PLoS ONE: Migrastatin Analoger Inhibit Canine Mammary Cancer Cell Migration og Invasion

Abstrakt

Baggrund

Kræft spredt sig til andre organer er den vigtigste dødsårsag for onkologiske patienter. Migration af kræftceller fra en primær tumor er det afgørende skridt i den komplekse proces med metastaser, derfor blokerer denne proces er i øjeblikket den vigtigste behandling strategi. Metastaseinhibitorer stammer fra naturlige produkter, såsom, migrastatin, er meget lovende anticancermidler. Således er formålet med vores undersøgelse var at undersøge virkningen af ​​seks migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) på migration og invasion af hunde brystadenocarcinom cellelinjer isoleret fra primære tumorer og deres metastaser i lungerne. Canine mamma tumorer udgør et værdifuldt værktøj til at studere flere aspekter af human cancer

Resultater

Vores resultater viste, at to af seks fuldt syntetiske analoger af migrastatin:. MGSTA-5 og MGSTA-6 blev potent inhibitorer af hunde migration og invasion mammae cancerceller. Disse data blev opnået ved anvendelse af sårheling test, samt trans-brønds migration og invasion-assays. Desuden behandles af cancerceller med den mest effektive forbindelse (MGSTA-6) forstyrret binding mellem filamentøse F-actin og fascin1. Konfokal mikroskopi afslørede, at behandling med MGSTA-6 forøgede tilstedeværelsen af ​​ubundet fascin1 og reduceret co-lokalisering af F-actin og fascin1 i hunde cancerceller. Mest sandsynligt, actinfilamenter ikke var tværbundet ved fascin1 og ikke generere den typiske filopodial arkitektur actinfilamenter i afhængighed af aktiviteten af ​​MGSTA-6. Således administration af MGSTA-6 resulterer i nedsat dannelse af filopodia fremspring og stress fibre i hunde mammae kræftceller, der forårsager hæmning af migration kræft og invasion.

Konklusion

To syntetiske migrastatin analoger (MGSTA -5 og MGSTA-6) viste sig at være lovende forbindelser til inhibering af cancermetastase. De kan have gavnlige terapeutiske virkninger ved cancerterapi hos hunde, især i kombination med andre anticancerlægemidler. Men yderligere

i

vivo

undersøgelser er at verificere denne hypotese

Henvisning:. Majchrzak K, Lo Re D, Gajewska M, Bulkowska M, Homa A, Pawłowski K, et al. (2013) Migrastatin Analoger Inhibit Canine Mammary Cancer Cell Migration og Invasion. PLoS ONE 8 (10): e76789. doi: 10,1371 /journal.pone.0076789

Redaktør: Waldemar Debinski, Wake Forest University, School of Medicine, USA

Modtaget: Maj 22, 2013; Accepteret: September 4, 2013; Udgivet: 8 oktober 2013

Copyright: © 2013 Majchrzak et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud nummer N N308 574.940 fra Ministeriet for Videnskab og videregående Uddannelser Polen og Science Foundation Ireland (tilskud nummer 07 /IN.1 /B966). Den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra programmet Mennesker (Marie Curie-aktioner) i Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under REA tilskudsaftale nummer Pief-GA-2011 til 299.042. Dette arbejde blev støttet af COST Action CM1106. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastase er årsag til de fleste kræftdødsfald [1,2]. Selv om det i udstrakt grad undersøges, er det stadig et af de mest uudgrundelige aspekter af sygdommen. Dårlige resultater af de nuværende behandlinger, især dårlig prognose for patienter i fremskredne stadier af solide tumorer grundet metastaser opmuntre efterforskere over hele verden for at finde nye lægemidler, der kunne hæmme metastatisk kaskade. En lovende middel er det naturlige produkt migrastatin: en ny anti-metastatisk forbindelse af mikrobiel oprindelse. Det er en makrolacton naturprodukt oprindeligt isoleret fra

Streptomyces

sp. MK929-43F1 af Imoto et al. i 2000 [3-5], og senere fra

Streptomyces platensis

af Licari et al. i 2002 [6] som en inhibitor af tumorcellemigration. Blot få år senere den første samlede kemiske syntese af migrastatin blev rapporteret [7,8]. Siden da har flere mere effektive analoger af migrastatin blevet syntetiseret og beskrevet som lovende anti-metastatiske narkotika [8-13]. Der har været bestræbelser på at generere yderligere analoger til struktur aktivitet undersøgelser [14-17]. Vigtigere er, har enklere analoger af migrastatin, såsom makrolid MGSTA-8 (figur 1), udvist aktivitet ~ 1000 gange mere aktiv end migrastatin sig i tumorcellemigration assays

in vitro

[9]. Trunkerede analoger, såsom MGSTA-4 og macroketone MGSTA-5 og MGSTA-8 inhiberer metastase af højt metastatiske tumorceller i musemodeller [10,12]. Men hæmning af celle migreringsevnen betydeligt afhænger af strukturen af ​​forbindelserne og nogle acycliske analoger udviser aktivitet [11,14,15].

Den molekylære mekanisme, ved hvilken migrastatin påvirker kræft cellemigration og invasion er ikke fuldt opdaget, selv om det har været foreslået til at målrette fascin1, actin-bundling protein [18]. Migrastatin kan binde til et af de actinbindende steder forhindrer actin krydsbinding af filamenter og filopodia formation [18]. Over-ekspressionen af ​​

fascin1

i cancerceller er tidligere blevet forbundet med klinisk aggressiv karakter af tumoren, dårlig prognose og kortere sygdomsfri overlevelse tid [18-20].

Vores tidligere undersøgelser har vist opregulering af

fascin

i stærkt invasive hunde brystkirtler kræft cellelinjer [21]. Således har vi brugt dem som en model til undersøgelse af fascin-målretning lægemidler, såsom migrastatin. Derfor undersøgte vi en rolle på seks forskellige analoger af migrastatin MGSTA-1 til 6, herunder Danishefsky macroketone (MGSTA-5) og makrolacton (MGSTA-4), i canine brystcancer celleinvasion, migration og cytoskelettet omlejring.

de hunde mamma tumorer er attraktive og nyttig model til at studere menneskelig brystkræft, fordi de fange essensen af ​​menneskelige brystkræft, i modsætning til de fleste genetisk modificeret eller xenograft gnavermodeller. For det første hunde deler det samme miljø som mennesker, således udsættes for mange af de samme kræftfremkaldende stoffer. For det andet forekommer de tumorer hos hunde naturligt og spontant og har en identisk fremgangsmåde end den hos mennesker. Talrige kliniske ligheder er blevet demonstreret hidtil, om hormonelle ætiologi af tumorer, alder debut, risikofaktorer (f.eks fedme), kliniske resultat, prognose faktorer (f.eks tumorstørrelse, lymfeknude invasionsevne og klinisk fase) (for gennemgang se: [ ,,,0],22-24];). Desuden har mange stærke og væsentlige ligheder på molekylært niveau er påvist i genom-dækkende komparative undersøgelser. For eksempel blev der veje relateret med fremme af spredning opreguleret i begge arter, og dem der er forbundet med celle udvikling, celle-matrix adhæsion, og celle kommunikation, blev nedreguleret [23]. Desuden overekspression af steroid receptorer, proliferationsmarkører, epidermal vækstfaktor, p53 suppressor genmutationer, metalloproteinaser og cyclooxygenaser, blev fundet i begge arter, samt stor homologi i ændringerne af cancer-relaterede veje såsom phosphatidylinositol 3-kinase ( PI3K) /AKT pathway, KRAS, phosphatase og tensin homolog (PTEN), Wnt-β-catenin, og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) kaskade [23,25]. Derfor hundens brystkirtler tumor model udgør et værdifuldt redskab til translationel medicin især til evaluering og udvikling af nye diagnostiske og prognostiske applikationer samt terapeutiske strategier, der vil gavne både hunde og menneskelige kræftpatienter [22-26].

Metoder

Cell kultur

De cellelinier anvendt til denne undersøgelse er beskrevet i vores tidligere offentliggjorte forskning [21,27]. To adenokarcinom cellelinier blev isoleret fra hunde brysttumorer (CMT-W1 og CMT-W2) og to cellelinier blev isoleret fra deres lungemetastaser (CMT-W1M og CMT-W2M). Cellelinierne blev dyrket i RPMI-1640 medium indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 50 U /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 2,5 ug /ml amphotericin B (reagenser opnået fra Sigma Aldrich Chemical Co., USA). Celler blev dyrket i vævskulturkolber (Nunc ™, Danmark) i en atmosfære af 5% CO2 og 95% fugtig luft ved 37 ° C, og blev rutinemæssigt subkultiveret hver anden dag.

Migrastatin analoger

strukturer testede migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) er vist i figur 1.

Syntese af analoger af migrastatin

Forbindelse MGSTA-4 og MGSTA-5 blev syntetiseret fra 9 som rapporteret i litteraturen [9], mens forbindelser MGSTA-1 til 3 og MGSTA-6 blev fremstillet ud fra 9 [9] som illustreret i figur 2. således forestring af 9 med 5-hexensyre under Mitsunobu-betingelser efterfulgt af ringslutningsmetatese (RCM) gav 10 og efterfølgende fjernelse af TBS-gruppen gav MGSTA-1. Behandling af 9 med carbontetrabromid i nærværelse af polymerunderstøttet triphenylphosphin i dichlormethan gav allyliske bromid 11 [9]. Efterfølgende omsætning af β-ketosulfone 12 i nærvær af DBU efterfulgt af reduktiv fjernelse af sulfongruppen gav 13. Ring lukning metatese og fjernelse af TBS-gruppen gav MGSTA-2. Den thiolacton blev fremstillet ud fra 14, som var først omdannet til thio syren 15 under anvendelse af Lawessons reagens [28]. Dannelse af thiolacton under Mitsunobu-betingelser, RCM og TBS fjernelse gav MGSTA-3. TBS beskyttet macroketone 16 blev fremstillet ud fra 9 som beskrevet tidligere [9]. Dannelse af TMS enolether blev opnået i et regioselektiv måde og efterfølgende oxidation med Pd (OAc)

2 gav den i α, β-umættede macroketone 17. Endelig fjernelse af TBS-beskyttelsesgruppen gav umættede macroketone MGSTA-6.

Reagenser og betingelser: (a) 5-hexensyre, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, rt, 3h, 69%; (B) Grubbs 2

nd, PhCH

3, tilbagesvaling, 25 min, 68%; (C) HF. Py, THF, rt, 18h, 61%; (D) CBr

4, Ph

3P polymer-bundet, CH

2Cl

2, rt, 50 min; (E) 12, DBU, PhCH

3 derefter 11, rt, 1,5 time; (F) Na /Hg, MeOH, rt, 3h, 51% over tre trin; (G) Grubbs 2

nd, PhCH

3, tilbagesvaling, 15 min, 99%; (H) HF. Py, THF, rt, 38h, 84%; (I) Lawesson reagens, CH

2Cl

2, mw, 100 ° C, 10 min; (J) 9, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, rt, 15h, 42%; (K) Grubbs 2

nd, PhCH

3, tilbagesvaling, 15 min, 88%; (L) HF. Py, THF, rt, 18h, 85%; (M) TMSCI, LHMDS, THF, 0 ° C, 2 timer; (N) Pd (OAc)

2, CH

3CN, rt, 3h, 64% over to trin; (O) HF. Py, THF, rt, 18h, 90%.

Cellelevedygtighed assay (MTT-assay)

Cellelevedygtighed (metaboliske aktivitet af levedygtige celler) blev kvantificeret ved MTT-assayet. Celler blev podet på 96-brønds plade (Nunc Inc., Danmark) ved en koncentration på 1 × 10

4 celler pr. Når cellerne nåede 60-70% konfluens blev mediet erstattet med medium indeholdende 10% FBS og seks forskellige migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) ved koncentrationerne af: 1, 10 eller 100 uM. Kulturerne blev inkuberet i 24 timer. Derefter blev celler inkuberet med 0,5 mg /ml tetrazoliumsalt MTT fortyndet i phenolrødt-frit RPMI 1640-medium (Sigma Aldrich) i 4 timer ved 37 ° C. For at fuldende opløsning af formazankrystallerne blev 100 pi DMSO (dimethylsulfoxid, Sigma Aldrich) tilsat til hver brønd. Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved måling af absorbans ved fotometrisk 570 nm i en multi-brønds plade-læser (Infinite 200 PRO Tecan ™, TECAN, Schweiz). Alle prøver blev undersøgt i tre eksemplarer, blev hvert eksperiment udført tre gange (n = 9).

Cellekultur på en rekonstitueret basalmembran (Matrigel)

Cancer celler blev behandlet med trypsin og resuspenderet i dyrkningsmedium. Hver brønd i Lab-Tek 8-kammer kultur slides (Nunc Inc., USA) blev overtrukket med 25 pi vækstfaktor reduceret Matrigel (BD Biosciences) og objektglassene blev efterladt til at størkne i 30 minutter. ved 37 ° C. Cellerne blev derefter udpladet ved en koncentration på 10

4 celler /ml i migrastatin analog-holdigt medium eller medium med tilsætning af DMSO (lægemiddelvehikel). Væksten af ​​celler på Matrigel blev observeret hverdag under fasekontrastmikroskop (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Eksperimentet blev udført tre gange (n = 3).

In vitro

sårheling assay (skrabe test)

ridse assay blev udført for at vurdere indflydelsen af ​​migrastatin analoger på hunde brystcarcinoma cellemotilitet. Cellerne blev podet i en høj densitet ved 600 mm petriskåle (Corning-Costar, Cambridge, USA). Efter 24 timer blev mediet fjernet og erstattet med medium indeholdende 10% FBS og en af ​​seks migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) eller DMSO (kontrol). Den monolag blev såret ved at ridse overfladen: så ensartet og lige som muligt med en pipettespids (1000 pi) mindst tre gange. Billederne af celler invaderer ridse blev indfanget ved angivne tidspunkter (0, 4, 6, 8 og 24 timer) under anvendelse af fasekontrastmikroskopi (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Billederne blev analyseret ved hjælp af en computer-assisteret billede analysator (Olympus Microimage ™ Image Analysis, softwareversion 4.0 til Windows, USA). Migrationen rate blev udtrykt som en procentdel af scratch lukning og blev beregnet som følger:% af scratch lukning = ab /a, hvor (a) er en afstand mellem kanterne af såret, og (b) er den afstand, som forblev celle-fri under cellemigrering at lukke såret [29].

værdierne præsenteres som hjælp af tre uafhængige sår felter fra tre uafhængige forsøg (n = 9).

Trans-brønd migration assay

Boyden kammer cellemigrationsassay blev udført under anvendelse af BD Falcon ™ FluoroBlock ™ 24-Multiwell Indsæt Plader (8 mikron porestørrelse) (BD Biosciences, USA). For det første celler (1 x 10

5) blev suspenderet i FBS gratis medium og lægges til de apikale kamre af en indsats plader (500 pi). Derefter 750 pi kemoattraktant (10% FBS) blev tilsat til det basale kamre. Migrastatin analoger (MGSTA-5 eller MGSTA-6 ved 100 uM) eller DMSO (som kontrol) blev tilsat til mediet i begge kamre. Til undersøgelser dosisafhængige MGSTA-6 blev anvendt i området koncentration fra 0,1 til 100 uM. Migration analyser blev udført i 18-20 timer ved standard dyrkningsbetingelser. Derefter blev mediet forsigtigt fjernet fra apikale kammer og indsatsen systemet blev overført til en anden 24-brønds plade indeholdende 500 pi 2,5 pg /ml Calcein AM i Hanks Balanced Salt-opløsning (HBSS). Pladerne blev inkuberet i en time ved standard dyrkningsbetingelser. Derefter blev fluorescensen af ​​migrerede celler målt ved excitationsbølgelængden 485 nm og emissionsbølgelængde 530 nm under anvendelse af fluorescerende pladelæser med bund læsning kapaciteter Infinite 200 PRO Tecan ™ (Tecan, Schweiz). Alle prøver blev analyseret tredobbelt, og hvert eksperiment blev udført tre gange (n = 9). For hvert eksperiment to negative kontroller blev anvendt: (1) celler dyrket som angivet ovenfor uden tilsætning chemoattractant til mediet, og (2) medium tilsat som beskrevet uden celler. For at bestemme fluorescens af celler, der migrerede gennem membranen blev pladerne analyseret under anvendelse af fluorescens mikroskop (Olympus BX60, forstørrelse x 4).

Trans-brønd invasion assay

celleinvasion udførtes under anvendelse af BD BioCoat ™ 24-Multiwell invasion System pre-coatet med BD Matrigel ™ Matrix (BD Biosciences, USA). Insert Pladerne blev først fremstillet ved at rehydrere BD Matrigel ™ Matrix lag med varm PBS i to timer ved 37 ° C. Den rehydrering opløsning blev derefter forsigtigt fjernet, og 500 pi cellesuspension blev sat til det apikale kamre (2,5 x 10

5 celler). Cellesuspension blev fremstillet ved trypsinbehandling cellemonolag (80% konfluente) og resuspendering af cellerne i FBS medium. Derefter 750 pi kemoattraktant (10% FBS) blev tilsat til det basale kamre. Til eksperimentet blev MGSTA-6 eller DMSO (som en kontrol) tilsat til mediet i begge kamre. Invasion assayplader blev inkuberet i 22-24 timer ved standard dyrkningsbetingelser. Derefter blev mediet forsigtigt fjernet fra apikale kammer og insert system blev farvet med calcein AM i HBSS på samme måde som beskrevet i migration assay. Derefter blev fluorescensen af ​​besatte celler målt ved anvendelse af fluorescerende pladelæser Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ext.485 nm /Ems. 530 nm) (TECAN, Schweiz). Alle prøver blev analyseret tredobbelt, blev hvert eksperiment udført tre gange (n = 9). For hvert eksperiment udgjorde den negative kontrol medie, hvor kemoattraktant ikke blev tilsat. For at bestemme fluorescens af celler, der invaderede gennem membranen belagt med Matrigel pladerne blev analyseret ved anvendelse af fluorescens mikroskop (Olympus BX60, forstørrelse x 4).

Konfokal mikroskopi

canine brystkræftceller var dyrket på Lab-Tek kultur objektglas overtrukket med Matrigel i 24 timer i migrastatin indeholdende medium (MGSTA-6 i en koncentration på 100 uM). Derefter blev cellerne vasket to gange i varm PBS og fikseret med 3,7% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur (RT). Derefter blev cellerne permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 fortyndet i PBS (10 minutter ved stuetemperatur), vasket i PBS tre gange og inkuberet med primære kanin anti-phospho-FSCN1 (Ser39) antistof ved 1: 100 fortynding i PBS ( BIOSs, USA). Efter inkubation natten over med primære antistoffer ved 4 ° C blev cellerne vasket tre gange i PBS og inkuberet med sekundære Alexa Fluor 568 gede-anti-kanin-antistoffer fortyndet 1: 500 i PBS (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA) og co-farvet for F actin med FITC-X phalloidin fortyndet 1: 100 i PBS (Invitrogen, USA) i en time i mørke ved stuetemperatur. Dækglassene blev derpå monteret på mikroskopobjektglas under anvendelse SlowFade®Gold monteringsmedium (Life Technologies, Invitrogen). Celler blev visualiseret under anvendelse af konfokal laser scanning mikroskop FV-500-systemet (Olympus Optical Co., Hamburg, Tyskland). Kombinationen af ​​excitation /emission var: Argon 488 nm laser med 505-525 nm filter til FITC og HeNe 543 nm laser med 610 nm filter til Alexa Fluor 568 farvning. Billederne blev indsamlet separat for hver fluorescens kanal. Cellerne blev undersøgt under anvendelse af FluoView programmet (Olympus Optical Co., Tyskland). For at kvantificere konfokale resultater, har vi analyseret intensiteten af ​​rød fluorescens relateret til fascin1 udtryk og kolorimetrisk intensitet pletter, der viser co-lokalisering af fascin1 og F-actin på flettefelter billeder, ved hjælp af computer-assisteret billede analysator (Olympus Microimage ™ billedanalyse , softwareversion 5.0 til windows, USA). Fem til ti billeder i hvert objektglas blev analyseret. Antigen spot farve intensitet blev udtrykt som gennemsnitlig pixel integreret optisk densitet (IOD).

Statistisk analyse

Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.00 software (GraphPad Software, USA). Den envejs ANOVA og Tukey HSD (Ærligt signifikant forskel) post-hoc test, Dunnetts test og

t

-test blev anvendt samt regressionsanalyse. Den p-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant hvorimod p-værdi 0,01 og 0,001 så meget signifikant. Data blev udtrykt som middel +/- S.D. medmindre andet er angivet.

in vitro

sårheling assay blev analyseret ved hjælp af to-vejs RM ANOVA og Bonferroni post-hoc test.

Resultater og Diskussion

Effekten af ​​seks analoger af migrastatin på cancer cellelevedygtighed

Først undersøgte vi, om de undersøgte analoger af migrastatin påvirket cellelevedygtighed. Fire af disse kemiske forbindelser (MGSTA-1, MGSTA-3, MGSTA-5, og MGSTA-6) ændrede ikke levedygtigheden af ​​hunde cancerceller på alle brugte koncentration (figur S1). Imidlertid levedygtighed CMT-W1 og CMT-W2-celler faldt betydeligt (ca. 29% og 32%, henholdsvis) efter behandling med MGSTA-4 i en koncentration på 100 pM (p 0,01) (Figur S1A, B ). Levedygtigheden af ​​de CMT-W1-celler også nedsatte efter inkubation med MGSTA-2 med ca. 26% (figur S1A). Faldet i cellelevedygtighed efter behandling med 100 uM MGSTA-4 og MGSTA-2 kunne have været forbundet med deres cytotoksicitet derfor i de følgende eksperimenter blev disse forbindelser anvendes i en koncentration på 10 pM for at sikre, at den observerede effekt af disse forbindelser på migration og invasion var ikke resultatet af inhibering af celleproliferation eller induktion celledød.

Omvendt vi også observeret, at lavere koncentrationer af andre analoger af migrastatin forårsagede en lille stigning i cancer cellelevedygtighed (f.eks MGSTA -5 eller MGSTA-6 i CMT-W1-cellelinje; MGSTA-1, MGSTA-2 i CMT-W2 cellelinie og MGSTA-3 i CMT-W1M og CMT-W2M cellelinier) (Figur S1). For således at undgå mulig forfremmelse kræft cellevækst ved behandlede forbindelser, i følgende eksperimenter, vi brugte den højest mulige koncentration (100 uM), som ikke påvirker cellernes levedygtighed (heller faldende hverken øge dens levedygtighed). Desuden tidligere undersøgelser på human A549 lungekræft cellelinje viste, at lavere koncentrationer af migrastatin analoger (ME – migrastatin kerne ether) påvirkede ikke cellemigration [13]. Derudover en undersøgelse af Shen og medarbejdere [11], hvor atten forskellige semi-syntetisk fremstillede migrastatin congenere blev undersøgt, viste, at kun to forbindelser vises cellemigration hæmning IC

50 værdier under 100 uM i sårheling assay .

Hæmning af hunde migration mamma kræftceller ved analoger af migrastatin evalueret af sår healing assay

in vitro

sårheling assay blev udført for at karakterisere effekten af analoger af migrastatin for migration af hunde kræftceller. Som vist i figur 3 to af seks undersøgte forbindelser (MGSTA-5 og MGSTA-6) forårsagede kraftig inhiberende virkning på cancercelle migration i CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2 cellelinier. Derudover også MGSTA-2 var ganske effektiv i CMT-W2 cellelinje ved tidspunkter 4, 6 og 8 timer efter ridser. Mens i kontrolbetingelse celler lukket 39,2 ± 6,8%, 57 ± 7,5% og 84 ± 9,4% af såret (efter 4, 6 og 8 timer, henholdsvis), efter MGSTA-2 administration celler lukket kun 19,9 ± 2,1%, 29,6 ± 9,9% og 38,9 ± 8,8% af såret hhv. Men efter 24 timer såret var helt lukket som i kontrol tilstand (figur 3B). Cellemigrering ikke påvirket af nogen af ​​de undersøgte migrastatin analoger i CMT-W2M cellelinje (data ikke vist).

Kvantificering af migration af CMT-W1 (A), CMT-W2 (B) CMT W1M (C) cellelinier er vist som procentdele af scratch lukning og blev beregnet som følger:% af scratch lukning = ab /a, hvor (a) er en afstand mellem kanterne af såret, og (b) er den afstand, som forblev cellefri under cellemigration at lukke bunden. Fotografier af celler invaderer ridse blev taget ved udgangspunktet og efter 4, 6, 8, og 24 timer ved hjælp af fasekontrastmikroskopi (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Administration af MGSTA-5 og MGSTA-6 (100 uM) faldt celler motilitet i CMT-W1, CMT-W2 og CMT-W1M cellelinier. Den MGSTA-2-behandling faldt cellerne motilitet kun i CMT-W2 cellelinie. Andre migrastatin analoger påvirker ikke migration evne undersøgte cellelinjer. (D) Repræsentative billeder af scratch lukning i kontrol- betingelser og efter MGSTA-5 og MGSTA-6 behandling (100 uM) på 8

th hr efter skrabe i CMT-W1, CMT-W2 og CMT-W1M cellelinjer; billeder blev taget ved hjælp objektiv med 4x forstørrelse og analyseret ved hjælp af en computer-assisteret billede analysator (Olympus Microimage ™ Image Analysis, softwareversion 5.0 til Windows, USA). Eksperimentet blev udført tre gange. To-vejs ANOVA og Bonferroni post-hoc test blev anvendt. p 0.05 blev markeret som * og p 0,001 blev markeret som ***.

MGSTA-5 givet i en koncentration på 100 uM inhiberede migration af CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2-celler som reaktion på bunden såret. CMT-W1 celler behandlet med MGSTA-5 lukket kun 29 ± 6,5% og 56 ± 5,2% af såret (efter 6 og 8 timer, henholdsvis), mens der i kontrolbetingelser, 50 ± 7,2% og 78 ± 7,8% af den sår blev lukket 6 og 8 timer efter ridser henholdsvis (figur 3A). Tilsvarende CMT-W2 celler inkuberet med MGSTA-5 (100 uM) lukket kun 30 ± 3,8% og 43 ± 3% af såret 6 og 8 timer efter at ridse (henholdsvis), mens det i kontrol- betingelser, de lukket 57 ± 7,5% og 84 ± 9,4% af såret på dette tidspunkt (6 og 8 timer henholdsvis) (figur 3B). Tilsvarende også CMT-W1M celler inkuberet med denne forbindelse lukket 21 ± 7,7% og 30 ± 7,4% af såret 6 og 8 timer efter ridser henholdsvis hvorimod kontrolceller lukket 59 ± 6,3% og 80 ± 8,7% af såret på de samme tidspunkter (figur 3C). Desuden havde de CMT-W2 og CMT-W1M cellelinjer behandlet med MGSTA-5 ikke lukke såret selv efter 24 timers skrabe (74 ± 7,3% og 52 ± 7,8% lukning, henholdsvis). I kontrol betingelser, såret var helt lukket (figur 3B, C).

MGSTA-6 også vist sig at være en meget effektiv inhibitor af migration. CMT-W1-cellelinie behandlet med dette middel lukket kun 25 ± 5,1% og 37 ± 2,8% af de viklede 6 og 8 timer efter skrabe (figur 3C). Behandling af CMT-W2-celler med MGSTA-6 faldt også deres migration evne. Det var stærkt signifikant 8 og 24 timer efter at ridse. I kontrolbetingelser såret blev næsten fuldstændig lukket på dette tidspunkt (86-100%), hvorimod celler behandlet med MGSTA-6 lukket kun 52 ± 8,1% og 78 ± 5,2% af såret, henholdsvis (figur 3B). Den MGSTA-6 forårsagede en lignende effekt i CMT-W1M cellelinje, som blev manifesteret ved næsten fuldstændig blok af migration (9 ± 6,8% og 21 ± 3,7% af sårlukning 6 og 8 timer efter ridser, henholdsvis). Efter 24 timer kun 41 ± 4,2% af såret blev lukket (figur 3C).

Danishefsky og medarbejdere opnåede lignende resultater [13]. Forfatterne undersøgte anti-metastatiske egenskaber af migrastatin kerne ether (ME) og carboxymethyl migrastatin ether (CME). Begge forbindelser givet ved en koncentration på 100 uM næsten fuldstændigt blokerede migration af human ikke-småcellet lungekræft 12 timer efter bunden. Forfatterne baseret på sårheling assay bestemmes halvmaksimal inhiberende migration koncentration (IC

50 værdi), hvilket var lavere end opnået i vores forskning med anvendelse af trans-brønd migration assay (diskussion nedenfor). Den mest effektive inhibering af migration i tre hunde cancercellelinier, bedømt ved sårheling assay blev opnået med MGSTA-5 og MGSTA-6 ved en koncentration på 100 uM, og disse to blev anvendt til yderligere karakterisering. Selvom MGSTA-2 inhiberede migration evne CMT-W2-celler var ineffektive i andre cellelinier. Til gengæld MGSTA-4 (Danishefsky ‘makrolacton «) ved høj koncentration på 100 uM signifikant hæmmede cellulær proliferation af to cellelinier (CMT-W1 og CMT-W2) (Figur S1A, B), men ved lavere koncentration (10 uM ) havde ingen effekt på cellemigration (figur 3). Disse uoverensstemmelser kan skyldes forskellige karakteristisk for hunde cellelinjer.

Hæmning af migration og invasion af hunde mammae cancerceller af to af de mest effektive analoger af migrastatin (MGSTA-5 og MGSTA-6) vurderet af Boyden kamre assay

for at bekræfte anti-metastatisk aktivitet af to forbindelser, der var den mest effektive i sårheling assay, vi udførte migrationen og invasion analyser i Boyden kamre.

Kræft celle migration blev faldt betydeligt efter 24 timers inkubation med 100 uM af MGSTA-5 og MGSTA-6 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinier. Den fluorescensintensitet relateret til de migrerende celler i kontrol- betingelser var 10,3 ± 2,5, og 19,7 ± 3,1 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinie, henholdsvis, mens behandling med macroketone MGSTA-5 faldt de relative fluorescerende enheder (RFU) til 5,6 ± 1,2 og 14,2 ± 2,1 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinie (figur 3A). En lignende virkning blev opnået i celler behandlet med MGSTA-6. RFU faldt til 4,2 ± 1,2 og 3,8 ± 1 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinie (figur 4A). Migration af CMT-W2-celler blev næsten fuldstændig inhiberet af disse forbindelser. Imidlertid var ingen effekt på migration af CMT-W2M celler bemærket, selv om en lille nedgang blev observeret (figur 4A).

(A) Kvantificering af migration af undersøgte cellelinjer (CMT-W1, CMT-W1M , CMT-W2, CMT-W2M) præsenteres som Relativ florescent Units (RFU) opnået ved hjælp af fluorescerende plade-læser Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em. 530). Behandlingen af ​​cancerceller med MGSTA-5 og MGSTA-6 i 20 timer ved koncentrationen på 100 uM faldt migration gennem membranen af ​​CMT-W1, og CMT-W1M celler og næsten fuldstændigt ophævet migration af CMT-W2-celler. I CMT-W2M cellelinie de forbindelser var ineffektive. Eksperimentet blev udført tre gange. Den statistiske analyse blev udført ved anvendelse Prism 5.00 software (GraphPad Software, USA). Envejs ANOVA efterfulgt af Tukey HSD post-hoc test og uparret t-test blev anvendt. p 0.05 blev markeret som *, p 0.001 blev markeret som ***. (B) mikrografier af de migrerede CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2 celler taget med Olympus mikroskopi BX60 på x4 forstørrelse.

kræftcelle invasion assay blev udført kun med de mest potente analog af migrastatin (MGSTA-6). Invasivitet af CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2 hunde cancercellelinier blev signifikant reduceret med denne forbindelse indgivet i en koncentration på 100 uM i 24 timer. Fluorescensintensiteten relateret til de invaderede CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2-celler i kontrolbetingelser var 11 ± 1,7, 9,7 ± 0,6, og 11,4 ± 1,5 henholdsvis (figur 5A). Indgivelse af MGSTA-6 faldt invasivitet af cancerceller. Den fluorescens intensitet relateret til de invaderede CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2-celler var 6,7 ± 0,6, 6,6 ± 0,6, 7,3 ± 0,7 (p 0,005). Invasionen af ​​CMT-W2M celle blev ikke påvirket af MGSTA-6. Den mikroskopiske analyse udført ved hjælp af fluorescens mikroskopi bekræftede de opnåede resultater (figur 4B og 5B).

(A) Kvantificering invasiv af undersøgte cellelinier (CMT-W1, CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W2M ) præsenteres som Relativ Florescent Units (RFU) opnået ved hjælp af fluorescerende plade-læser Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em.530). Behandlingen af ​​cancerceller med MGSTA-6 i 24 timer ved koncentrationen på 100 uM faldt invasivitet gennem membranen forud belagt med Matrigel ™ Matrix, CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W1M celler. I CMT-W2M cellelinje MGSTA-6 var ineffektiv. Eksperimentet blev udført tre gange. Den statistiske analyse blev udført ved anvendelse Prism 5.00 software (GraphPad Software, USA). Envejs ANOVA efterfulgt af Tukey HSD post-hoc test og uparret t-test blev anvendt. p 0.05 blev markeret som *. Eksperimentet blev udført tre gange. Eksperimentet blev udført tre gange. Eksperimentet blev udført tre gange.