PLoS ONE: Den rolle Hypoxi-inducerbare Factor 1α i Bestemmelse af egenskaber kastrere-Resistant Prostate Cancers

Abstrakt

Baggrund

kastrere-resistent prostatacancer (CRPC) er en dødelig tilstand hos patienter i androgen deprivation terapi for prostatacancer (PC). Trods talrige undersøgelser, som viser ekspressionen af ​​HIF1α protein under normoxi i PC cellelinier, rolle denne normoxisk HIF1α ekspression i kemo-resistens og migration er ikke tidligere blevet undersøgt. Da ingen metode er i øjeblikket tilgængelig til at bestemme, hvilke tumorer vil udvikle sig til CRPC blev rolle HIF1α i PC og dens potentiale til at forudsige udviklingen af ​​CRPC også undersøgt.

Metoder

Effekten af HIF1α protein knockdown på kemo-modstand og migrering af PC3 celler blev vurderet ved celletælling og Transwell analyser, hhv. Oversættelse effektivitet HIF1α mRNA blev bestemt i PC celler under anvendelse af en HIF1α 5’UTR-luciferase-konstruktion. Kliniske resultater blev korreleret efter farvning af 100 prostata tumorer for HIF1α udtryk.

Resultater

CRPC-lignende cellelinjer (PC3 og DU145) udtrykkes mere HIF1α protein end en androgen følsomme cellelinie ( LNCaP). Migration sats og kemo-modstanden var højere i PC3 celler og begge blev reduceret ved HIF1α udtryk blev reduceret. Øget oversættelse af HIF1α mRNA kan være ansvarlig for HIF1α overekspression i PC3 celler. Patienter, hvis tumorer udtrykte HIF1α havde signifikant nedsat metastase overlevelse og de patienter, der var på androgen-deprivation terapi var faldet CRPC overlevelse på Kaplan-Meier analyse. På multivariat analyse var HIF1α en selvstændig risikofaktor for progression til metastatisk PC (Hazard ratio (HR) 9,8, p = 0,017) og udvikling af CRPC (HR 10,0, p = 0,021) hos patienter i androgen-deprivation terapi. Især de tumorer, der ikke udtrykker HIF1α ikke metastaserer eller udvikle CRPC.

Konklusioner

HIF1α kan bidrage til metastase og kemo-modstand CRPC og målrettet reduktion af HIF1α kan øge lydhørhed af CRPCs til kemoterapi. Ekspression af HIF1α kan være et nyttigt screeningsværktøj til udvikling af CRPC

Henvisning:. Ranasinghe WKB, Xiao L, Kovac S, Chang M, Michiels C, Bolton D, et al. (2013) Den rolle Hypoxi-inducerbare Factor 1α i Bestemmelse af egenskaber kastrere-Resistant prostatakræft. PLoS ONE 8 (1): e54251. doi: 10,1371 /journal.pone.0054251

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: August 22, 2012; Accepteret: December 10, 2012; Udgivet: januar 16, 2013 |

Copyright: © 2013 Ranasinghe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud 454322 (GSB), 566.555 (GSB, AS) og 628.390 (AS, OP, GSB) fra National Health og Medical Research Council of Australia. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC) er den anden mest almindelige kræftform hos mænd verden over og fortsætter med at indføre en betydelig sygdomsbyrde og en voksende verdensomspændende sundhedspleje problem. Imidlertid er vores forståelse af de mekanismer, der bidrager til udviklingen af ​​PC stadig begrænset [1]. Androgener og androgen receptor (AR) er vigtige regulatorer af stimulering og overlevelse af prostatacancerceller. Androgen deprivationsbehandling (ADT) er grundlaget for behandling for metastatisk og lokalt fremskreden prostatakræft. Men ADT sidst undlader at opretholde prostatakræft undertrykkelse i et flertal af mænd med denne betingelse.

kastrere-resistent prostatacancer (CRPC) er en dødelig form for PC, der kan udvikle og metastaserer hurtigt. På udvikling af CRPC, vil mere end 84% af patienterne har metastaser [2]. Få biomarkører for forudsigelse af CRPC er blevet beskrevet [3], [4], og i øjeblikket er der ingen universel enighed om at identificere, hvilke patienter med PC går videre til CRPC. Desuden de mekanismer resulterer i udvikling og progression af CRPC forbliver dårligt forstået dels på grund af den begrænsede tilgængelighed af cellelinier, som nøje modellere CRPC. De to udbredte PC cellelinjer PC3 og DU145 betragtes ikke som fuldt repræsentative for CRPC celler, da de ikke blev isoleret fra prostatakræft, der havde fået tilbagefald efter androgen deprivation terapi, og da de udtrykker lidt [5], hvis nogen AR [6], henviser AR er ofte overudtrykkes i CRPC tumorer. Men som PC3 og DU145 celler vise nogle af de grundlæggende egenskaber for en CRPC tumor herunder høj migration (metastaser), androgen-uafhængighed og kemo-resistens ligner den CRPC LNCaP c4-2 [7], og også dele lignende molekylære egenskaber , herunder udtømning /mutation af mitokondrie-DNA, som er blevet korreleret med invasivitet og medikamentresistens [8], er disse to cellelinier ofte benævnt CRPC celler [9], [10], [11].

Hypoxi er en nedsættelse af den normale koncentration af væv oxygen, der forekommer i mange sygdomme, herunder cancer. En hypoxisk mikromiljø i prostata er blevet postuleret at være ansvarlig for at fremme sekundære genetiske ændringer og angiogene stimulering, hvilket fører til en mere aggressiv celle fænotype og ondartet progression [12]. Cellers evne til at tilpasse sig hypoxi er afhængig af et sæt af hypoxi-inducerbare transkriptionsfaktorer (HIFs), der består af en regulerende alfa (HIF1α) og en konstitutiv beta subunit (HIF1β). HIFs binder til kernen sekvensen 5′-RCGTG-3 ‘i target promotorer og inducere mere end 200 funktionelt forskellige gener involveret i celleoverlevelse [13]. Syntesen af ​​HIF1α sker via oxygen-uafhængige mekanismer, men dens nedbrydning er oxygen-afhængig og involverer prolyl hydroxylase, asparaginyl hydroxylase, Von Hippel-Lindau-proteinet og proteasomalaktivitet systemet [13].

Selvom HIF1α er overudtrykt i en række humane cancere [14], [15], rolle HIF1α i cancer progression er uklar. Høje koncentrationer af HIF1α i nyre- og brystcancer cellelinjer blev vist sig at øge kræftcellen overlevelse, mens der i æggestokkene kræft høj HIF koncentrationer bidraget til øget apoptose [13]. Dai og kolleger rapporterede, at akut hypoksi øget HIF1α udtryk og motilitet og invasive kapacitet på tre PC cellelinjer [16]. Trods talrige undersøgelser, der viser tilstedeværelsen af ​​HIF1α ekspression i normoxi, og en rapport, HIF1α signalering er opreguleret i normoxiske kastrationsresistent LNCaP c4-2 celler sammenlignet med de parentale LNCaP-celler [17], rolle normoxisk HIF1α udtryk er ikke veldokumenteret, og derfor dannede grundlaget for vores aktuelle undersøgelse.

på samme måde, på trods af høj HIF1α udtryk i pc-væv [14], [18], [19], [20], [21], [ ,,,0],22], [23], [24], dens forbindelse med prognosen er usikkert [25], [24], [26], [27]. konsensus er, at HIF1α er opreguleret i prostata tumorer [28], [24] og er en potent tumorinduceret skjold mod oxidativt stress eller ødelæggelse af androgen deprivation, kemoterapi eller strålebehandling cytotoksicitet [29]. I øjeblikket ingen studier har rapporteret relationerne mellem HIF1α udtryk og udvikling af CRPC. Derfor vi havde til formål at undersøge den rolle HIF1α i reguleringen af ​​CRPC og analysere sit potentiale som en biomarkør til forudsigelse af udviklingen af ​​CRPC.

Materialer og metoder

In Vitro Studies

Cell kultur.

De tre humane prostata cancer cellelinier (PC3, DU145 og LNCaP), der anvendes i denne undersøgelse var generøst doneret af A /Prof. Ian Davis, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, og var blevet købt fra ATCC i 2009. Cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Mulgrave, Australien) suppleret med 8% FBS og 100 U /ml penicillin. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 95% luft og 5% CO

2. Hypoxi-behandlede celler blev dyrket på samme måde som den kontrol, bortset fra at gasfasen indeholdt 94% kvælstof (N

2), 5% CO

2 og 1% O

2, med iltkoncentrationer overvåges og justeres automatisk af et elektronisk oxygen controller (ProOx Model 110, Biospherix, Redfield, NY).

Western blot-analyse.

Celler blev vasket en gang med iskold phosphatpufret saltvand ( PBS) og lyseret med 0,1-0,2 ml forkogt natriumdodecylsulfat (SDS) lysisbuffer. Proteiner blev separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese, og overført til en Hybond-C Extra nitrocellulosemembran (GE Healthcare, Rydalmere, Australien). HIF1α protein blev påvist med et monoklonalt muse-anti-humant HIF1α antistof (1:1000, BD Biosciences, North Ryde, Australien) efterfulgt af et sekundært ged anti-mus-peberrodsperoxidase-konjugeret antistof (1:5000, Bio-Rad). Som loading kontrol blev blots inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret kanin anti-GAPDH-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Bånd blev visualiseret i en LAS 3000 Billede Reader (Fujifilm, Brookvale, Australien), med en ECL Advance vestlige Blotting Detection Kit (GE Healthcare). Densitometrisk analyse af proteinbånd blev udført med MultiGauge software (Fujifilm).

Proliferationsassay.

Til måling af basale niveauer af proliferation, 2 × 10

5-celler blev dyrket i en 6 godt petriskål i dyrkningsmedium suppleret med FBS. Celler blev vasket med PBS ved 24 timer og dyrket i yderligere 48 timer i serumfrit medium. De celler, der skulle modtage behandling blev udpladet som ovenfor, og medierne blev fjernet efter 24 timer, og suppleret med FBS-fri medier før behandling med hydrogenperoxid (H

2O

2), cobaltchlorid, 5-fluoruracil (5-FU) eller hypoxi (1% O

2) i 48 timer. Celler blev talt under anvendelse af en automatiseret celletæller (Countess®, Invitrogen).

Migration /invasion assays (Transwell assay)

prostatacancerceller blev podet ved en densitet på 2 x 10

5-celler i 250 pi per brønd serumfrit dyrkningsmedium på den øvre kammer af polyethylenterephthalat filtermembraner overtrukket med fibronectin. De øvre kamre blev indsat i cellekultur brønde og 750 pi serumfrit dyrkningsmedium blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubation natten over ved 37 ° C blev ikke-migrerende celler på overfladen af ​​den øvre membran fjernes med en vatpind, og celler, der var migreret gennem membranen porer og invaderede undersiden af ​​membranen blev fikseret med 90% methanol og farvet med hematoxylin og eosin. For kvantitativ vurdering, blev antallet af farvede, migrerende celler derefter talt under et mikroskop. Fem energibesparende felter pr filter blev talt tre særskilte gange for tre uafhængige forsøg.

Stabil HIF1α banke ned i PC3 celler.

plasmider, der koder human HIF1α shRNA (Mission® klonnumre TRCN0000003810 og TRCN0000010819, som koder for en hårnål-typen siRNA) og en negativ kontrol-plasmid (SHC002) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Celler blev transficeret med enten en HIF1α shRNA plasmid eller den negative kontrol plasmidet under anvendelse af Neon® transfektion fremgangsmåden (Invitrogen). Kort fortalt, 1 x 10

6 celler blev trypsiniseret, vasket med PBS, og pelleteret før resuspension i 100 pi Neon resuspensionsbuffer. HIF1α eller kontrol shRNA plasmid (5 ug) blev tilsat og blandet godt ind cellesuspensionen før transfektion. De transficerede celler blev podet i komplet medium og selekteret med 1,0 ug /ml puromycin (Sigma-Aldrich) i 7 dage før yderligere analyser. Knockdown af HIF1α proteinet blev påvist ved Western blotting og ved måling af den færdige vare, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), ved enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA).

Oversættelse effektivitet.

for at bestemme om 5’UTR i HIF1α mRNA har nogen rolle i HIF1α overekspression i prostataceller en reporter plasmid blev konstrueret, hvor hele 5’UTR og 238 bp af HIF1α promotorsekvensen blev klonet opstrøms for

Firefly

luciferase-kodende sekvenser i pGL4.10 reporterplasmidet. Reporterkonstruktet blev transficeret ind i LNCaP og PC3-celler og ildflueluciferaseaktivitet, drevet af HIF1-UTR reporter vektor og

Renilla

luciferase (pTK-Renilla kontrol reporter vektor) blev bestemt efter 24 timers inkubation. Totalt mRNA blev ekstraheret fra de transficerede celler og mængden af ​​luciferase-mRNA blev bestemt ved anvendelse Real Time PCR. Luciferase-mRNA i celler transficeret med den tomme pGL4 vektoren blev anvendt som den basale kontrol. Oversættelse effektivitet blev beregnet ved at dividere

Firefly

luciferaseaktivitet (proportional med luciferase protein) ved koncentrationen af ​​

Firefly

luciferase mRNA. Dette forhold blev yderligere korrigeret for transfektion effektivitet ved at tage hensyn til

Renilla

luciferaseaktivitet.

kliniske resultat Studies

Menneskelige vævsprøver.

For vurdering af sammenhænge mellem HIF1α udtryk og kliniske resultater blev 100 humane prostata tumorer fra patienter, der havde givet informeret skriftligt samtykke blev indsamlet efter radikal prostatektomi eller transuretral resektion af prostata (TURP) på vores institution mellem 2000 og 2011. Alle prøver opnået fra Victorian Cancer Biobank og eller Institut for Anatomisk Patologi på Austin Hospital, Victoria, Australien. Godkendelse til anvendelse af biologiske prøver og de-identificerede patientdata til denne undersøgelse blev opnået fra Austin Health menneskelige forskningspotentiale etiske komité.

Immunhistokemi.

Paraffin-indlejrede vævssnit blev de-voksbehandlet i histolene og hydreret med faldende ethanolkoncentrationer. Objektglas blev skyllet i Tris-bufret saltvand /Tween 20 (TBST) og de antigener blev hentet ved opvarmning i citronsyre-buffer (pH 6,0) i en mikrobølgeovn i 2 minutter på medium høj og 13 minutter på medium lav. Objektglas blev tilladt at afkøle og endogene peroxidaser i prøverne blev blokeret ved behandling med 3% hydrogenperoxid i 10 minutter i mørke. Objektglas blev vasket i vand, ækvilibreret i TBST-buffer, blokeret med UltraVision (Thermo Fisher Scientific) i 10 minutter og farvet for HIF1α anvendelse af et HIF1α polyklonalt antistof (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved 4 ° C natten . Efter antistof inkubation blev objektglassene behandlet med en HRP-konjugeret sekundært antistof (Dako) i mørke ved stuetemperatur i 1 time. Objektglas blev vasket med TBST følgende 5 minutters inkubering med 3,3′-diaminobenzidin (DAB) chromogen (1 dråbe /ml substratbuffer, Dako) for at fuldføre farveudvikling. Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hæmatoxylin i 1 minut, vasket i rindende vand og Scotts ledningsvand i 1 minut hver, dehydreret og dæksel gled. Efterforskerne blev blindet for status for individuelle prøver, og tumorer blev opdelt efter tilstedeværelsen eller fraværet af HIF1α snarere end svag eller stærk farvning for at reducere inter-observatør variation.

Resultater.

Distant metastaser blev defineret af abnormaliteter dokumenteret på knogler-scan eller computertomografi. CRPC blev defineret som 2 på hinanden følgende stigninger af prostata-specifikt antigen (PSA) fra PSA nadir. Tiden til udvikling af fjernmetastaser blev målt fra kirurgi, mens tiden til udvikling af CRPC, kemo-modstand og PC-specifik død blev målt fra starten af ​​androgen deprivation. Pre-interventionel PSA blev defineret som PSA umiddelbart forud for opnåelse af den vævsprøve, og T3 og T4 iscenesættelse blev defineret som lokalt avanceret prostatacancer som i 2002 amerikanske Joint Commission on Cancer staging-systemet [30].

Statistisk analyse.

statistisk analyse blev udført under vejledning af den statistiske rådgivningstjeneste, University of Melbourne, Australien. Pearsons Chi-squared analyse og Fishers eksakte test blev udført ved hjælp af to-for-to tabeller (Gleason score, HIF1α positivitet, tumor fase og antal patienter startet på androgen deprivation terapi) på SigmaStat software (Jandel Scientific, San Rafael, CA) til teste associering mellem de patientkarakteristika og HIF1α udtryk. Univariate og multivariate analyse blev udført ved hjælp af Cox regressionsmodeller for alle variabler. For at overvinde den manglende konvergens af Cox-regressionsmodel ved analyse for HIF1α positivitet og Gleason score (som der ikke var nogen resultater i HIF1α negative gruppe og de lave Gleason score), disse univariate og multivariate analyse blev beregnet ved Cox regression med Firth er straffet maksimal sandsynlighed metode bruger R-software, (R fundament for Statistisk Computing-version 2.14.0). Overlevelse blev beregnet for hvert resultat ved anvendelse Kaplan-Meier-kurver med log rank test på SPSS statistisk pakke (IBM SPSS-version 17). Diagnostiske test evalueringer med sensitivitet og specificitet analyse blev udført ved hjælp af MedCalc statistisk software (MedCalc Software, Belgien https://www.medcalc.org/).

In vitro

data præsenteres som middel ± SEM. Statistisk signifikans for enkelt sammenligninger af normalfordelte data blev bestemt ved Students t-test eller for data, der ikke var normalfordelte af Mann-Whitney rank sum test. For flere sammenligninger blev udført en-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni korrektion. Alle statistikker blev analyseret med programmet SigmaStat (Jandel Scientific).

Resultater

HIF1α Expression korrelerer med Migration Rate i PC Celler

HIF1α proteinekspression blev analyseret i androgen-følsomme (LNCaP) og androgen-ufølsom (PC3 og DU145) CRPC-lignende celler. Basal HIF1α ekspression under normoxi var højere med 12 ± 6 gange og 10 ± 4 gange i henholdsvis CRPC-lignende cellelinjer PC3 og DU145 sammenlignet med androgen-sensitive LNCaP-celler (figur 1A). Interessant den iagttagelse, at den basale vækst i LNCaP-celler i serumfrie betingelser var meget højere end PC3-celler, som udtrykker mere HIF1α, viser, at øget ekspression af HIF1α ikke nødvendigvis føre til større proliferation (figur 1B). For at undersøge metastatiske potentiale af PC cellelinier blev migrering af CRPC cellelinier PC3 og DU145 sammenlignet med androgen-sensitive LNCaP-celler ved anvendelse af et Transwell assay. Den iagttagelse, at migration af PC3 og DU145 celler var 177 ± 6% og 215 ± 17% af værdien for LNCaP celler (100%) (figur 1C), at overekspression af HIF1α er forbundet med øget indvandring.

A) Basal HIF1α proteinkoncentrationer i de humane PC cellelinier LNCaP, DU145 og PC3 under normoxiske betingelser blev analyseret ved Western blot. (B) Proliferation blev analyseret ved celletælling efter 24 og 48 timer. (C) Migration /invasion blev målt ved Transwell assays ved 24 timer. Værdier i (A) og (C) er udtrykt som stigningen gange sammenlignet med LNCaP-celler, mens værdierne i (B) er udtrykt som en procentdel af tiden 0 værdi. Alle værdier er gennemsnit ± SEM af mindst tre separate behandlinger. (D) Overlevelse satser af PC celler udsat for cytotoksiske forhold. Overlevelsen af ​​PC3-celler (som har højere basal HIF1α protein), når de udsættes for oxidativ stress med hydrogenperoxid (H

2O

2) eller kemotoksicitet med 5-fluorouracil (5-FU) blev sammenlignet med overlevelsen af ​​LNCaP celler (som har lavere HIF1α ekspression). Overlevelse blev vurderet ved at tælle celleantal efter 24 timer. Værdierne er udtrykt som en procentdel af den ubehandlede kontrol og er middelværdien ± SEM af mindst tre separate behandlinger. #, P. 0,05 versus behandlede LNCaP celler

Greater HIF1α Expression korrelerer med Øget Cell Survival

Et af kendetegnene ved CRPC er dets modstandsdygtighed over for kemo- og radio-terapi. For at undersøge om HIF1α er ansvarlig for den øgede overlevelse CRPC-lignende celler

in vitro

, celle overlevelse efter behandling af PC3 eller LNCaP celler med to cytostatika, H

2O

2 (en kilde af oxidativt stress) og 5-fluorouracil (5-FU, et kemoterapeutisk lægemiddel) blev målt. Celleproliferationsassays (Figur 1D) afslørede, at overlevelsesprocenten på 60 ± 14% og 42 ± 8% for PC3 celler efter behandling med 100 uM H

2O 2 eller 15 pM 5-FU henholdsvis var

signifikant større end de respektive overlevelsesrater på 17 ± 4% og 3 ± 1,6% i androgen-følsomme LNCaP celler.

HIF1α Knockdown Formindsker Cell overlevelse og Migration af PC3 Cells

for at bekræfte, at den øgede overlevelse og migration af PC3 celler skyldtes større HIF1α proteinekspression blev ekspressionen af ​​HIF1α i PC3 celler slået ned ved hjælp shRNA vektorer. Transfektion af PC3-celler med en vektor der udtrykker HIF1α shRNA reducerede HIF1α proteinekspression til 12 ± 3% i klon 1 og 16 ± 3% i klon 2 sammenlignet med vildtype PC3-celler (100%) (figur 2A). VEGF, et efterfølgende produkt af HIF1α, blev også reduceret i HIF1α knockdown kloner, hvilket bekræfter nedgangen i HIF1α aktivitet (data ikke vist). Den iagttagelse, at der ikke var nogen forskel i den basale spredning på mellem HIF1α shRNA-udtrykkende PC3 celler og PC3 celler transficeret med en kodet kontrol vektor er i overensstemmelse med konstateringen af, at der ikke var nogen sammenhæng mellem større HIF1α udtryk og spredning sats (figur 1B). Efter H

2O

2 behandling kun 22,5 ± 3% af HIF1α knockdown PC3 celler (shRNA klon 1) overlevede i forhold til 58,5 ± 10% overlevelse i scrambled kontrol vektor-transficerede PC3 celler (Figur 2B). Tilsvarende 5-FU reducerede celleoverlevelse til 27 ± 2% i de HIF1α knockdown celler, sammenlignet med 62 ± 9% overlevelse celle i PC3-celler transficeret med et kodet kontrolvektor. Der var ingen signifikant ændring i ekspressionen af ​​HIF1α efter behandlingen af ​​PC3-celler transficeret med kontrol shRNA med 100 uM H

2O

2 eller 15 pM 5-FU sammenlignet med ubehandlede PC3-celler (figur 2C). Men der var 2,3 ± 0,2 gange og 6,6 ± 1-fold stigning i ekspression af HIF1α efter behandling af PC3 celler med 1% O

2 eller 300 uM CoC

2, henholdsvis (Figur 2C). Som vist i figur 2A den basale ekspression af HIF1α i HIF1α shRNA udtrykkende PC3 celler er målbart, og det er derfor ikke muligt at bestemme virkningen af ​​behandling med 100 uM H

2O

2 eller 15 pM 5-FU på HIF1α shRNA-udtrykkende PC3-kloner.

(A) HIF1α koncentrationer blev reduceret i 2 separate kloner af PC3 celler efter stabil ekspression af HIF1α shRNA som vurderet ved Western blot. Værdier er middelværdien ± SEM af mindst tre separate forsøg og er udtrykt som en procentdel af vildtype-PC3-celler. *, P 0,05 versus vildtype-PC3-celler. (B) overlevelse PC3-celler efter udsættelse for oxidativ stress (hydrogenperoxid (H

2O

2)) eller kemotoksicitet (5-fluorouracil (5-FU) i 24 timer blev reduceret efter HIF1α knockdown sammenlignet med krypterede styrevektor-transficerede PC3 celler Værdier er middelværdien ± SEM af mindst tre separate forsøg og er udtrykt som en procentdel af ubehandlet krypteret styrevektor-transficerede PC3 celler #, P. . 0,05 i forhold til kontrol (C) HIF1α proteinekspression i. PC3 celler transficeret med kontrol shRNA efter behandling med 1% O

2, 300 uM CoC

2, 100 uM H

2O

2, og 15 pm 5-FU. Cellelysater blev elektroforese på SDS -polyacrylamidgeler og blottet med HIF1α antistof. GAPDH udtryk blev anvendt som indlæsning kontrol. Western blots er vist, er repræsentative for mindst tre separate forsøg. Band densiteter blev bestemt ved densitometrisk analyse af HIF1α /GAPDH og præsenteres i forhold til værdien for ubehandlet . celler data repræsenterer gennemsnit ± SEM; * p 0,05 vs. ubehandlede PC3-celler. (D) Priser migration /invasion i HIF1α Knockdown PC3 celler blev reduceret i forhold til de scrambled kontrol vektor-transficerede PC3 celler som vurderet af Transwell assay. Værdier er middelværdien ± SEM af mindst tre separate forsøg og er udtrykt som en procentdel af ubehandlede scrambled styrevektor transficeret PC3-celler. *, P 0,05 versus kontrol. (E) Induktion af HIF1α i LNCaP celler ved hypoxi (mørkegrå søjler) eller ved cobaltchlorid (lysegrå søjler) øgede overlevelse efter udsættelse for oxidativ stress med H

2O

2 eller kemotoksicitet med 5-FU til 24 timer, når sammenlignet med styre LNCaP celler (sorte søjler). Værdier er middelværdien ± SEM af mindst tre separate behandlinger og er udtrykt som en procentdel af den ubehandlede LNCaP kontrol. #, P 0,05 versus behandlede LNCaP celler. *, P 0,05 versus LNCaP celler behandlet med 1% O

2 og 5-FU. (F) HIF1α proteinekspression i LNCaP-celler behandlet med 1% O

2 og 300 pM CoC

2 i kombination med enten 100 uM H

2O

2 eller 15 pM 5-FU. Cellelysater blev underkastet elektroforese på SDS-polyacrylamidgeler og blottet med HIF1α antistof. GAPDH udtryk blev anvendt som indlæsning kontrol. Western blots er vist, er repræsentative for mindst tre separate forsøg. Band densiteter blev bestemt ved densitometrisk analyse af HIF1α /GAPDH og præsenteres i forhold til værdien for normoksiske celler, som undergår den samme behandling. Data repræsenterer middel ± SEM; * P. 0,05 vs. ubehandlet kontrol, 100 uM H

2O

2 eller 15 uM 5-FU behandlede LNCaP celler

Tidligere 1,8 gange større migration blev observeret i PC3-celler sammenlignet med androgen-sensitive LNCaP-celler. For at afgøre, hvorvidt denne forskel blev medieret af HIF1α blev migration af HIF1α knockdown og kontrol vektor transficerede-PC3 celler sammenlignet. Knockdown af HIF1α ekspression ved RNA-interferens faldt PC3 migration til 37 ± 10% (klon 1) og 14 ± 7% (klon 2), sammenlignet med kontrolvektoren transficerede-PC3-celler (100%) (figur 2D).

induktion af HIF1α i LNCaP celler øger Cell Survival

for at bestemme om induktion af HIF1α udtryk i androgen-følsomme LNCaP celler kan øge deres overlevelse efter behandling med cytostatika, blev HIF1α udtryk fremkaldt ved hjælp af enten hypoxi (1 % O

2) eller hypoxi mimetiske cobaltchlorid (Figur 2E). Inkubation af LNCaP-celler med enten 100 uM H

2O

2 eller 15 pM 5-FU reducerede overlevelsen til 17 ± 4% og 26 ± 2% sammenlignet med ubehandlede kontrol (100%). Dog overlevelsesprocenten i tilstedeværelse af 100 uM H

2O

2 efter behandling af LNCaP celler med enten 1% O

2 eller cobaltchlorid steg til 40 ± 8% og 49 ± 11%. Overlevelsen (113 ± 23%) af LNCaP-celler behandlet med 300 pM CoCl2

i kombination med 15 pM 5-FU var signifikant højere sammenlignet med overlevelsen (54 ± 10%) observeret i LNCaP-celler behandlet med 1% O

2 i kombination med 15 pM 5-FU. Interessant, 300 uM CoCl inducerede

2 i kombination med 15 pM 5-FU en lidt højere 3,3 ± 0,5 gange stigning i HIF1α ekspression i LNCaP-celler sammenlignet med 2,1 ± 0,4 gange stigning induceret af 1% O

2 i kombination med 15 pM 5-FU, selv om forskellen ikke var statistisk signifikant (figur 2F).

Øget Translation Effektivitet af HIF1α mRNA er Ansvarlig for HIF1α Overekspression i PC3 Celler

selvom reguleringen af ​​oversættelse 5’UTR er en vigtig mekanisme for post-transkriptionel regulering af genekspression, oversættelsen effektivitet HIF1α mRNA i prostata celler er ikke tidligere blevet rapporteret. Som vist i figur 3A forholdet

Firefly

til

Renilla

luciferaseaktivitet efter transfektion af HIF1α 5’UTR-LUC reporter og pTK-Renilla styrevektorer var 20 ± 3 gange og 26 ± 3 gange i LNCaP og PC3-celler, sammenlignet med celler transficeret med tom pGL4 vektor. Men luciferase-mRNA-ekspression var 33 ± 1,4 gange i LNCaP og 9 ± 2,1 gange i PC3-celler sammenlignet med tom pGL4 vektor-transficerede celler (figur 3B). Yderligere oversættelsen effektivitet HIF1α mRNA i PC3 celler var 2,9 ± 0,4 gange højere end LNCaP celler, når evalueret ved brug indekset for luciferaseaktivitet /relative mRNA indhold (figur 3C).

(A)

Firefly

Renilla

luciferaseaktiviteter i prostatacancerceller efter transfektion af en HIF1α 5’UTR-luciferase-konstruktion og PTK-Renilla kontrol reporter vektor blev bestemt under anvendelse af et dobbelt luciferase assay. (B) Real-time PCR (RT-PCR) analyse af luciferase-mRNA i PC celler transficeret med HIF1α 5’UTR-luciferase-konstruktion. Efter transfektion blev RNA isoleret, og luciferase-mRNA-ekspression detekteret ved real time RT-PCR og normaliseret ved 18S mRNA-ekspression. (C) Translationel effektivitet er forholdet mellem

Firefly-service /

Renilla

luciferaseaktivitet, divideret med relativ koncentration luciferase-mRNA i PC celler. Den translationelle effektivitet af luciferase mRNA drevet af 5’UTR region HIF1α i PC3-celler er højere end i LNCaP-celler. Værdier er middelværdien ± SEM af mindst tre separate forsøg. *, P. 0,05 versus behandlede LNCaP celler

HIF1α Protein Expression i Human Prostata Cancer tumorer

Et hundrede menneskelige pc prøver blev inddelt i to grupper efter deres Gleason score (≤ 7 (38) og 7 (62), tabel 1) og HIF1α status. Ekspressionen af ​​HIF1α blev vurderet ved immunohistokemi (figur 4A). Figur 4A (a) viser en positiv, og figur 4A (b) viser et negativt, HIF1α farvning i to typiske tumorer med Gleason score 9 (Indsat kasse, X20 visning). Figur 4A (c) viser en positiv, og fig 4A (d) viser en negativ (d), HIF1α farvning i to typiske tumorer med Gleason score 6. Positiv farvning i PC3-celler (figur 4A (e)) og negativ farvning i LNCaP celler (figur 4A (f)), og i HIF1α knockdown PC3-celler (figur 4A (g)) viste specificiteten af ​​HIF1α antistof. Derudover HIF1α blev udtrykt i hele tumoren med forøget ekspression i hovedsagen prostata kirtler (angivet med pilen i figur 4A (a)), og i lymfeknudemetastaser (angivet med pilen i figur 4A (h)). I positive prøver HIF1α udtryk var homogen i hele tumoren området.

(A) Repræsentative immunhistokemi resultater, der viser ekspressionen af ​​HIF1α i prostata cancer prøver og cellelinjer. Positiv (Aa) og negative (Ab) farvning for HIF1α blev observeret i to typiske tumorer med Gleason score 9 (Indsat kasse, X20 visning).