PLoS ONE: Oct-4 Expression Vedligeholdt Cancer Stem-lignende egenskaber i Lung Cancer-Derived CD133-positive Cells

Abstrakt

CD133 (prominin-1), en 5-transmembrant glycoprotein, er for nylig blevet anset for at være en vigtig markør, der repræsenterer delmængde population af cancer stamceller-lignende celler. Heri beskrives isoleringen af ​​CD133-positive celler (LC-CD133

+) og CD133-negative celler (LC-CD133

-) fra vævsprøver af ti patienter med ikke-småcellet lungecancer (LC) og fem LC cellelinier. LC-CD133

+ vises højere Oct-4 udtryk med evnen til at forny sig selv og kan repræsentere et reservoir med proliferativ potentiale for at skabe lungecancerceller. Desuden LC-CD133

+, i modsætning til LC-CD133

-, meget co-udtrykte flere resistente markør ABCG2 og viste signifikant resistens over for kemoterapeutiske stoffer (dvs. cisplatin, etoposid, doxorubicin og paclitaxel) og strålebehandling. Behandlingen af ​​Oct-4 siRNA med lentiviral vector specifikt kan blokere evnen til LC-CD133

+ for at danne sfærer og kan yderligere lette LC-CD133

+ for at differentiere til LC-CD133

-. Desuden knock-down af OLT-4-ekspression i LC-CD133

+ kan i væsentlig grad hæmme evner tumor invasion og kolonidannelse og øge apoptotiske aktiviteter af caspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Endelig

in vitro

in vivo

undersøgelser bekræfter yderligere, at behandlingseffekten af ​​kemo- og stråleterapi for LC-CD133

+ kan forbedres ved behandling af OLT-4 siRNA. Afslutningsvis viste vi, at Oct-4 udtryk spiller en afgørende rolle i at bevare selvfornyende, cancer stamceller-lignende, og chemoradioresistant egenskaber af LC-CD133

+. Fremtidig forskning er berettiget med hensyn til opreguleret ekspressionen af ​​Oct-4 i LC-CD133

+ og ondartet lungekræft

Henvisning:. Chen YC, Hsu HS, Chen YW, Tsai TH, hvordan CK, Wang CY, et al. (2008) Oct-4 Expression Vedligeholdt Cancer Stem-lignende egenskaber i Lung Cancer-Afledte CD133-positive celler. PLoS ONE 3 (7): e2637. doi: 10,1371 /journal.pone.0002637

Redaktør: Ming Du, Washington University, USA

Modtaget: Marts 17, 2008; Accepteret: 8 juni 2008; Udgivet: 9 juli 2008

Copyright: © 2008 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af forskningsbevillinger fra National Science Council (NSC-96-3111-B-075-001-MY3, 95-2314-B-075-055-MY2, 96-2628-B-010-006-MY3, 96 -2314-B-075-024), Taipei Veterans General Hospital (V96C1-151, V96E1-004, V96ER2-016, V96E2-010), Joint Projekter af UTVGH (VGHUST96-P1-07), Yen-Tjing-Ling Medical Foundation, Taipei City Hospital (96001-62-014, 96001-62-018, 96002-62-092), og National Yang-Ming University (Undervisningsministeriet, Sigt efter Top University Plan), Taiwan.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald i industrialiserede lande [1], [ ,,,0],2]. Strålebehandling og kemoterapi spille betydelige og afgørende roller i klinisk anti-lungekræft behandling for at opnå forlænget patientoverlevelse [3], [4]. Men en høj dumpeprocent og lav median overlevelse hos patienter, der gennemgår kemostråleterapi med tilbagevendende, umedgørlig lungekræft [5]. At forbedre patientens overlevelsesraten, til undersøgelse belyse mekanismen i er behov tumorigenesis for lungekræft [5]. Nylige data har påvist, at tumorer indeholder en lille subpopulation af celler, dvs. cancer stamceller-lignende celler (CSCS) eller cancer-initierende celler (CICS), som udviser en selvfornyende kapacitet og er ansvarlige for tumor vedligeholdelse og metastase [6] . Stamceller er blevet isoleret ved deres evne til udstrømning Hoechst 33342 farvestof og betegnes som “side befolkning (SP)” [7]. Ho og kolleger isoleret og karakteriseret SP-celler fra seks humane lunge cancercellelinjer og viste, at en forhøjet ekspression af ABCG2 samt andre ATP-bindende kassette transportører var positivt korreleret med resistens over for flere kemoterapeutiske lægemidler [8]. Desuden Gutova og kolleger har renset uPAR-positive CSCS fra tre lunge kræft cellelinier. Disse uPAR-positive celler co-udtrykkes med CD44 og MDR1, og havde evnen til at fremme avanceret malignitet og kemoresistens [9].

CD133 (prominin-1), en 5-transmembrant glycoprotein, blev først anerkendt i CD34

+ progenitorpopulationer fra voksen blod, knoglemarv og føtale leverceller [10]. For nylig CD133 er blevet betragtet som en vigtig markør for at repræsentere delmængde population af CSCS i leukæmi, hjernetumorer, retinoblastoma, renale tumorer, pancreas tumorer, coloncarcinom, prostatacarcinom, og hepatocellulært carcinom [11] – [19]. Baseret på immunohistokemiske resultater, Hilbe og kolleger foreslog, at CD133-positive (CD133

+) progenitorceller spiller en rolle i udviklingen af ​​tumorvaskulatur i patienter med ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) [20]. For nylig, en veltilrettelagt undersøgelse fra Eramo og kolleger viste, at lungekræft indeholder en population af CD133

+ CSCS stand til at forny sig selv og generere en ubegrænset afkom af ikke-tumorigene celler. Disse CD133

+ -celler er også resistente over for konventionel kemoterapi [21]. Men gen reguleringsmekanismer i at opretholde selv-fornyelse og resistente egenskaber i formodet cancer stamceller-lignende celler i lunge tumorer er stadig uklart.

Oct-4, et medlem af familien af ​​POU-domænet transkriptionsfaktorer, er udtrykt i pluripotente embryonale stamceller (ES) og kønsceller [22] – [23]. Oct-4 mRNA findes normalt i totipotente og pluripotente stamceller pregastrulation embryoner [24]. Knocking ud

Oct-4

genet i mus forårsager tidlig letalitet på grund af mangel på ICM dannelse, hvilket indikerer, at oktober-4 har en kritisk funktion for selvfornyelse af ES-celler [25]. Oct-4 aktiverer transskription via octamer motiver, og okt-4 bindingssteder er blevet fundet i forskellige gener, herunder

FGF 4

(fibroblast vækstfaktor 4) og

PDGF

α

r

(blodpladeafledt vækstfaktor α receptor) [26], [27]. Dette antyder, at Oct-4 fungerer som en hovedafbryderen under differentiering Ved at regulere pluripotente potentialer fra stamceller, og Oct-4 spiller en central rolle i pattedyrs udvikling [24], [25].

I denne undersøgelse, CD133-positive celler (LC-CD133

+) og CD133-negative celler (LC-CD133

-) blev isoleret fra vævsprøver af lungecancer (LC) patienter og LC cellelinier. Disse LC-CD133

+ -celler besad begge karakteristika stamceller-lignende celler og maligne tumorer. Vores data viste endvidere, at Oct-4-ekspression i LC-CD133

+ er involveret i tumor malignitet af lungekræft og udviser ildfaste egenskaber for kemo- og stråleterapi i cancer stamceller-lignende celler. Disse resultater antydede, at ekspressionen af ​​Oct-4 spiller en afgørende rolle i opretholdelsen cancerstamceller-lignende og chemoradioresistant egenskaber i lungecancer-afledte CD133

+ -celler.

Materialer og metoder Salg

Isolering af CD133

+ Cell Subset

Denne forskning fulgte læresætninger Helsinki-deklarationen, og alle prøver blev opnået efter patienterne forudsat informeret samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional etiske komité /Institutional Review Board of Taipei Veterans General Hospital. De dissocierede celler fra prøver af ikke-små patienter celle lungecancer (tabel 1) og de lungecancer (LC) cellelinier blev mærket med 1 ml CD133 /l micromagnetic perler per 1 million celler ved anvendelse af CD133 celleisolering kit (Miltenyi Biotech , Auburn, CA). CD133

+ -celler blev dyrket i et medium bestående af serum-frit DMEM /F12 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), N2 supplement (R . D Systems) [28]

Cell levedygtighed Bestemt af kolorimetrisk analyse

Den isolerede CD133

+ og CD133

– celler blev dyrket i en 96-brønds cellekultur klynge (Corning Costar, Acton, MA) ved en densitet på 3 x 10

3 celler /brønd med 100 pi dyrkningsmedium. På specifikke tidspunkter under dyrkning blev mediet fjernes og erstattes med et tilsvarende volumen (100 pi) frisk medium indeholdende 0,2 mg /ml 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl ) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS, Promega, Madison, WI) og 0,038 mg /ml phenazinmethosulfat (PMS; Promega) og inkuberet i yderligere 1,5 timer i 37 ° C 5% CO

2. Cellelevedygtighed forhold til optisk densitet (OD) blev målt ved kolorimetrisk assay i form af mitokondrier til at omdanne tetrazoliumsalt til et farvet opløseligt formazan produkt i mediet. OD-værdierne blev målt ved bølgelængden 490 nm med en 1420 multilabel counter VICTOR fra Wallac (PerkinElmer Wallac, Turku, Finland).

Real-time Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

for real-time RT-PCR-analyse, det totale RNA af celler blev ekstraheret ved anvendelse af RNA

nem kit (Qiagen, Valencia, CA). Kort fortalt blev det totale RNA (1 ug) af hver prøve modsat transkriberes i 20 pi under anvendelse af 0,5 ug af oligo dT og 200 U Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Amplifikationen blev udført i et samlet volumen på 20 pi indeholdende 0,5 uM af hver primer, 4 mM MgCl

2, 2 pi LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) og 2 pi 1: 10 fortyndede cDNA. Den kvantificering af de ukendte prøver blev udført af LightCycler Relativ Kvantificering Software version 3.3 (Roche Diagnostics). I hvert forsøg blev GAPDH housekeeping-genet amplificeret som referencestandard. GAPDH primere blev udformet: GAPDH (f): GCCAAAAGGGTCATCATC (nt 448-465, GenBank deponeringsnummer NM_002046.), GAPDH (r): ATGACCTTGCCCACA GCCTT (nt 745-765), Oct-4a (f): CGCAAGCCCTCATTTCAC (nt 5- 22, GenBank ingen NM_002701), okt-4a (r):. CATCACCTCCACCACCTG (nt 98-115, GenBank ingen NM_002701).. PCR-reaktioner blev fremstillet in duplo og opvarmet til 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, annealing ved 55 ° C i 5 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 20 sekunder. Alle PCR-reaktioner blev udført i dobbeltbestemmelse. Standard kurver (cyklus tærskelværdier versus skabelon koncentration) blev forberedt til hvert mål gen og for den endogene reference (GAPDH) i hver prøve.

immunofluorescensfarvning for Stamcelleforskning Markers

En avidin-biotin kompleks metode blev anvendt til immunfluorescensfarvning i differentierede sfæroid og neuronal-lignende celle. Kort fortalt blev celler udpladet på poly-L-ornithin-overtrukne dækglas og fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 til 20 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev vasket to gange (10 minutter hver) med 1 × PBS. Celler blev permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 /PBS i 10 minutter ved stuetemperatur og derpå to gange (10 minutter hver) med 1 × PBS. Cellerne blev derefter blokeret med blokerende opløsning i 30 minutter og blev inkuberet med primære antistoffer (okt-4, Chemicon, Temecula, CA) i 1 time ved stuetemperatur. Vi derefter vasket cellerne tre gange (10 minutter) med 1 × PBS. Immunreaktive signaler blev detekteret med en blanding af biotinyleret kanin anti-muse IgG og Fluorsave (Calbiochem, San Diego, CA). Celler blev yderligere undersøgt med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket sekundære antistoffer. Fluorescensbilleder blev visualiseret med et fluorescensmikroskop. Til kvantitativt analysere fluorescensintensitet, indspillede vi billeder med et omvendt fluorescensmikroskop udstyret med et CCD-kamera. Procentdelen af ​​signal fluorescens pr fotograferede område blev analyseret ved billedbehandling software (Image Pro-Plus, MediaCybernetics, Inc., Silver Spring, MD).

FACS analyse

For celleoverflademarkøren identifikation en enkelt cellesuspension af sixth- til ottende passage celler fra trypsinerede kugler blev farvet med anti-CD133, CD117 (c-Kit), eller ABCG2 og sekundær fluorescein (FITC) -OR phycoerythrin (PE) -coupled antistoffer (Dako, Carpinteria). Cellerne blev fikseret med 2% paraformaldehyd og blev analyseret med en BD FACSCalibur apparat (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).

Stråling behandling for Cell Levedygtighed Analyse

gammastråling ( ioniserende stråling, IR) blev leveret af en Theratronic kobolt enhed T-1000 (Theratronic International, Inc., Ottawa, Canada) ved en dosis på 1.1Gy /min (SSD = 57.5cm). At evaluere celleproliferation satsen vi podet celler på plader med 24 brønde i en densitet på 2 x 10

4 celler /brønd. Celler blev podet 24 timer efter IR og derefter blev de analyseret ved methyle thiazol tetrazolium assay (MTT-assay, Sigma-Aldrich, St. Louis, MN). Mængden af ​​MTT formazon produkt blev bestemt ved anvendelse af en mikropladelæser, og absorbansen blev målt ved 560 nm (SpectraMax 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

kemoterapeutiske midler Salg

Cisplatin, etoposid (VP16), og paclitaxel blev opnået fra Sigma-Aldrich og blev opløst i DMSO (Sigma-Aldrich) ved 100 mM stamopløsning.

In vitro

Cell invasion Analyse og blød agar Colony assay

24-brønds plade Transwell system med et 8-um porestørrelse polycarbonat membranfilter (Corning Costar, Corning, NY) blev anvendt. Filtermembranen blev coatet med Matrigel (BD Biosciences, San Diego) fortyndet med serumfrit medium og inkuberet natten over ved 37 ° C. Cellesuspensionerne blev podet til det øvre rum af Transwell kammer ved celledensiteten af ​​1 × 10

5 i 100 pi serumfrit medium. Efter 24 timer blev mediet fjernet og filtermembranen blev fikseret med 4% formalin i 1 time. Den modsatte overflade af filtermembranen vender det nedre kammer blev farvet med Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) i 3 minutter og de migrerede celler blev derefter visualiseret under et omvendt mikroskop. Protokollen for blød agar koloni assay er beskrevet som følger. Hver brønd (35 mm) af en seks-brønds dyrkningsplade blev coatet med 2 ml bottom agar blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,6% (w /v) agar). Efter det nederste lag størknet, 2 ml topagar-medium blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,3% (w /v) agar) indeholdende 2 × 10

4-celler blev tilsat, og Skålene var inkuberet ved 37 ° C i 4 uger. Plader blev farvet med 0,5 ml 0,005% krystalviolet i 1 time og derefter et dissektionsmikroskop blev anvendt til at tælle antallet af kolonier [29].

Lentiviral-medieret RNAi

pLVRNAi vektor og pCDH-MCS1-EF1-copGFP vektoren blev købt fra Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA). Fremgangsmåden til kloning af dobbeltstrenget shRNA sekvens er beskrevet i fabrikantens protokol. SiRNA oligonukleotid 5′-CCGGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCGAGTACAGTGC AGTGAAGTGAGGGTTTTT-3 ‘targeting human Oct-4 (NM_002701, nt 1035-1055) blev syntetiseret og klonet ind pLVRNAi at generere en lentiviral ekspressionsvektor. OLT-4-cDNA blev opformeret og oprenset ved RT-PCR og klonet ind i en pCDH-MCS1-EF1-copGFP vektor. Lentiviral produktion blev udført ved transfektion af 293T-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen). Supernatanter blev opsamlet 48 timer efter transfektion og blev derefter filtreret; de virale titere blev derefter bestemt ved FACS ved 48 timer efter transduktion. Subkonfluente celler blev inficeret med lentivirus ved en infektionsmultiplicitet på 5 i nærvær af 8 ìg /ml polybren (Sigma-Aldrich).

In vivo

Analyse af tumorvækst og metastase

Alle procedurer, der involverer dyr var i overensstemmelse med de institutionelle dyrevelfærd retningslinjer for Taipei Veterans General Hospital. 1000, 3000, og 10

4-celler blev injiceret i halevenen af ​​SCID-mus og /eller nøgne mus (BALB /c-stammen), der hver i alderen 8 uger. In vivo GFP imaging blev visualiseret og målt ved Lygten (LT-9500 Illumatool TLS udstyret med excitation lysende kilde [470 nm] og filter plade [515 nm]). Tumorstørrelsen blev målt med passere og tumorvolumenet blev beregnet ifølge formlen (længde x bredde

2) /2. Den integrerede optiske densitet af grøn fluorescens intensitet blev fanget og derefter analyseret ved Image Pro-plus-software [29].

Statistisk analyse

Statistisk Package of Social Sciences software (version 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) blev anvendt til statistisk analyse. Den uafhængige Students

t

-test eller ANOVA blev anvendt til at sammenligne de kontinuerlige variabler mellem grupperne, mens χ

2 test blev anvendt til sammenligning af dikotome variabler. Kaplan-Meier estimat blev anvendt for overlevelse analyse, og log-rank testen blev anvendt til at sammenligne de kumulative overlevelse varigheder i forskellige patientgrupper. Niveauet af statistisk signifikans blev sat til 0,05 for alle tests.

Resultater

Isolering og karakterisering af Lung Cancer-afledte CD133-positive celler

Brug af magnetisk perle metode, isolerede vi CD133

+ celler (fig. 1A) fra vævsprøver af ti ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter (tabel 1) og fem lungecancer (LC) cellelinier (tabel S1). Den høje procentdel (97%) af CD133

+ (LC-CD133

+) delmængde blev isoleret i LC væv og parental LC-cellelinie (fig. 1A). Det er blevet rapporteret, at cancer stamceller-lignende celler kan dyrkes i suspension for at generere flydende sfæroide-lignende organer (SB) under serum-frit medium med bFGF EGF [30]. Vi fandt, at LC-CD133

+ isoleret fra disse ti patienter (tabel 1) og fem LC cellelinier (Tabel S1) kan danne SB i DF-12 serumfrit medium med bFGF og EGF (Figur 1B;. No. 1 [PLC] og No.2 [LLC]). (. Figur 1D) Endvidere evnen til at danne SB (. Figur 1C) og proliferationshastighed i LC-CD133

+ var signifikant højere end i LC-CD133

– (p 0,05). Desuden at bestemme

in vivo

tumorigen aktivitet af LC-CD133

+ og LC-CD133

– injicerede vi respektive mængder på 1000, 3000, og 10

4 celler til halevener SCID-mus. Resultaterne viste, at 10

4 LC-CD133

– inducerede ikke tumordannelse, men 3.000 LC-CD133

+ fra lungekræft væv af ti patienter og fem LC cellelinier i xenotransplanted mus kan alle generere synlig tumorer 4 uger efter injektion (tabel 1 og tabel S1).

(a) Brug en magnetisk perle metode, vi sorteret CD133

+ -celler fra vævsprøver fra patienter med lungecancer (LC), og kendetegnet dem ved FACS-assay. (B) LC-CD133

+ sorteret fra to patient med No.1 (PLC-CD133

+) og No.2 (LLC-CD133

+) blev dyrket i bFGF og EGF med DMEM serum- frit medium. (C) Evaluering af dannelsen evner sfæroid-lignende organer (SB) fra LC-CD133

+ og LC-CD133

– under serum-frit medium med bFGF EGF. (D) De vækstkurver LC-CD133

+ og LC-CD133

– blev målt ved hæmocytometer. Bar: 100 um. Data, der vises her, er middelværdien ± SD af tre eksperimenter.

Øget ABCG2 Expression og invasive evne LC-CD133

+

In Vitro

Til karakterisere vores isoleret LC-CD133

+, FACS-analyse blev anvendt til at detektere ekspressionen profilen af ​​celler overflademarkører. Som vist i figur 2A, at størstedelen af ​​isolerede LC-CD133

+ blev farvet med højere ekspressionsniveauer af CD133, CD117 (c-Kit), og ABCG2 sammenlignet med LC-CD133

-. Dette resultat viste, at isolerede LC-CD133

+ var næsten ABCG2-positive celler (fig. 2B). For yderligere at evaluere forbedringen af ​​tumorgenicitet af LC-CD133

+, vi undersøgte

in vitro

Matrigel-kombineret Transwell invasion og bløde agar koloni dannelse analyser. Sammenlignet med LC-CD133

-, LC-CD133

+ stammer fra NSCLC patienter No.1 (PLC) og No. 2 (LLC) viste højere invasion aktivitet gennem Matrigel Transwell invasion assay (

p

0,001;. figur 2C). Tilsvarende foci dannelse evne LC-CD133

+ fra PLC (No.1) og LLC (No.2) blev forøget i forhold til den LC-CD133

– disse to patienter (

s

0,001;. figur 2D)

(A) og (B) ekspressionsniveauerne for CD133, CD117 (c-Kit), og ABCG2 blev analyseret ved FACS analyse i LC-CD133

+ og LC-CD133

-. De kapaciteter (C) migreringen /invasion og (D) tumoren foci (blød agar koloni) dannelse i LC-CD133

+ var signifikant forøget sammenlignet med LC-CD133

– (*

p

0,001). Data, der vises her, er middelværdien ± SD af tre eksperimenter.

Øget

In Vivo

Tumor-restaurering og proliferativ Evne i LC-CD133

+

Vi yderligere evaluerede

in vivo

tumor-restaurering og proliferative evne LC-CD133

+ og LC-CD133

– ved xenotransplanted tumorigenicitet analyse (. figur 3A). Fire uger efter 10

4-celler blev injiceret i halevenerne af SCID-mus, en betydelig stigning i de multiple noduler af tumordannelse på lungeoverfladen blev bemærket i LC-CD133

+ -. Injicerede gruppe (fig 3A4 3A7), men ikke i LC-CD133

– gruppe (figur 3A1).. blev observeret Diffuse infiltrationer af LC-CD133

+ fra lungeparenkymet til den alveolære hulrum (fig. 3A5, 3A6, 3A8 og). Den histologiske undersøgelse viste, at den fremtrædende neovaskularisering og thrombedannelse blev detekteret i pulmonale parenkym af LC-CD133

+ – injicerede SCID-mus (figur 3A9.). I modsætning hertil blev der ingen signifikant tumorfoci eller neovaskulær formation findes i lungerne af LC-CD133

– injicerede SCID-mus (fig 3A2 3A3.). Vi undersøgte endvidere

in vivo

tumor vækst i 10

4 LC-CD133

+ celler, 10

6 LC-CD133

– celler, og 5 x 10

6 forælder tumorceller fra den samme patient. Konstateringen viste, at tumor vækst i 10

4 LC-CD133

+ gruppe (fra patienter No. 1, 2, 4 og 7, tabel 1) var signifikant højere end for 10

6 LC-CD133

– gruppe og 5 x 10

6 forældrenes tumor celle gruppe (figur 3B.). Desuden 10

4 LC-CD133

+ isoleret fra sekundære tumorer kan yderligere skabe nye (anden) tumorer fra transplanterede SCID-mus. Resultater af flowcytometri viste, at en høj procentdel (60%) af CD133-positive celler blev påvist i den anden tumor (fig. 3C). Desuden tusind LC-CD133

+ isoleret fra den anden tumor kan også generere en ny (tredje) tumor i transplanterede SCID-mus (fig. 3C). Sammenfattende, angivet vores data, at LC-CD133

+ nuværende selvfornyende og genoprettelse af bestanden kapaciteter både

in vitro

in vivo

.

(A) De i

n vivo

tumorgenicitet af LC-CD133

+ og LC-CD133

– i halevenen-injicerede mus blev analyseret ved makroskopisk og histologisk undersøgelse. A1-3: LC-CD133

-; pile: normal alveolær struktur lunge. A4-6: LC-CD133

+; pile: tumor formation. A7-9: LC-CD133

+; Pile: karrigdom og trombose. Bar: 200 um. (B)

in vivo

tumor-restaurering og proliferative evne 10

4 LC-CD133

+, 10

5 LC-CD133

– og 5 x 10

5 af total tumorceller fra patient No. 1, 2, 4, og 7 blev undersøgt ved xenotransplanted tumorigenicitet analyse. (C) Den tumorrepopulation evne LC-CD133

+ blev undersøgt i transplanterede SCID-mus. Ekspressionsniveauerne af CD133 blev bestemt ved FACS-analyse fra primær LC-CD133

+, andet tumor, og tredje tumor. Data, der vises her, er middelværdien ± SD af tre eksperimenter

Forbedret kemo- og Stråling-resistens i LC-CD133

+

Vi evaluerede multistof (kemoterapi). – resistente evner LC-CD133

+ og LC-CD133

-. Vi yderligere testet fire fælles kemoterapeutiske midler, herunder cisplatin, VP16 (etoposid), doxorubicin, paclitaxel. Sammenlignet med LC-CD133

-, LC-CD133

+ er betydeligt resistente over for de fire testede kemoterapeutika (

s

0,01, Fig 4A.). For yderligere at bestemme stråling effekt på hastigheden af ​​tumorvækst, vi brugte en ioniserende stråling (IR) dosis mellem 0 og 10 Gy for at behandle både LC-CD133

+ og LC-CD133

-. Som vist i fig. 3B, efter IR behandling, overlevelsesraten og antallet af LC-CD133

+ var betydeligt højere end LC-CD133

– (

s

0,01). Vi fandt endvidere, at LC-CD133

+ celler besidder en højere grad af radioresistance (

s

0,01;. Figur 4B). Desuden har vi undersøgt den kombinerede behandling effekt af radiochemotherapy i LC-CD133

+. Eksperimenter blev udført med cisplatin (10 uM) alene, VP-16 (10 uM) alene, eller kombineret cisplatin og VP-16 på IR (2 Gy) -behandlede LC-CD133

+. Som vist i figur 3C, afslørede dataene, at cellen overlevelsesrate i IR-behandlede LC-CD133

+ blev ikke signifikant reduceret med IR behandling kombineret med cisplatin, med eller uden VP-16 (

s

0,05). Tværtimod celleoverlevelse faldet markant efter kemoterapi med cisplatin kombineret med VP-16 i IR-behandlet LC-CD133

– (

s

0,01, Fig 4C.). Disse resultater tyder på, at LC-CD133

+ kan spille en afgørende rolle i tumor evne til at modstå stråling og kemoterapi.

(A) Både 10.000 LC-CD133

+ og LC-CD133

– blev udpladet i en 96-brønds plade og behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin, VP-16, doxorubicin, og paclitaxel i 24 timer i 10% FBS /DMEM /F-12 medium. Overlevelsesraten blev bestemt ved MTT-assayet. (B) For at bestemme strålingens virkning på tumoren væksthastighed, en ioniserende stråling (IR) dosis mellem 0 og 10 Gy blev anvendt til behandling LC-CD133

+ og LC-CD133

-. *

s

0,01: LC-CD133

+ sammenlignet med LC-CD133

-. (C) Den kombinerede behandling effekt af radiochemotherapy i LC-CD133

+ og LC-CD133

– blev yderligere vurderet. Den fire protokoller-stråling (2 Gy) udelukkende, stråling med cisplatin (10 uM), stråling med VP-16 (10 uM), og stråling med paclitaxel (10 nM) -were anvendt. *

s

0,01. Data, der vises her, er middelværdien ± SD af tre eksperimenter.

rolle Oct-4 Expression i LC-CD133

+

Microarray resultater antydede, at ekspressionsniveauet af OLT -4 selvfornyelse og stemness gen i LC-CD133

+ var signifikant opreguleret end i LC-CD133

-. For at validere dette fund undersøgte vi ekspressionen af ​​Oct-4 både transkriptionelt og translationelt. Mængderne af Oct-4 udskrift og protein af isolerede LC-CD133

+ (Patienter No.1 [PLC] og No.2 [LLC]) var signifikant forøget sammenlignet med de LC-CD133

– ved real -tid RT-PCR og western blotting-analyse (fig. 5A og 5B). For at undersøge om Oct-4 udtryk spiller en rolle i at opretholde selv-fornyelse eller cancer stamceller-lignende egenskaber i LC-CD133

+, vi brugte siRNA metoden med lentiviral vektor til knockdown af OLT-4-ekspression i LC-CD133

+. Vi fandt det vigtigt, at behandlingen af ​​OLT-4 siRNA i LC, CD133

+ kan forstyrre betydeligt med mulighederne i sfæroid-lignende organer (SB) dannelse (

s

0,001;. Fig 5C ). Efter 7 dage i oktober-4 siRNA behandling, kunne SB af LC-CD133

+ ikke opretholde flydende kugler, men differentieret i vedhæftede epitel-lignende celler (Fig. 5C). I modsætning hertil behandling af scramble kontrol siRNA ikke påvirke SB dannelse kapacitet i LC-CD133

+ (fig. 5C). SB af LC-CD133

+ udtrykte endogent stærke positive signaler for Oct-4 og CD133 (fig. 5D). Endvidere immunfluorescerende resultater viste, at både CD133 og Oct-4 udtryk i LC-CD133

+ var signifikant blokeret efter 7 dages Oct-4 siRNA behandling (fig. 5D). FASC assay bekræftede, at mængden af ​​CD133 dramatisk blev nedsat i okt-4 siRNA-behandlet LC-CD133

+ og de procentdele af LC-CD133

– blev forøget betydeligt i LC-CD133

+ efter 7 dage af OLT-4 siRNA behandling (

s

0,001;. figur 5E). Disse data antydede, at Oct-4 kan opretholde egenskaberne for primitive stamceller og hæmmer tendensen til differentiering i LC-CD133

+.

(A) Størrelsen af ​​okt-4 udskrifter af isolerede LC CD133

+ var signifikant forøget sammenlignet med dem af LC-CD133

– ved real-time RT-PCR-analyser. (B) Vestlige Blott data viste, at protein niveauer af Oct-4 i LC-CD133

+ isoleret fra PLC og LLC blev også signifikant opreguleret sammenlignet med dem af LC-CD133

-. (C) Proteinet udtryk for Oct-4 i LC-CD133

+ blev effektivt blokeret af oktober-4 siRNA. Behandling af OLT-4 siRNA i LC, CD133

+ kan hæmme mulighederne i SB dannelse og yderligere lette SB til at differentiere til vedhæftede epitel-lignende celler. Bar: 100 um. (D) Ved at bruge immunfluorescensfarvning viste vi, at protein ekspressionsniveauerne af både Oct-4 og CD133 i LC-CD133

+ blev formindsket markant efter Oct-4 siRNA behandling. Bar: 30 pm. (E) Andelen af ​​LC-CD133

– blev forøget betydeligt i oktober-4 siRNA-behandlet LC-CD133

+ ved FACS-analyse. *

s

0,001. Data, der vises her, er middelværdien ± SD af tre eksperimenter.

Forbedret Chemoradiotherapeutic Følsomhed og apoptotiske aktivitet i LC-CD133

+ Behandlet af oktober-4 siRNA

For yderligere undersøgelse rolle Oct-4 i tumor malignitet af LC-CD133

+

in vitro

blev migrationen /invasive og blød agar koloni assay anvendes. Resultaterne viste, at de evner af

in vitro

vandrende invasion og kolonidannelse i LC-CD133

+ behandlet af Oct-4 siRNA blev signifikant reduceret sammenlignet med ikke-behandlede LC-CD133

+ eller LC-CD133

+ behandlet med scramble-siRNA (kontrol;

s

0,001;. figur 6A). Desuden behandlingseffekten af ​​kemo- og stråleterapi for LC-CD133

+ gruppe kan forbedres betydeligt ved behandlingen af ​​OLT-4 siRNA sammenlignet med ikke-behandlede LC-CD133

+ eller LC-CD133

+ behandlet ved scramble-siRNA (figur 6B;.

s

0,001). Desuden fandt vi, at de apoptotiske aktiviteter annexin V (Fig 6C.) Og caspase 3 (fig 6D;. Øverste del) hurtigt og effektivt blev induceret i LC-CD133

+ behandles med Oct-4 siRNA efter 72 timer . I overensstemmelse med resultatet af celle overlevelse og behandlingseffekt i oktober-4 siRNA-behandlet LC-CD133

+ (fig. 6B), Western Blot data yderligere påvist, at mængden af ​​aktiveret (spaltet) form for PARP var konsekvent forhøjet i LC-CD133

+ behandlet af Oct-4 siRNA med IR alene eller kombineret med kemoterapi (figur 6D;. nederste del). Således knockdown af OLT-4-ekspression i LC-CD133

+ effektivt kan forbedre chemoradiosensitivities og apoptotiske aktiviteter som reaktion på IR og kemoterapi, hvilket tyder på, at Oct-4 kan være en afgørende faktor muliggør LC-CD133

+ til at modstå