondriemembranpotential. En stjerne (*) angiver en signifikant forskel mellem forsøgsgrupper og kontrolgruppen ved

P

0,05. OXA, oxaliplatin; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabin; ZEB, zebularin.

Da den langvarig behandling med kemoterapeutika eller DNMTi kunne fremkalde celledød, den tidlige apoptotiske markør blev således analyseret. Til dette formål anvendte vi annexin V, som genkender phosphatidylserin (PS). Under induktion af apoptose, er membranen asymmetri tabt og translokation af PS fra intracellulært til ekstern blad af plasmamembranen finder sted. Som vi forventede, behandlingen af ​​CRC celler med oxaliplatin eller 5-FU alene inducerede apoptose i -30% af cellerne, medens kombinationer af de evaluerede midler generelt øget antallet af apoptotiske celler fra ~45% til 60% (figur 5A ) med undtagelse af HT-29-celler inkuberet med demethyleringsmiddel agenter og oxaliplatin sammen. I dette tilfælde er induktion af apoptose var på et lavere niveau end for andre kombinationer, men stadig statistisk signifikant sammenlignet med oxaliplatin anvendes alene. Desuden blev induktionen af ​​apoptose i CRC celler ved kombination af kemoterapeutiske midler med demethylere midler bekræftet ved ændringer på proteinniveauet af pro-caspase-3 og -8. Den proteolytiske spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) blev augmented efter inkubation af celler med kemoterapeutika og demethylering midler (figur 5B).

Ændringerne i mitokondrie membranpotentiale (ΔΨ

m)

i den tidlige apoptose forstyrrelser af mitokondrielle membranpotentiale Δ

Ψ

m

kan forekomme resulterer i hurtige sammenbrud af den elektrokemiske gradient. I dette arbejde, vi undersøgt effekten af ​​DNMTi, kemoterapeutika eller deres kombinationer på Δ

Ψ

m

ved farvning af cellerne med JC-1 farvestof. Analysen af ​​cytogrammer viste, at de kontrol- cellerne udsendte den røde fluorescens på grund af høj Δ

Ψ

m

, mens celler behandlet med kemoterapeutika og DNMTi agenter udviste øget membran depolarisering, opdaget af grøn fluorescens, og effekt blev opretholdt (oxaliplatin + DNMTi i HT-29-cellelinje), eller stærkere, når cellerne blev co-inkuberet med disse forbindelser (figur 5C).

diskussion

i 90’erne er det blevet bekræftet at CRC resultaterne ikke kun fra ophobning af genetiske mutationer, men også som følge af epigenetiske ændringer af det cellulære genom, der forvandler en normal kirtelepitel i adenocarcinom. Det er velkendt, at den mest grundigt karakteriseret epigenetisk ændring i CRCs er genpromotor hypermethylering, som forekommer i CpG-øer, der er ofte til stede i 5′-området af ca. 60% af generne. Fænomenet betyder fra den øgede aktivitet af DNMT enzym hvis overekspression er kendetegnende for næsten alle de transformerede celler [16]. Et stigende antal gener, som udtrykkes i colon har nu vist sig at blive hypermethyleret og stumme i colorektal cancer. Disse indbefatter gener involveret i cellecykluskontrol, vækst, differentiering, angiogenese, adhæsion, metastase eller DNA-reparation [17]. Da epigenetiske modifikationer er potentielt reversible, blev idéen opstået, at beskæftigelsen af ​​DNMT hæmmere kan forbedre behandlingen af ​​CRC’er, især da de klassiske kemoterapeutika er af begrænset effektivitet i kolorektal cancer behandling. Derfor udvikler af nye strategier for behandling af sådanne tumorer er en udfordring at onkologi [18]. Det er derfor, vi har fremlagt resultaterne af

in vitro

undersøgelse vedrørende interaktioner af standard cytotoksiske lægemidler, 5-FU og oxaliplatin [19], med DNA methyltransferase hæmmere (DNMTi) såsom decitabin og zebularin.

DNMTis har for nylig fået en masse opmærksomhed som agenter hæmmer kræft vækst, herunder kolorektal carcinom [20]. Dog kan den rolle, deres terapeutiske potentiale ordentligt evalueret i kombination med klassiske midler anvendt i CRC behandling, fordi alle nye terapeutiske midler introduceres som add-on muligheder. Siden 5-fluorouracil og oxaliplatin udgør rygraden behandling af CRC [19] undersøgte vi effekten på CRC celler overlevelse tilføje decitabin eller zebularin – DNA methyltransferase-hæmmere – disse kemoterapeutika

Vi har bekræftet under

in vitro

betingelser at de undersøgte midler der gives alene er i stand til at inducere vækstinhibering af cancercellerne med sammenlignelig rækkefølge potensering beregnet på grundlag af den procentdel af celleoverlevelse (figur 1). Desuden har vi fundet en forøget inhibering af CRC vækst celler efter behandling med anticancermidler anvendt i kombination (figur 1). De isobologrammer, som er bygget på grundlag af IC

50 værdier, angivet synergistiske eller additive interaktioner mellem kemoterapeutika og DNMTi agenter. Decitabin havde de mest gunstige interaktioner (synergi) i kombination med kemoterapeutika i begge cellelinier; mens interaktion analyse for zebularin viste moderate synergistiske eller additive effekter og de bedste resultater blev opnået for kombination med oxaliplatin (figur 2).

De konstaterede interaktioner mellem begge DNMTi agenter og kemoterapeutika var dosis- og cellelinie-afhængige. Synergien mellem evaluerede kemoterapeutika og decitabin blev set i SW48 og HT-29 cellelinier såvel som i de Colo-205-celler, som tidligere rapporteret [21]. Følsomheden af ​​CRC-celler i kombination med zebularin med kemoterapeutika var forskellige og afhængig cellelinie. For denne kombination, synergisme og tilsætning samt tidligere præsenteret antagonisme blev observeret [21]. Desuden reaktioner af CRC celler til zebularin og dets kombinationer var lidt svagere.