PLoS ONE: Den kliniske betydning af MIR-148a som Predictive Biomarkør i patienter med fremskreden kolorektal cancer

Abstrakt

Sigt

Udvikling af robuste prognostiske og /eller prædiktive biomarkører hos patienter med kolorektal cancer (CRC) er afgørende for at fremme behandlingsstrategier for denne sygdom. Vi havde til formål at afgøre, om udtryk status af visse miRNA kan have prognostisk /prædiktiv værdi i CRC patienter behandlet med konventionelle cytotoksiske kemoterapi.

Metoder

Vi studerede en kohorte af 273 CRC prøver fra fase II /III patienter behandlet med 5-fluorouracil adjuverende kemoterapi og fase IV patienter udsat for 5-fluorouracil og oxaliplatin kemoterapi. I en screening sæt (n = 44), blev 13 ud af 21 kandidat miRNA held kvantificeret ved multipleks kvantitativ RT-PCR. I valideringen bestående af hele patientens kohorte blev miR-148a udtryk status vurderet ved kvantitativ RT-PCR, og dets promotor methylering blev kvantificeret ved bisulfit pyrosekventering. Endelig vi analyserede sammenhængen mellem miR-148a udtryk og tålmodig overlevelse.

Resultater

Blandt kandidatlandene miRNA undersøgte, miR-148a udtryk var mest markant nedreguleret i avancerede CRC væv. I fase III og IV CRC, blev lav miR-148a udtryk forbundet med væsentligt kortere sygdomsfri overlevelse (DFS), en værre terapeutisk respons, og dårlig samlet overlevelse (OS). Endvidere MIR-148a methyleringsstatus korreleret omvendt med dets ekspression, og var forbundet med ringere overlevelse i stadium IV CRC. I multivariat analyse, miR-148a udtryk var en uafhængig prognostisk /prædiktiv biomarkør for avancerede CRC patienter (DFS i trin III, lav vs høj ekspression, HR 2,11; OS i trin IV, HR 1,93)

Diskussion.

MIR-148a status har en prognostisk /prædiktiv værdi i avanceret CRC patienter behandlet med konventionel kemoterapi, som har vigtige kliniske implikationer i forbedring af terapeutiske strategier og personlig ledelse af denne malignitet

Henvisning:. Takahashi M, Cuatrecasas M, Balaguer F, Hur K, Toiyama Y, Castells A, et al. (2012) Den kliniske signifikans af MIR-148a som Predictive Biomarkør hos patienter med fremskreden kolorektal cancer. PLoS ONE 7 (10): e46684. doi: 10,1371 /journal.pone.0046684

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: 18 juni 2012; Accepteret: 3. september 2012; Udgivet: 3 oktober 2012

Copyright: © Takahashi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende arbejde blev støttet af tilskud R01 CA72851 og CA129286 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, ved midler fra Baylor Research Institute (CRB og AG), og ved tilskud fra Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-19273), Agencia de gestio d’Ajuts Universitaris i de Recerca (2009 SGR 849, AC), og Fundación Mutua Madrileña (AP7901-2010, MC), XBTC, BT, Biobanc. MT blev delvist støttet af en bevilling fra Cell Science Research Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i øjeblikket er kolorektal cancer (CRC) patienter med lymfeknudemetastaser (TNM trin III) behandles med adjuvans kemoterapi, der omfatter cytotoksiske lægemidler, såsom 5-fluoruracil (5-FU) og oxaliplatin, efter kirurgisk resektion af kræft. Tilsvarende er patienter med fjernt metastaserende CRC (stadie IV) behandlet med forskellige kombinationer af kemoterapeutiske lægemidler og molekylært målrettet lægemidler, der omfatter anti-VEGF og anti-EGFR-antistoffer. Selv om disse behandlingsregimer har forbedret udfald hos patienter med fremskreden CRC, en betydelig andel af individer ikke drage nogen fordel af sådanne behandlinger, og nogle erfaringer værre udfald som følge af narkotika-associeret toksicitet. Der er et bydende behov for at udvikle prædiktive biomarkører, der kan vælge den undergruppe af patienter, der vil nyde godt af konventionelle kemoterapeutiske stoffer, så patienter, der ikke vil nyde godt af behandlingen kan blive sparet for lægemiddeltoksicitet og tilbudt alternative behandlinger.

Mutationer i

KRAS

er de eneste etablerede prædiktive markører for valg behandlingsstrategier i CRC. Patienter med tumorer huser mutationer i codon 12 eller 13 i

KRAS

gen ikke er omfattet af anti-EGFR-baserede medicinsk behandling [1], [2], og dermed screening for denne mutation anbefales til alle stadie IV patienter, der er kandidater til anti-EGFR-antistof-baserede medicinsk behandling. Derudover mikrosatellit instabilitet (MSI), en fænotype stede i -15% af CRCs, har vist sig at associere med forbedret samlet overlevelse (OS), uanset adjuvans kemoterapi, samt en manglende fordele ud fra 5-FU-baseret kemoterapi i stadie II patienter [3], [4]. Men om MSI har prædiktiv værdi i stadie III patienter behandlet med kemoterapi fortsat usikkert [5], [6]. Mens nogle undersøgelser har antydet, at andre molekylære markører, såsom CpG øen methylator fænotype eller ekspression status gener involveret i DNA-reparation eller lægemiddelmetabolisme (såsom

ERCC1

Tyms

) kan have potentiale som prognostiske /prædiktive markører, der er utilstrækkelige konsistente data til støtte nytten af ​​disse markører [7] – [11]. Tilsammen trods fremskridt foretaget i genomiske og epigenomic karakterisering af CRC, er der ingen

etableret

biomarkører, som pålideligt kan forudsige terapeutiske resultater fra konventionel cytotoksisk kemoterapi i patienter med stadie III eller IV CRC.

dysregulering af microRNA (miRNA) udtryk er impliceret i begyndelsen tumorigenese samt sygdomsudvikling i forskellige maligniteter [12], [13]. miRNA udøver deres onkogene og /eller tumor undertrykkende virkninger ved binding til 3′-utranslaterede regioner af mRNA, hvilket fører til undertrykkelse af oversættelse eller forøget nedbrydning af den tilsvarende meddelelse. I CRC, dysreguleret ekspression af adskillige miRNA, herunder MIR-17~92, MIR-21, MIR-31, MIR-34b /c, MIR-143, MIR-145, og MIR-203 er tidligere blevet beskrevet [14] – [17]. Da miRNA spiller en central rolle i menneskets carcinogenese er der stigende interesse for identifikation af prognostiske eller prædiktive miRNA i patienter med CRC.

Men kun en håndfuld rapporter undersøgt potentialet i miRNA (r) som prognostiske /forudsigende biomarkører i CRC. I en skelsættende undersøgelse, Schetter

et al.

Viste, at miR-21 kan være et lovende prognostisk /prædiktiv markør i trin II /III CRC behandlet med 5-FU-baseret kemoterapi [17]. Tilsvarende har en anden gruppe vist, at fase II-patienter med forhøjet ekspression af MIR-320 eller MIR-498 havde bedre tilbagefald-fri overlevelse [18]. Men prøvestørrelserne analyseret i disse undersøgelser var relativt lille, har resultaterne ikke valideret i andre undersøgelser, og der har ikke været nogen forsøg på at bestemme den prædiktive nytte af enhver miRNA i stadie IV CRC. Vi antager, at udtrykket profiler af specifik miRNA (er) kan have prognostisk og /eller prædiktiv værdi i patienter med stadie IV CRC såvel som dem med tidligere stadier. Heri, i en indledende screening skridt, der involverede analyse af 21candidate miRNAer, opdagede vi, at miR-148a ofte nedreguleres i avanceret CRC. Derefter ved at analysere et stort validering kohorte af 273 CRCs giver vi hidtil ukendt bevis for, at MIR-148a er ofte nedreguleret i denne sygdom, og dette hovedsagelig sker gennem hypermethylering af dets formodede promotorregion. Desuden viser vi, at lav miR-148a udtryk er signifikant associeret med en ugunstig resultat hos patienter med stadium III CRC behandlet med 5-FU-baseret kemoterapi og med en dårligere terapeutisk respons og overlevelse hos patienter med stadie IV CRC behandlet med 5- FU og oxaliplatin.

Patienter og metoder

Etik Statement

undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Boards (IRB) i Hospital Clinic, Barcelona, ​​Spanien, og en skriftlig informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

patienter

formalinfikseret paraffinindlejrede (FFPE) væv fra en kohorte af 273 patienter med CRC (primære tumorer fra 76 fase II, 125 fase III og 72 trin IV CRCs) og 20 vævsprøver fra normal colon mucosa af raske individer blev opnået fra Pathology Department of Hospital Clinic, Barcelona, ​​Spanien. Patienterne indgår i denne undersøgelse blev indskrevet mellem 1996 og 2008. Alle stadie II og III patienter blev behandlet med 5-FU-adjuverende kemoterapi i 6 måneder senere til tumor resektion, og alle stadie IV patienter blev behandlet med 5-FU og oxaliplatin indtil behandlingen mislykkedes. De fase II og III patienter blev fulgt op hver tredje måned i de første to år, og hvert halve år for de efterfølgende tre år. Både locoregional tilbagefald og /eller fjernmetastaser blev defineret som tumor tilbagefald, mens metachronous kolorektale læsioner ikke blev betragtet som en gentagelse. Den mediane follow-up tider er 52,2 måneder (interval; 2.9-173 måneder) i fase II og III patienter og 19,1 måneder (spændvidde, 3.7-83.7 måneder) i fase IV patienter. Blandt fase II og III patienter, 70 patienter (35%) havde tumortilbagevenden (median, 17,8 måneder, interval: 5.5-144 måneder), og medianen DFS af ikke-tilbagefald patienter var 40,5 måneder (interval; 7.5-155 måneder) . Opfølgningen af ​​patienterne blev afsluttet i november 2009. Chemotherapeutic respons i fase IV patienter blev evalueret i henhold til de svar evalueringskriterier i solide kræftsvulster (RECIST) retningslinjer [19] hver anden måned. MSI status af tumorer blev bestemt ved at analysere fem mononukleotid markører (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, og NR-24; MSI Analysis System, Promega, Madison, Wisconsin, USA). De klinisk-patologiske karakteristika patienterne er vist i tabel 1.

DNA og RNA-ekstraktion

DNA blev ekstraheret fra 10 um tykke FFPE væv under anvendelse af Qiamp DNA FFPE væv (Qiagen , Valencia, Californien, USA). Total RNA herunder miRNA fraktionen blev ekstraheret fra FFPE væv under anvendelse RECOVERALL samlede Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Inc., Austin, Texas, USA).

Multiplex kvantitativ RT-PCR

en screening sæt, der omfattede normale colon mucosa fra raske individer og 44 CRC væv (16 fase II og III hver 12 trin IV patienter), udtrykket status af 21 kandidat miRNA (MIR-9, miR-10b, miR-19a, mir -21, miR-31, miR-34a, miR-34c, miR-101, miR-103, miR-137, miR-143, miR-145, miR-148a, miR-148b, miR-152, miR-155 , miR-194, miR-320, miR-335, miR-373 og miR-519c) blev kvantificeret ved hjælp af high-throughput Fluidigm mikrostrømning dynamisk array [20]. Hver Taqman miRNA assay (. Varenr 4.427.975, Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA) blev anvendt i multipleks RT-PCR-analyse som følger: assay ID, 000.583, 002.218, 000.395, 000.397, 002.279, 000.426, 000.428, 002.253 , 000.439, 001.129, 002.249, 002.278, 000.470, 000.471, 000.475, 002.623, 000.493, 002.277, 000.546, 000.561 og 001.163 hhv. Disse kandidat miRNA har tidligere vist sig at være involveret i CRC og /eller andre menneskelige maligniteter [16], [18], [21] – [35].

Kvantificering af miRNA-ekspression af real-time RT PCR

i valideringen sæt, der omfattede hele patient kohorte, miRNA ekspression blev kvantificeret ved Taqman revers transkription-PCR (QRT-PCR) ved hjælp af en ABI 7000 afsløring sekvens-system (Applied Biosystems). Ekspressionen af ​​MIR-148a blev beregnet ved delta Ct metoden under anvendelse MIR-16 ekspression som en normalizer [36], [37]. For at holde konsekvente målinger i alle plader blev tre uafhængige RNA-prøver indlæst som interne kontroller i hver PCR-kørsel, og resultaterne fra hver plade blev normaliseret efter data fra interne kontroller.

DNA methylering analyse

DNA var bisulfit ændres ved hjælp af EZ DNA methylering Gold Kit (Zymo Research, Irvine, Californien, USA). Methylering af formodet MIR-148a promotorregion blev kvantificeret ved bisulfit pyrosekventering (PSQ HS 96A pyrosekventering systemet, Qiagen). De følgende primere blev anvendt; MIR-148a fremad, 5′-biotin-TAGGAAGGAAGGAGAGTG, MIR-148a omvendt, 5′-CCCAACAAAAATAATATTTTAACA, og MIR-148a-sekventering, 5′-CAAAAATAATATTTTAACAACC. De methylering niveauer af tre bindingssteder for CpG blev analyseret og methylering niveau for hver tumor er repræsenteret som middelværdien af ​​methylering niveauer af de tre bindingssteder for CpG. Følgende PCR-cyklus blev anvendt: indledende denaturering ved 94 ° C i 7 minutter efterfulgt af 45 cykler ved 94 ° C i 30 sek, 52 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek

In situ

hybridisering for miR-148a

In situ

hybridisering (ISH) blev udført som beskrevet af Navarro et al. [38] med mindre justeringer. En fluorescein (FITC) 5′-mærket låst nukleinsyre-inkorporeret miRNA probe (miRCURY LNA detekteringsprobe, Exiqon, Woburn, Massachusetts, USA) blev anvendt til visualisering af MIR-148a på 3 um tykke FFPE vævssnit. En forvrænget og en RNU6b sonde blev inkluderet som negative og positive kontroller, henholdsvis (Exiqon). Objektglassene blev anbragt i en ovn ved 59 ° C natten over. Snit blev afparaffiniseret med xylen, rehydratiseret med ethanol og behandlet med diethylpyrocarbonat vand i 1 minut. Kromogent ISH blev udført i en automatiseret platform Bond Max (Vision BioSystems, Norwell, Massachusetts, USA). Objektglas blev forbehandlet med protease 1 i 4 minutter ved 37 ° C. I alt 300 ul 25-nM probe blev hybridiseret i natriumchlorid, natriumcitrat hybridiseringspuffer ved 45 ° C natten over. Immunologisk detektion blev udført med et muse-anti-FITC-antistof ved 37 ° C i 60 minutter efterfulgt af en biotin-fri, polymer peberrodsperoxidase linker antistofkonjugat systemet (Tilpas Detection System, Vision BioSystems). DAB blev anvendt som kromogen og hæmatoxylin blev brugt som en kontrastfarve.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, Californien, USA) eller MedCalc v12 (MedCalc software, Belgien). Forskellene mellem to grupper blev analyseret af Mann-Whitney U-test. Korrelationsfaktorer analyser blev udført ved hjælp af Spearman rang korrelation metode. De CRC tumorer blev kategoriseret i høj og lav miR-148 udtryk, der bruger Receiver Operating Karakteristisk kurve analyse median udtryk værdier (fase IV) (fase II /III) eller. Kaplan-Meier analyse blev udført for at estimere fordelingerne af sygdomsfri overlevelse (DFS) og kræft-specifikke samlet overlevelse (OS) i fase II og III patienter, og progressionsfri overlevelse (PFS) og OS i stadie IV patienter. En log-rank testen blev anvendt til at analysere de statistiske forskelle i overlevelse som udledt fra Kaplan-Meier-kurver. Cox proportional-hazard regressionsanalyse blev udført for at beregne HR og 95% CI for hver covariable. Den endelige multivariate model var baseret på en trinvis fremgangsmåde til kliniske faktorer i forbindelse med god eller ringe overlevelse (p 0,1) i univariate modeller. For overlevelse analyse blev ensomme MSI tumor udelukkes fra stadie IV gruppen. Alle forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når p. 0,05

Resultater

miR-148a er en kandidat miRNA som ofte nedreguleret i fase III og IV CRC

i en screening sæt, vi først screenet 21 kandidat miRNA, der har været impliceret i tumorigenese, ved hjælp af Fluidigm mikrostrømning dynamisk array (n = 44; Supplerende tabel S1). Blandt de 21 miRNA analyserede, 13 miRNA held viste ekspression resulterer i den multiplekse RT-PCR. Syv miRNA demonstreret ændret væsentligt udtryk mellem normale og CRC væv. Blandt alle, kun MIR-148a afslørede en signifikant nedregulering i tumorer med lymfeknude (stadium III) eller fjernmetastaser (IV) sammenlignet med tumorer uden (II), hvilket understreger betydningen af ​​dette miRNA i CRC progression /metastase. Baseret på disse resultater, vi efterfølgende afgøres, om en miR-148a udtryk ændring i en større kohorte af CRC har nogen prognostisk /prædiktiv værdi.

I hele vores kohorte (n = 273), miR-148a udtryk i fase III /IV tumorer var signifikant lavere end ved normal colon mucosa (p 0,001; Figur 1A). Vi observerede også en tendens til gradvist at nedsætte MIR-148a-ekspression med stigende trin af CRCs (figur 1A). Mere specifikt MIR-148a ekspression i fase III og IV tumorer var signifikant lavere end ved normal colon mucosa (p 0,001), mens det ikke var signifikant forskellig mellem trin II tumorer og normale mucosale prøver (p = 0,41, figur 1A) .

A. MIR-148a ekspression i colon mucosa fra raske kontroller (NC), og i trin II, III og IV CRCs; antallet af patienter (N) og median ekspression (Median) er anført under grafen. B.

In situ

hybridisering for MIR-148a i CRC tumorer og normal slimhinde, hvori chromogenet pletter røde, og kontrastfarve blå. Repræsentative mikrofotografier er vist fra en normal colon mucosa (toppaneler), en tumor med lav MIR-148a ekspression (midterste paneler) og en tumor med høj MIR-148a-ekspression (lavere paneler) ved angivne forstørrelser. En mikrofotografi er vist fra en tumor med høj MIR-148a-ekspression under anvendelse af en scramble probe som en negativ kontrol (nederste, venstre panel). C. MIR-148a methylering niveauer i trin IV tumorer. Den formodede promotorregion af MIR-148a, og positionen af ​​Pyrosekventering primere er illustreret i toppanelet. Scatter plot af miR-148a udtryk og methylering niveauer er vist i den nederste panel. D. MIR-148a ekspressionsniveauer er vist for methylerede og ikke-methylerede CRCs i toppanelet. MIR-148a methylering niveauer er vist for tumorer med høj og lav MIR-148a ekspression i det nederste panel. En outlier værdi (methylering niveau 48%). Udelukkes fra methylerede gruppe i nederste graf

Næste, for at bekræfte tumor-specifikke udtryk mønster for miR-148a, vi udførte ISH analyse i en delmængde af fase IV tumorer med høj og lav miR-148a udtryk. Vi observerede, at udtrykket i normal colon mucosa af stadie II tumorer var høj, bekræfter QRT-PCR resultater (Figur 1B). CRCs med høj MIR-148a ekspression ved QRT-PCR udtrykte også denne miRNA primært inden cytoplasmaet af neoplastiske celler (figur 1 B), men ikke i de ikke-epiteliale stromaceller, bortset fra farvning af visse inflammatoriske celler i lamina propria, især plasmaceller. Endvidere CRCs med lav MIR-148a-ekspression bestemmes ved QRT-PCR afslørede også meget lav eller fraværende ekspression af denne miRNA på ISH niveau (figur 1B). Disse resultater viser, at vores QRT-PCR-resultater viste nøjagtigt den endogene ekspression af MIR-148a inden cancercellerne opnået fra CRC vævsprøver.

Ekspression af MIR-148a er omvendt korreleret med dets promotor status for methylering

Den formodede promotor-regionen i miR-148a steder inden en CpG ø, og methylering af disse CpG sites er blevet foreslået som en mulig mekanisme for miR-148a inaktivering i CRC og brystkræft [39] – [41]. Imidlertid har ingen af ​​tidligere undersøgelser undersøgt den direkte sammenhæng mellem MIR-148a Udtrykket og status for methylering i en stor kohorte af cancer prøver. Derfor var vi interesserede i at belyse, om den nedregulering af miR-148a observeret i vores kohorte var en konsekvens af promotor hypermethylering. Siden miR-148a blev hyppigst nedreguleret i stadie IV CRC har vi fokuseret vores methylering analyse på disse tumorer. Kvantitativ bisulfit pyrosekventering viste, at nogle stadie IV CRC’er demonstrerede miR-148a hypermethylering. De methylering niveauer varierede mellem 4-26% (median, 10%), og når status methylering af hver tumor blev sammenlignet med sin QRT-PCR-afledte udtryk status, blev der observeret en signifikant sammenhæng (Spearman s koefficient, R

2 = -0,43, p 0,001; Figur 1C). Derudover, når vi kategoriseret alle tumorer i en ikke-methylerede (methylering niveau 15%) og denatureret grupper (≥15% methylering), bemærkede vi, at methylerede tumorer havde konsekvent lavere miR-148a udtryk (0,068 vs. 0,088, p = 0,029, figur 1D, øverst). Endvidere CRCs med lavere MIR-148a-ekspression blev hyppigere methyleret sammenlignet med tumorer med højere ekspression (median, 11% vs. 8%, p = 0,001, Mann-Whitney U test, figur 1D, nederst). Disse resultater fremhæver, at hypermethyleringen af ​​den formodede miR-148a promotor-regionen er en vigtig reguleringsmekanisme for sit udtryk i CRC.

Lav miR-148a udtryk er forbundet med dårligt resultat hos patienter med stadie II og III CRC

Vi næste til formål at afgøre, om miR-148a udtryk status havde en indvirkning på prognosen hos patienter med stadie II og III CRC behandlet med 5-FU-adjuverende kemoterapi. Til disse analyser, sammenlignede vi forskellene i DFS og OS mellem høj ekspression (trin II = 58, III = 80) og lav ekspression (II = 18, III = 45) grupper. Vi fandt ikke signifikante associationer mellem miR-148a udtryk og nogen af ​​de klinisk-patologiske faktorer som alder, køn, tumor placering eller MSI status (tabel 1). Imidlertid blev lav MIR-148a ekspression signifikant associeret med kortere DFS (5-års DFS, lav vs. høj, 54% vs. 71%, p = 0,023, figur 2A), og viste en tendens mod værre OS (5-års OS, 78% vs. 85%, p = 0,12, figur 2B). Vi næste evaluerede prognostisk /prædiktiv værdi af miR-148a udtryk i en Cox proportional hazard regressionsmodel. I univariat analyse, højere TNM stadie (III vs. II, HR 2,06, 95% CI 1,21-3,52, p = 0,008) og lavere miR-148a udtryk (HR 1,74, 95% CI 1,08-2,83, p = 0,025) var signifikant forbundet med kortere DFS, og yngre alder viste en tendens til kortere DFS ( 60, HR 1,57, 95% CI 0,97-2,56, p = 0,071; tabel 2). Endvidere i den flerdimensionale model herunder disse tre faktorer, miR-148a udtryk status var uafhængigt associeret med dårligere overlevelse (HR 1,83, 95% CI 1,12-2,99, p = 0,017; tabel 2).

Kaplan-Meyer kurver for A, sygdomsfri overlevelse (DFS) og B, samlet overlevelse (OS) i fase II /III-patienter i henhold til miR-148a udtryk. Kaplan-Meyer kurver for C, DFS i fase II og D, fase III DFS afhængigt miR-148a udtryk.

Vi analyserede næste data fra fase II og III CRC separat at afgøre, om sammenhængen mellem lav miR-148a udtryk og dårligere resultat var ensartet på tværs af begge etaper, eller overvejende på linje med et trin. Vi fandt, at i trin II, havde MIR-148a-ekspression ikke forbinder med DFS (5-års DFS, høj vs. lav, 77% vs. 83%, p = 0,50, figur 2C) eller OS (5-års OS, 89 % vs. 87%, p = 0,94; data ikke vist). Men i trin III, lav MIR-148a-ekspression blev signifikant associeret med dårligere DFS (5-års DFS, 43% vs. 66%, p = 0,0071, figur 2D), men ikke med OS (5-års OS, 75% vs. . 81%, p = 0,16; data ikke vist). Endvidere lav MIR-148a-ekspression var en eneste faktor, der er forbundet med tumor tilbagefald i trin III (tabel 2). Disse resultater antyder, MIR-148a ekspressionsstatus har et potentiale som en prognostisk /prædiktiv biomarkør for fase III CRC.

Lav MIR-148a-ekspression er associeret med dårligere et terapeutisk respons og ringere overlevelse i stadium IV CRC

Vi næste belyst hvorvidt mIR-148a status havde et potentiale for at forudsige terapeutiske resultat hos patienter med stadium IV CRC behandlet med 5-FU og oxaliplatin. Alder, køn, tumor placering, og performance status var ikke signifikant forskellig mellem de høje og lave udtryk grupperne (tabel 1). Tumorer fra non-respondere (stabil sygdom og progressiv sygdom) viste en tendens mod lavere miR-148a udtryk sammenlignet med dem fra respondenter (komplet respons og delvis respons) (median, 0,063 vs. 0,092, p = 0,10, figur 3A, venstre) . Ikke desto mindre, når trin IV tumorer blev inddelt i lav og høj MIR-148a udtryksgrupper, den lave ekspression gruppen var signifikant associeret med en ugunstig terapeutisk respons (responders, 49% vs. 81%, p = 0,006, figur 3A, højre ). På Kaplan-Meyer-analyse, viste den lave udtryk gruppen en tendens til værre PFS (median, 8,1 vs. 10,1 måneder, p = 0,16, figur 3B, venstre) og betydeligt dårligere OS (16.1 vs. 25,6 måneder, p = 0,024; figur 3B, højre). Ud over den ekspressionsstatus MIR-148a methyleringsstatus også forbundet med både værre PFS (methyleret vs. ikke-methyleret, 6,9 vs. 9,3 måneder, p = 0,020, figur 3C, venstre) og OS (10,2 vs. 21,8 måneder, p = 0,0015, Figur 3C, højre)

A.. Terapeutisk respons ifølge miR-148a udtryk. Komplet respons, CR; partielt respons, PR; stabil sygdom, SD; progressiv sygdom; PD. B. Kaplan-Meyer kurver for progressionsfri overlevelse (PFS, venstre panel) og OS (højre panel) i stadie IV patienter efter miR-148a udtryk. C. Kaplan-Meyer kurver for PFS (venstre panel) og OS (højre panel) i fase IV patienter i henhold til miR-148a methylering.

Vi vurderede også den prædiktive værdi af miR-148a i et Cox proportional-hazard model. I univariat analyse, værre PS (HR 2,62, 95% CI 1,26-5,43, p = 0,010), sænk miR-148a udtryk (HR 1,79, 95% CI 1,08-2,98, p = 0,026) og miR-148a hypermethylering (HR 2,76 , 95% CI 1,44-5,28, p = 0,002) var signifikant associeret med dårligere overlevelse (tabel 3). I den sidste multivariate model, der omfattede disse tre faktorer, både miR-148a udtryk status (HR 1,93, 95% CI 1,15-3,23, p = 0,014) og miR-148a hypermethylering (HR 3,04, 95% CI 1,56-5,93, p = 0,0011) dukket op som uafhængige prædiktive faktorer, der var forbundet med dårligere resultat (tabel 3).

diskussion

Formålet med denne undersøgelse var at belyse, om miR-148a udtryk dysreguleret i CRC, og desuden, hvis dette har potentiale til at tjene som en prognostisk eller prædiktiv biomarkør i denne sygdom. Heri giver vi dokumentation for, at fremhæve en væsentlig rolle for miR-148a dysregulation i CRC. Først miR-148a udtryk var ofte nedreguleret i CRC, især i fremskredne stadie tumorer. For det andet blev MIR-148a-ekspression i colon reguleres i det mindste delvis gennem epigenetiske mekanismer baseret på den inverse korrelation iagttaget mellem dets ekspression og status for methylering. For det tredje, lav miR-148a-ekspression uafhængigt associeret med dårlig prognose i fase III-patienter behandlet med adjuverende kemoterapi. For det fjerde var lav miR-148a udtryk også forbundet med dårligere terapeutisk respons og dårligere overlevelse i stadie IV patienter behandlet med kemoterapi. Endelig methylering status var en uafhængig prædiktor for dårligere prognose i stadie IV CRC.

In vitro

undersøgelser med anvendelse af ikke-colon cellelinier har tilkendegivet, at miR-148a udøver en tumor undertrykkende funktion ved rettet mod adskillige gener såsom

PXR

,

TGIF2

,

MSX1

,

Cdc25B

,

DNMT1

DNMT3b

[39], [42] – [46]. Den dysregulering af MIR-148a er blevet impliceret i CRC [14], [29], [39], [47], men den kliniske betydning af ændret MIR-148a ekspression i CRC stadig at blive fuldstændigt belyst. I vores undersøgelse har vi analyseret den største kohorte af CRC patienter til dato (n = 273) og er forsynet solid dokumentation, at MIR-148a-ekspression er ofte nedreguleret i avanceret CRC og dets reducerede ekspression er forbundet med ringere overlevelse i stadium III og IV sygdom. Så vidt vi ved, har ingen af ​​de tidligere rapporter indledt identifikation af miRNA som biomarkører for at forudsige den terapeutiske respons i fase IV CRC patienter behandlet med cytotoksisk kemoterapi. Vores mest klinisk vigtig observation var, at fase IV CRC patienter med højt miR-148a udtryk var mere tilbøjelige til at drage fordel af cytotoksisk kemoterapi, fremhæver potentielt nye prædiktive værdi af denne miRNA som en beslutningsproces værktøj i behandlingen af ​​patienter med CRC.

De præcise mekanismer bag miR-148a nedregulering i at fremme modstand CRC celler til kemoterapi kræver yderligere udredning. Imidlertid har nylige beviser for den rolle af denne miRNA i andre kræftformer tilbydes spor for at forstå nogle af dens virkninger på cellulær kemosensitivitet. Fujita

et al.

Rapporterede, at miR-148a direkte henvender

MSK1

og transfektion af dens forløber forbedret følsomhed over for paclitaxel i prostata kræftceller [43]. MIR-148a-ekspression er også blevet vist at forbedre respons på cisplatin og 5-FU i esophageal cancerceller [48]. Ud over disse

in vitro

fund hos unge patienter med akut myeloid leukæmi, højere

BAALC

genekspression korrelerer omvendt med MIR-148a ekspression, og er blevet vist at associere med dårligere resultat i patienter behandlet med kemoterapi [49]. Kollektivt, vores observationer for potentialet i miR-148a udtryk status som prædiktiv markør i stadie IV CRC tilslutter disse tidligere offentliggørelser i andre kræftformer.

Vores undersøgelse er også den første forsøg på at bekræfte methylering-medieret lyddæmpning af miR-148a ved direkte at sammenligne udtryk og methylering niveauer i en stor kohorte af godt kommenterede CRCs. Ud over de indledende undersøgelser af Lujambio

et al.

[39], mere nylig blev det vist, at MIR-148a blev hypermethyleret i 51 ud af 78 CRCs [40]. Men ingen af ​​disse undersøgelser udført MIR-148a ekspression analyse og direkte korreleret deres resultater med hypermethylering i væv. Endvidere begge undersøgelser analyserede status MIR-148a methylering under anvendelse af en ikke-kvantitativ methyleringsspecifik PCR-metode, som er notorisk ikke-specifik for methylering, og giver ikke en tærskel for methylering, der korrelerer med transkriptionel inaktivering af genet. Styrken i vores undersøgelse er, at vi bestemt miR-148a udtryk ved QRT-PCR, og korreleret udtrykket data med kvantitative bisulfit pyrosekventering resultater, hvilket er en mere robust metode til at demonstrere methylering-medieret dysregulering af ethvert gen. Derfor observerede vi en signifikant omvendt sammenhæng mellem methylering og udtryk, styrke konceptet, at miR-148a nedregulering i CRC skyldes til dels promotor hypermethylering. Vi bemærkede også en betydelig og uafhængig forening mellem miR-148a methylering og dårlig overlevelse i stadie IV patienter, fremhæver, at udtryk og methylering status miR-148a kan være nyttigt som prognostiske /prædiktiv markører i CRC.