PLoS ONE: Overekspression af samhørighed Establishment Factor DSCC1 gennem E2F i kolorektal cancer

Abstrakt

Ctf18-replikation faktor C kompleks herunder Dscc1 (DNA-replikation og søsterkromatid samhørighed 1) er impliceret i søsterkromatid samhørighed, DNA-replikation, og genom stabilitet i

S. cerevisiae

C. elegans

. Vi har tidligere udført genekspression profilering i primære kolorektale cancerceller for at identificere nye molekylære mål til behandling af kolorektal cancer. Et træk ved cancer-associerede transkriptionel signatur åbenbaret fra denne indsats er det forhøjede udtryk for proto-onkogen

DSCC1

. Her har vi afhørt den molekylære basis for afvigende ekspression af human DSCC1 i colorektal cancer og dens evne til at fremme overlevelsen af ​​cancerceller. Kvantitativ PCR og immunohistokemiske analyser bekræftede, at ekspressionsniveauet af DSCC1 er forhøjet i 60-70% af colorektale tumorer sammenlignet med deres matchede noncancerous tyktarmsslimhinden. En

in silico

evaluering af formodede

DSCC1

promotorregion for konsensus DNA transkriptionelle regulatoriske elementer afslørede en potentiel rolle for E2F-familien af ​​DNA-bindende proteiner ved styring DSCC1 ekspression. RNAi-medieret reduktion af E2F1 reduceret ekspression af DSCC1 i kolorektale cancerceller. GAIN- og tab-of-funktion forsøg viste, at DSCC1 er involveret i levedygtigheden af ​​kræftceller i respons på genotoksiske stimuli. Vi viser, at E2F-afhængig udtryk for DSCC1 giver antiapoptotiske ejendomme i kolorektal cancer celler, og at dens undertrykkelse kan være en nyttig funktion til behandling af kolorektal cancer

Henvisning:. Yamaguchi K, Yamaguchi R, Takahashi N, Ikenoue T, Fujii T, Shinozaki M, et al. (2014) Overekspression af samhørighed Establishment Factor DSCC1 gennem E2F i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (1): e85750. doi: 10,1371 /journal.pone.0085750

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: 28 oktober, 2013; Accepteret: November 30, 2013; Udgivet: 17 januar 2014

Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Grant-in-Aid for Unge Forskere (# 23.790.126), MEXT /JSP’er, Japan til K. Yamaguchi, og Global COE Program “center for uddannelse og forskning for den avancerede genom-baserede medicin for personlig medicin og kontrol over hele verden infektionssygdomme “, MEXT /Japan Society for fremme af videnskab, Japan til Y. Furukawa. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de hyppigste humane neoplasmer i verden. I CRC celler, afbrydelse af systemer for genetisk eller epigenetisk integritet gør forskellige funktioner såsom kromosomal instabilitet (CIN), mikrosatellit instabilitet (MSI), og CpG ø methylator fænotype (CIMP). Et stort flertal af kolorektale tumorer udviser CIN, der omfatter grove genetiske ændringer såsom sletninger, amplifikationer, inversioner, omlejringer, gevinst eller tab af hele eller store dele af kromosomer, og translokationer [1]. En tidligere undersøgelse identificeret somatiske mutationer i fem gener, herunder

MRE11

,

ZW10

,

ZWILCH

,

ROD

, og

DING

blandt 100 humane CIN-kandidatgener, der delte lighed med gær eller flyver “ustabilitet” gener [2]. Deres data antydede, at mindst én af tre funktioner, herunder dobbelt-strenget pause reparation, kinetochore funktion, og kromatidtypen segregation, er nedsat hos CIN tumorer ved somatisk mutation. En anden undersøgelse søgt efter mutationer af 102 humane homologer af gær CIN gener i 132 kolorektale cancere. Derfor er de identificerede i alt 11 mutationer i fem gener, der omfattede fire forbundet med søsterkromatid samhørighed (

SMC1L1

,

CSPG6

,

NIPBL

, og

STAG3

, de homologe gær

SMC1

,

SMC3

,

SCC2

, og

SCC3

henholdsvis) [3]. Da søsterkromatid samhørighed er uundværlig for cellulære processer såsom kromosom adskillelse, homolog rekombinatoriske reparation, og regulering af transkription [4], genetiske ændringer i komponenter og tilsynsmyndigheder bør spille en afgørende rolle i CIN af kolorektale tumorer.

Vi har tidligere udført genekspression profil analyse i CRC [5], og identificeret, at DNA-replikation og søsterkromatid samhørighed 1 (

DSCC1

, også kendt som

DCC1

) blev ofte forhøjet i kolorektale tumorer sammenlignet med ikke-kræft tyktarmsslimhinden. Dcc1p, en homolog af DSCC1, blev først identificeret som et medlem af alterative replikation faktor C (RFC) kompleks i gær og fysisk associerer med Ctf8p og Ctf18p [4]. Deletion af komponenten, Ctf18p, Ctf8p eller Dcc1p, resulterede i alvorlige søsterkromatid samhørighedslande defekter, og øget følsomhed over for mikrotubuli depolymerisering lægemidler, antyder, at disse komponenter er vigtigt for opretholdelsen af ​​kromatin integritet [4]. Selvom Dcc1p ikke var afgørende for levedygtigheden af ​​gær, sletning af Dcc1p førte til syntetisk letalitet i kombination med mutation af andre søsterkromatid samhørighedslande proteiner [6]. Ud over den implikation i søsterkromatid samhørighed, CTF18-DSCC1-CTF8-RFC-kompleks spiller en afgørende rolle i DNA-replikation gennem interaktionen med enkeltstrengede og primet DNA som en loader prolifererende cellekerneantigen [7]. Endvidere genetiske netværk analyse af funktionelt beslægtede gener i gæren foreslog, at komponenterne i CTF18-DSCC1-CTF8-RFC-komplekset interagerer med MAD /BUB spindel checkpoint pathway, den RAD51 DNA-reparationsvej for dobbelt-strenget pauser, den rad9 DNA beskadigelse checkpoint, og TOF1 /MRC DNA-replikation checkpoint pathway [8], [9]. Det fund, at mutation i CTF18-RFC øget triplet repeat ustabilitet bekræftede rolle dette kompleks i DNA-replikation checkpoint [10]. Disse data viste, at DSCC1 spiller en vigtig rolle i replikation, spindel checkpoint og DNA-reparation, der fik os til at undersøge, om dereguleret udtryk for DSCC1 er involveret i human colorectal tumorigenese.

Her viser vi for første gang, at DSCC1 er ofte opreguleret i CRC mindste delvist gennem den forstærkede transkriptionel aktivering med E2F. Vi afslører også, at forhøjede ekspression af DSCC1 giver kemoresistens i CRC-celler ved at tilvejebringe tumorceller med anti-apoptotiske egenskaber. Disse resultater vil bidrage til en bedre forståelse af CRC, og tjene som udgangspunkt for udvikling af nye strategier for diagnose og behandling af CRC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Dette projekt blev godkendt af den etiske komité af Institut for Medicinsk Videnskab, University of Tokyo (IMSUT-IRB, 21-14-0806). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter i denne undersøgelse. Alle kolorektale cancer væv og tilsvarende ikke-kræft væv blev opnået fra kirurgiske prøver af patienter, som gennemgik kirurgi.

Cell kultur

Menneskelig CRC cellelinjer HCT116, HCT-15, SW480, DLD-1 , LoVo, Caco-2, LS174T, HT-29, og RKO blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle celler blev dyrket i passende medier suppleret med FBS (Life Technologies, Carlsbad, CA) og antibiotisk /antimykotisk opløsning (Sigma, St. Louis, MO).

Fremstilling af plasmider, der udtrykker DSCC1 og E2F’ere

hele den kodende region af

DSCC1

cDNA (GenBank No. NM_024094) blev amplificeret ved RT-PCR under anvendelse af et sæt primere; forward primer: 5′-CCGGAATTCATGAAGAGGACCCGCGAC-3 ‘og revers primer: 5′-CGGCTCGAGAGAAATGGGTCTTCTCGAATTAT-3’ (understregede nukleotider angiver stederne for restriktionsenzymer anerkendelse). PCR produkterne blev klonet ind i

Eco

RI og

Xho

sites i pcDNA3.1 /myc-His. Vi har desuden genereret plasmider, der udtrykker HA-mærkede DSCC1 (pCAGGS-DSCC1). Konstruktionerne pcDNA3-HA-E2F’ere blev venligst stillet til rådighed af Dr. JR Nevins (Duke University, Durham, NC).

Kvantitativ PCR og genkopitallet analyse

Real-time PCR blev udført ved hjælp af LightCycler 480 systemet (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Genomiske DNA’er blev ekstraheret fra CRC cellelinier til kopital analyse. Kvantitativ PCR blev udført på ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System, ved anvendelse FAM-mærkede prober (5′-TCAGGTTTCCTACCTTCCGGCTGCTT-3 ‘) og et sæt primere (fremadrettede: 5′-GGCGCGCTTTCAAACG-3′, revers: 5’-GCGGGCAAGAAAGAAGTTCC-3 ‘) til

DSCC1

, og TaqMan Copy Number reference Analyser RNase P som en kvantitativ kontrol (Life Technologies). Kopien Antallet af

DSCC1

i kræftceller blev beregnet i sammenligning med genomisk DNA fra raske frivillige ved hjælp CopyCaller Software.

Subcellulær fraktionering og immunoblotting

Celler blev lyseret i radioimmunudfældning assaypuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholat, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS) suppleret med en protease-cocktail sæt III (Calbiochem, San Diego, CA). Nukleare ekstrakter blev fremstillet under anvendelse af kerneekstrakt Kit (Active Motif, Carlsbad, CA). Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og immunblot-analyse blev udført under anvendelse af de angivne antistoffer. Peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-muse eller anti-kanin IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) tjente som det sekundære antistof til ECL Detection System (GE Healthcare).

Immunfarvning

Primært antistoffer anvendt til immunhistokemisk og immuncytokemisk farvning var anti-DSCC1 (B01P, Abnova, Taipei, Taiwan) og anti-Myc (Sigma). Specificiteten af ​​DSCC1 antistof blev bekræftet af blokering med DSCC1 rekombinant protein (data ikke vist). Disse forsøg blev udført som beskrevet tidligere [11].

Induktion af apoptose og flowcytometri

For at undersøge induktion af apoptose, celler blev behandlet med camptothecin (Wako, Osaka, Japan), doxorubicin (LC Laboratories, Woburn, MA), MG132 (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), eller udsættes for y-bestråling (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ontario, Canada). Ekspression af spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og spaltes caspase-3 blev detekteret ved Western blot-analyse under anvendelse af anti-spaltet PARP (9541) og anti-caspase-3-antistoffer (9662), henholdsvis (Cell Signaling Technology, Danvers , MA). Vurdering af apoptose blev også udført ved annexin V og PI double-farvning under anvendelse af Alexa Fluor 488 Annexin V /Dead Cell Apoptose Kit (Life Technologies). Kort fortalt blev dyrkede celler behandlet med vehikel eller camptothecin i 24 timer. Cellerne blev farvet med Annexin V og PI, og efterfølgende analyseret på en FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved hjælp FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR).

Cell levedygtighed assay

plasmider, der udtrykker korte hårnål RNA (shRNA) under anvendelse U6 promotoren (psiU6BX3.0) blev fremstillet som tidligere [12] beskrevne. Plasmider, der udtrykker DSCC1 shRNA (psiU6-shDSCC1) blev konstrueret ved kloning af dobbeltstrengede oligonukleotider ind i

Bbs

sites i den psiU6BX3.0 vektor. To målsekvenser, 5′-GUGGACAGAAGAAGAUAUU-3 ‘(shDSCC1 # 1) og 5′-GCAAACCAUAGGUGCAUUA-3′ (shDSCC1 # 2), blev anvendt til DSCC1 shRNAs. Som negative kontroller vi udarbejdet et plasmid målrettet forbedret grønt fluorescerende protein (psiU6-shEGFP), og de er rettet mod scrambled sekvenser af shDSCC1 # 1 (5’-AAAUUGCGAAGGUGAUGAA-3 ‘; psiU6-shDSCC1 # 1scr) eller shDSCC1 # 2 (5’ AACACGUUAAUAACCGGUG-3 ‘; psiU6-shDSCC1 # 2scr). Celle levedygtighed assays blev udført som beskrevet tidligere under anvendelse HCT116, SW480, og RKO-celler transficeret med plasmider, der udtrykker shEGFP, shDSCC1, eller scramble shDSCC1 [11]. For at undersøge virkningen af ​​DSCC1 overekspression på celleproliferation, transficerede vi SW480 og HCT116 celler med pCAGGS-DSCC1 og etableret to eller tre kloner stabilt udtrykker exogent DSCC1. Kontrol SW480 og HCT116-celler transficeret med tom vektor blev også etableret som mock celler.

promoter reporter assays og steddirigeret mutagenese

Luciferase reporter plasmider indeholdende

DSCC1

promotoren var fremstillet ved kloning af 5′-flankerende region i

DSCC1

ind i

Mlu

i og

Bgl Salg II restriktionsenzymsteder af pGL3-Basic Vector (Promega, Madison, WI ). Et DNA fragment på ca. 1,0 kb i 5′-flankerende region i

DSCC1

blev amplificeret ved PCR under anvendelse af genomisk DNA fra raske frivillige og et sæt primere (fremadrettede: 5′-CGACGCGTATGTCTGCTCAGATCCTTTGAAT-3 ‘, revers : 5’-GAAGATCTCGCCGGGTCTAGGAGTCC-3 ‘). Mutante plasmider indeholdende substitutioner i formodede E2F-bindingssteder i

DSCC1

promotoren blev genereret ved stedorienteret mutagenese under anvendelse af QuikChange II XL mutagenese Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Celler podet i plader med 6 brønde blev transficeret med reporter plasmider sammen med pRL-TK (Promega) under anvendelse af FuGENE 6 reagens. Celler blev høstet 24 timer efter transfektion, og reporter-aktiviteter blev målt ved dobbelt luciferase-systemet (TOYO B-Net, Tokyo, Japan). For knockdown af E2F1-ekspression, blev syntetiske E2F1 siRNA indkøbt fra Sigma (sense: 5′-GGGAGAAGUCACGCUAUGA-3 ‘, antisense: 5′-AUAGCGUGACUUCUCCCCC-3’).

chromatin immunpræcipitationsassay

at undersøge interaktionen af ​​E2F1 med

DSCC1

promotorregion, en chromatin immunoprecipitation (chip) assay blev udført ifølge Agilent Mammalian chIP protokol med små modifikationer. HCT116 celler blev tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og standset med 0,4 M glycin. Kromatin ekstrakter blev klippet af micrococcal nuclease fordøjelse og efterfølgende protein-DNA-komplekser blev immunpræcipiteret med 3 ug anti-E2F1 polyklonalt antistof (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) bundet til anti-kanin IgG-coatede Dynabeads ( Life Technologies). Ikke-immunt kanin-IgG (Santa Cruz Biotechnology) blev anvendt som en negativ kontrol. De udfældede DNA blev udsat for kvantitativ PCR-analyse med en primer sæt (fremad (-26) 5′-CCGGAAACACGCCCATGGC-3 ‘og omvendt (127) 5′-GGGTCCTCTTCATCGCAGC-3’) til at forstærke den

DSCC1

promotorregion. Assayets specificitet blev bestemt ved amplifikation af en distal opstrøms region i

DSCC1

promotor med følgende primere: forward (-1279) 5′-AGTTGTAGGGAATGTTTCCCATT-3 ‘og revers (-1111) 5’ GATTGGTTCATGTGACCTACTTC-3 ‘. Derudover amplifikationer af celledelingscyklussen 2 (

CDC2 Salg) promotor og glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase (

GAPDH

) promotor blev anvendt til positive og negative kontroller, henholdsvis (primere:

CDC2

frem 5′-CGCCCTTTCCTCTTTCTTTC-3 ‘,

CDC2

omvendt 5′-ATCGGGTAGCCCGTAGACTT-3′,

GAPDH

frem 5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3 ‘,

GAPDH

omvendt 5′-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3 ‘).

Resultater

Angivelse af DSCC1 ofte forhøjet i CRC

for at identificere nye mål-molekyler til behandling og /eller diagnostiske biomarkører for CRC, vi tidligere udførte udtryk profil analyse af kolorektale tumorer og deres matchede normale kolorektale væv ved cDNA microarray [5]. Blandt generne dereguleret i kolorektale tumorer, ekspression af DNA-replikation og søsterkromatid samhørighed 1 (

DSCC1

) blev øget mere end to gange i 5 af 7 tarmkræft sammenlignet med tilsvarende ikke-kræft colon mucosa (figur 1A ). Efterfølgende realtids-PCR-analyse under anvendelse yderligere 20 CRC væv og den tilsvarende ikke-kræft mucosa viste, at

DSCC1

ekspression blev forhøjet mere end to gange i 12 af de 20 tumorer (figur 1A). En immunhistokemisk farvning viste akkumuleret DSCC1 protein i 29 af 40 CRC væv sammenlignet med tilsvarende tilstødende ikke-kræft kolonmucosa (figur 1B). Selvom vi søgte efter korrelationer mellem dets ekspression og klinisk-patologiske faktorer, herunder alder og køn patienter, placering, størrelse og histologiske data for de tumorer, såsom dybde af invasion, lymfeknudeinvolvering og vaskulær eller lymfatisk invasion fartøj, ingen af ​​faktorerne var signifikant associeret med DSCC1 ekspression (tabel S1). Derudover western blot analyse ved anvendelse CRC cellelinier afslørede, at DSCC1 rigeligt blev udtrykt i HCT116, HT-29, og DLD-1 celler, og at det blev udtrykt i lave niveauer i SW480, SW620, og Caco-2 celler (figur 1C) . Selvom vi sammenlignet stabilitet DSCC1 protein i HCT116 (DSCC1-høj) og SW480 (DSCC1-lav) celler ved cycloheximid chase assay, DSCC1 var relativt stabil i både HCT116 og SW480 celler. Behandling med MG132, en proteasominhibitor også forstærkede ikke DSCC1 ekspression (fig S1A). Disse data antydede, at protein stabilitet er ikke sandsynligt, at spille en vigtig rolle i den forhøjede udtryk for DSCC1 i kræftceller.

(A) Relativ udtryk forhold mellem

DSCC1

i syv kolorektal cancer væv til deres tilsvarende normale væv i vores microarray data (øverste panel). Relative ekspressionsniveauer af

DSCC1

i yderligere 20 kolorektale tumorer og den tilsvarende ikke-kræft slimhinde blev analyseret ved kvantitativ PCR (nederste panel). Mængde af

DSCC1

blev normaliseret til

HPRT1

udtryk. Y-aksen angiver forholdet mellem middelværdien af ​​

DSCC1

ekspression i tumoren at i deres tilsvarende normale væv. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD fra tredobbelte eksperimenter. (B) repræsentativt billede af immunhistokemisk farvning af DSCC1 i en human coloncancer væv indeholdende cancerceller og tilstødende normale slimhinde. (C) Ekspression af DSCC1 i CRC-cellelinier blev detekteret ved western blotting under anvendelse af anti-DSCC1 antistof. (D) HCT116-celler blev undersøgt med anti-DSCC1 antistof efterfulgt af FITC-konjugeret anti-muse-IgG sekundært antistof (grøn). Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). (E) HCT116, RKO, og DLD-1-celler blev separeret i den cytoplasmiske (CF) og nukleare fraktioner (NF), og de cytoplasmiske og nukleare proteiner blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting. Renheden af ​​fraktionerne blev bestemt ved tilstedeværelsen af ​​β-tubulin (cytoplasmatisk markør) og lamin B (nuklear markør). (F) Kopi nummer analyse af

DSCC1

i otte CRC-cellelinjer og HEK293 celler. Relativ kopi antal

DSCC1

gen blev bestemt ved kvantitativ PCR ved hjælp af

RPPH1

som en endogen reference. Kopien nummer blev beregnet ved at dividere deres PCR-produkter fra de perifere leukocytter fra raske frivillige, og efterfølgende gange med 2.

immunhistokemisk analyse uventet afbildet akkumuleret DSCC1 i cytoplasmaet og kernen i DSCC1-positive kræft celler (figur 1 B), skønt Dscc1 blev rapporteret at spille en rolle i oprettelsen af ​​samhørighed under DNA replikation i gær. For at belyse sin subcellulære lokalisering, vi udført immuncytokemisk farvning af endogen DSCC1 i HCT116 celler. Overensstemmelse med immunhistokemisk farvning af cancer væv blev DSCC1 protein lokaliseret både i cytoplasmaet og kernen (figur 1D og S1B). Endvidere western blot analyse ved anvendelse cytoplasmatiske og nukleare fraktioner ekstraheret fra HCT116, RKO, og DLD-1-celler (figur 1E) og celler, der udtrykker Myc-mærket DSCC1 bekræftede sin subcellulære lokalisering i cytoplasmaet og kernen (figur S1c og S1D) .

Kopier nummer analyse af

DSCC1

for at løse, om genamplifikation er involveret i DSCC1 overekspression, gennemførte vi kopiantals analyse af kvantitativ PCR hjælp RNase P som kontrol . Sammenlignet med perifere leukocytter fra raske frivillige, blev kopien antal

DSCC1

ikke steget i nogen testede CRC cellelinier (figur 1F). Det er værd at bemærke, at et fald i kopiantal blev observeret i HT-29-celler, der rigeligt udtrykt DSCC1 (figur 1C). Vi yderligere analyseret kopi nummer ændring af

DSCC1

i tyktarm og endetarm adenocarcinom (The Cancer Genome Atlas Kolorektal Cancer projekt) ved hjælp af cBioPortal database (https://www.cbioportal.org/public-portal/). Som et resultat blev fundet formodede kopiantal ændringer i 7 ud af 257 colorektale adenocarcinomer (2,7%), hvilket antyder, at amplifikation af

DSCC1

ikke spiller en stor rolle i den forstærkede DSCC1 ekspression.

regulering af

DSCC1

promoter aktivitet

for at løse den mekanisme af forhøjet DSCC1 udtryk i CRC, undersøgte vi promoter aktivitet

DSCC1

i HCT116 celler. Reporter assay under anvendelse af plasmider indeholdende en 5′-flankerende region i

DSCC1

(pDSCC1-1023 /+ 109) viste, at denne region har en betydelig promotoraktivitet (data ikke vist). I regionen, vi identificeret en formodet E2F-bindende motiv, EBS1 (-3 /+ 5; 5′-CTTGGCGC-3 ‘) under anvendelse af Jaspar (https://jaspar.genereg.net/) og TFSEARCH databaser (http: //www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (figur 2A). Denne formodede bindingssted delt stor lighed med konsensus motiv for E2F, TTTSSCGC med S = G eller C. Da E2F transkriptionsfaktorer ofte dereguleret i en række tumorer, testede vi virkningen af ​​E2F’ere på

DSCC1

promotoraktivitet. Selvom E2F1, E2F2, E2F3 og E2F4 øgede promoter aktivitet, har E2F6 ikke ændre aktiviteten. E2F1, som viste den stærkeste induktion blandt de fire medlemmer, augmented aktiviteten på en dosis-afhængig måde (figur 2B og S2A). Denne forbedring blev også observeret i andre cellelinjer, herunder LoVo, HeLa, og HEK293 (data ikke vist). For at undersøge mulig inddragelse af EBS1 i ekstraudstyr, vi målte reporter aktivitet ved hjælp af konstruktioner pDSCC1-10 /+ 109 og + 10 /+ 109 i nærvær eller fravær af E2F1 (Figur 2C). Basale reporter aktiviteter af disse reporterplasmider var ikke signifikant forskellig i fravær af E2F1 plasmider. Sletning af EBS1 (pDSCC1 + 10 /+ 109) faldt dramatisk E2F1-induceret reporter aktivitet (fra 20,4 gange til 3,2 gange). Uventet forøgelse af reporter-aktivitet med E2F1 blev stadig observeret i + 10 /+ 109. Yderligere deletion op til +70 af promotoren (pDSCC1 + 70 /+ 109) fuldstændigt formindsket E2F1-induceret reporteraktivitet (figur 2C). Efter aftale med dette resultat, fandt vi to ekstra formodede EBSS, EBS2 (+ 31 /+ 38; 5′-CTTCCGGC-3 ‘) og EBS3 (+ 57 /+ 64; 5′-TTGCCCGC-3’) i området mellem 10 og 70. For at løse ansvar EBS1, EBS2, og EBS3 for induktion, vi udarbejdet fire mutant reporterkonstruktioner (figur 2D) ved at erstatte den GC-rige segment i E2F konsensus motiver, TTTSSCGC (S = C eller G) eller STTTS, fordi disse kerne motiver var angiveligt afgørende for E2F binding [13], [14]. Sammenlignet med vildtype pDSCC1-10 /+ 109 (14,8-gange induktion), begge typer EBS1-mutant plasmider (pDSCC1-10 /+ 109 mut1, og Mut1 ‘) bemærkelsesværdigt faldt reporter aktivitet som respons på E2F1 (5,2-fold og 5,8 gange, respektivt). Mutationer i både EBS1 og EBS2 (pDSCC1-10 /+ 109 mut1 + 2) faldt yderligere i E2F1-induceret aktivitet (3,7 gange). Mutant reporter plasmid indeholdende substitutioner i de tre elementer (pDSCC1-10 /+ 109 mut1 + 2 + 3) næsten mindsket enhancement (1,7 gange), hvilket tyder på, at de tre E2F bindende motiver er ansvarlige for reguleringen af ​​

DSCC1

promotoraktivitet.

(A) Nukleotidsekvens af -10 til +90 bp region human

DSCC1

. Tre formodede E2F bindingsmotiver er understreget. (B) pDSCC1-1023 /+ 109 blev transient transficeret med pRL-TK og pcDNA3 HA-E2F’ere ind SW480, eller med pRL-TK og pcDNA3 HA-E2F1 (0,01-1 ug) i SW480 og HCT116-celler. (C) pDSCC1-10 /+ 109 eller de kortere promotorkonstruktioner blev transficeret med E2F1 eller den tomme vektor i SW480-celler. (D) Stedrettet mutationsanalyse af formodede E2F bindingssteder i den proximale promotorregion. pDSCC1-10 /+ 109 eller dets mutante kloner blev transficeret med E2F1 eller den tomme vektor i SW480-celler. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. Promotoraktivitet angiver den relative luciferase enhed eller gange induktion over tomme vektor transfektant. (E) kromatin immunpræcipitation blev udført under anvendelse af anti-E2F1 antistof. De udfældede DNA’er blev underkastet amplifikation af

DSCC1

promotoren ved kvantitativ PCR. For at konstatere den specifikke binding til EBS, amplifikation af et distalt opstrøms region i

DSCC1

promotoren blev anvendt til normalisering. En signifikant forskel blev bestemt ved t-test. (F) HCT116-celler blev transficeret med kontrol eller E2F1 siRNA (25 nM) i 48 timer.

DSCC1

udtryk blev påvist ved kvantitativ PCR. En signifikant forskel blev bestemt ved t-test. (G) SW480-celler blev transficeret med kontrol eller E2F1 siRNA (25 nM) efterfulgt 8 timer senere ved transfektion med reporterplasmidet (pDSCC1-10 /+ 109) og E2F1 ekspressionsvektor eller tom vektor. Efter 48 timer blev luciferaseaktivitet målt. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg.

Interaktion af E2F1 med

DSCC1

promotor omegn

For at afgøre om E2F1 bindes til promotor-regionen i

DSCC1

udførte vi kvantitativ chip assay under anvendelse af anti-E2F1-antistof og et sæt primere omfattende de tre formodede E2F-bindende elementer. Promotoren af ​​celledelingscyklussen 2-genet (

CDC2

), en velkendt E2F1 target, blev beriget 13,4 gange med den immunopræcipiterede DNA (fig S2B). Forventeligt,

DSCC1

promotorregion blev beriget med op til 15,4 gange i DNA’et, hvilket tyder på en vekselvirkning mellem

DSCC1

promotorregion med E2F1 (Figur 2E).

for at bekræfte inddragelse af E2F1 i regulering DSCC1 udtryk, vi undersøgte lyddæmpende effekt af E2F1 på DSCC1 udtryk. Real-time PCR og western blot-analyser viste, at udtømning af E2F1 faldt DSCC1 ekspression (figur 2F og S2C). RNAi-medieret knockdown af E2F1-aktivitet blev bekræftet ved reporter assay viser signifikant reduktion af

DSCC1

promotoraktivitet fra 10,4 (Ctrl siRNA) til 4,7 gange ved E2F1 siRNA i SW480-celler (Figur 2G). Disse resultater antydede, at

DSCC1

transaktivering er, i det mindste delvist, reguleret af E2F1 i CRC gennem dets interaktion med

DSCC1

promotorregion, og at de tre EBSS spille en vigtig rolle i transkriptionel aktivering. For yderligere at undersøge, om DSCC1 udtryk moduleres ved E2F transskriptionel aktivitet, vi sammenlignet den relative ekspression af

DSCC1

med

CDK1

(

CDC2

), som udlæsning af E2F transkriptionel aktivitet , ved hjælp af to uafhængige datasæt (E-MEXP-3715 og geod-23878) i Gene Expression Atlas database (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). I datasæt,

DSCC1

CDK1

var signifikant opreguleret i kolorektale tumorer sammenlignet med normale colon væv (Figur 3). Især begge datasæt beregnet høje værdier af korrelationskoefficienten (E-MEXP-3715,

r

= 0,912 og geod-23878,

r

= 0,864) mellem

DSCC1

og

CDK1

, støtter det synspunkt, at

DSCC1

er en anden nedstrøms gen reguleret af E2F.

Denne forening blev vist ved to sæt microarray data, E-MEXP-3715 (A) og geod-23878 (B), i Gene Expression Atlas database (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). Den Pearsons korrelationskoefficient (r) mellem

DSCC1

CDK1

udtryk værdier blev derefter beregnet til at vurdere deres sammenhæng.

Effekt af DSCC1 om spredning af CRC celler

for at løse den rolle, forhøjet udtryk i CRC celler, undersøgte vi, om DSCC1 er involveret i spredning af kræftceller. Vi udførte celleviabilitetstest anvendelse af plasmider, der udtrykker både DSCC1 shRNA (shDSCC1 # 1, eller shDSCC1 # 2) og neomycinresistensgenet. Plasmider indeholdende scrambled sekvens af DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1scr og shDSCC1 # 2scr) og plasmid indeholdende EGFP shRNA (shEGFP) tjente som kontroller. Transfektion med disse DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1, eller shDSCC1 # 2) reducerede udtryk for DSCC1, hvorimod transfektion med kontroller (shEGFP, shDSCC1 # 1scr og shDSCC1 # 2scr) havde ingen effekt (figur 4A). HCT116-celler blev dyrket i medier indeholdende passende koncentration af G418 og cellelevedygtigheden blev målt. Vi fandt, at antallet af levedygtige celler transficeret med DSCC1 # 1 eller DSCC1 # 2 shRNA blev signifikant reduceret sammenlignet med dem transficeret med EGFP, DSCC1 # 1scr eller DSCC1 # 2scr shRNA, hvilket indikerer, at DSCC1 spiller en rolle i levedygtigheden af ​​cancerceller (figur 4B). Konsekvent data blev opnået i SW480 og RKO-celler (Figur S3A). Disse resultater blev bekræftet i gentagne forsøg. Salg

(A) HCT116-celler blev transficeret med kontrol (Mock og EGFP) og DSCC1 shRNAs i 48 timer under anvendelse Nucleofector kit, og western blot-analyse blev udført. Ekspression af β-actin tjente som kontrol. (B) Levedygtighed af celler transficeret med shRNAs blev målt ved WST-8 assay. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD fra tre uafhængige transfektioner. P-værdier blev beregnet med Dunnetts test for multiple sammenligninger med shEGFP-transficerede celler. (C) Overekspression af DSCC1 i SW480-celler blev bekræftet ved western blotting under anvendelse af anti-DSCC1 antistof. Tilsvarende antal tre mock og tre DSCC1 celler blev udpladet i plader med 96 brønde, og celleproliferationsassays blev udført ved de angivne tidspunkter. Dataene repræsenterer middelværdi ± SD fra fem eksperimenter. En væsentlig forskel mellem mock og DSCC1 celler blev bestemt ved to-vejs gentagne målinger ANOVA.

Derudover har vi etableret SW480 celler, der konstitutivt udtrykker eksogene DSCC1, og sammenlignet deres proliferation med kontrol-celler transficeret med mock vektor (figur 4C). I overensstemmelse med DSCC1-knockdown data, celler, der udtrykker eksogene DSCC1 viste augmented celledeling i forhold til forældrenes SW480 celler eller kontrol celler (

s

= 2,2 × 10

-5). Ligeledes eksogen DSCC1-udtryk forbedret spredning af HCT116 celler (figur S3B).

Rolle DSCC1 i induktion af apoptose

Siden E2F1 tillægges modstandsdygtighed over for genotoksiske fornærmelser [15], [16 ], [17], vi yderligere undersøgt, om forhøjet DSCC1 ekspression spiller en rolle i følsomheden af ​​cancerceller til genotoksiske stimuli. SW480-celler-udtrykker eksogent DSCC1 (SW480-DSCC1 # 1, # 3 og # 8) blev udsat for y-bestråling, og induktion af apoptose blev analyseret ved immunoblotting med anti-spaltet PARP-antistof.