Abstrakt
Baggrund
Vi fastslået for nylig, at dentin sialophosphoprotein (DSPP), et medlem af søskende (Små integrin-bindende ligand N-bundne glycoproteiner) familie af phosphoglycoproteins, er stærkt opreguleret i humane orale pladecellecarcinomer (OSCCs) hvor opregulering er associeret med tumor aggressivitet. For at undersøge effekten af
DSPP
-silencing på tumorigene profiler af oral cancer cellelinje blev OSC2, korte hårnål RNA (shRNA) interferens ansat til at lukke munden på
DSPP
i OSC2 celler.
Metode /vigtigste resultater
Flere regioner i DSPP udskrift blev målrettet til shRNA interferens hjælp HDSP-shRNA lentivirale partikler beregnet til at lukke munden DSPP genekspression. Kontrol shRNA plasmid, der koder en kodet sekvens ude af stand til at nedbryde enhver kendt cellulært mRNA blev anvendt til negativ kontrol. Efter puromycinselektion af stabile linjer af
DSSP
-silenced OSC2 celler, fænotypiske kendetegnende for oral carcinogenese blev analyseret ved Western blot og RT-PCR-analyser, MTT (celle-levedygtighed), koloni-dannelse, modificeret Boyden-kammer (migration og invasion), og flowcytometri (celle-cyklus, og apoptose) analyser.
DSPP
-silenced OSC2 celler viste ændret cellemorfologi, nedsat levedygtighed, nedsat koloni-dannelse evne, nedsat migration og invasion, G0 /G1-celle-cyklus anholdelse, og øget tumor celle følsomhed over for cisplatin-induceret apoptose. Endvidere MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, Ki-67, p53, og EGFR var nedreguleret. Der var en direkte sammenhæng mellem graden af
DSPP
-silencing og MMP undertrykkelse, som angivet af mindste kvadraters regression: MMP-2 {(y = 0.850x, s 0,001) (y = 1.156x, s 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, og MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013)}.
konklusioner /betydning
DSPP
-silencing i OSC2 celle faldt fremtrædende kendetegn for oral tumorigenese og giver den første funktionelle tegn på en potentiel central rolle for DSPP i oral cancer biologi. Nedreguleringen af MMP-2, MMP-3, MMP-9, p53 og VEGF i
DSPP
-silenced OSC2 celler indeholder en betydelig funktionel /molekylær ramme for dechifrering mekanismerne i DSPP aktiviteter i oral cancer biologi .
Henvisning: Joshi R, Tawfik A, Edeh N, McCloud V, Looney S, Lewis J, et al. (2010) Dentin Sialophosphoprotein (DSPP) gendæmpning hæmmer Key Tumordannende Aktiviteter i human Oral Cancer cellelinje, OSC2. PLoS ONE 5 (11): e13974. doi: 10,1371 /journal.pone.0013974
Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
Modtaget: Juni 1, 2010; Accepteret: 12. oktober 2010; Udgivet: November 12, 2010
Copyright: © 2010 Joshi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Institute of Dental og kraniofaciale Research (NIDCR) /National Institutes of Health (NIH) Grant # K23DE017791-01A1 (KUEO); Medical College of Georgia Research Institute (MCGRI), Inc. Grant # STP00105W005 (KUEO); og af Wendy Will Case Cancer Foundation (KUEO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Dentin sialophosphoprotein (DSPP) er et medlem af søskende (Small Integrin-ligand N-bundet glycoprotein) familie af ekstracellulære matrix-glycophosphoproteins [1]. Andre medlemmer af familien er knoglesialoprotein (BSP), dentin matrix protein 1 (DMP1), dentin sialophosphoprotein (DSPP), osteopontin (OPN), og matrix ekstracellulær phosphoglycoprotein (MEPE) [1]. Ekspression af søskende blev oprindeligt tænkt at være begrænset til knogler og tænder, hvor de fungerer til at lette dentin og knoglematrix mineraliseringen [1] – [3]. Nylige rapporter dog viser, at søskende er også til stede i ikke-mineraliseringsmidler metabolisk aktive duktale epitelceller af spytkirtlerne, nefroner og eccrine svedkirtler, hvor deres funktion kan være forbundet med reparation af pericellulært og ekstracellulære matrix (ECM) proteiner beskadiget ved frie radikaler genereret gennem intens metabolisk aktivitet [4] – [6].
Tidligere rapporter har identificeret den opregulering af nogle medlemmer af søskende i forskellige kræftformer, herunder bryst-, lunge-, og prostatakræft [7] . OPN dog er søskende, som der er utvetydigt bevis for dets rolle i mange af trinnene kræft udviklingen og progressionen [6] – [8]. Akkumulerende data er begyndt at implicere andre familiemedlemmer, navnlig BSP og DSPP, med roller i bestemte stadier af tumor progression, herunder cellevækst, vedhæftning, migration og /eller metastaser [6] – [8]. Vi har for nylig rapporteret opregulering af BSP, DSPP, og OPN, i humane orale planocellulært karcinom (OSCCs) [9] og i nogle menneskelige oral epitelial dysplasi (OEDs) [10]. Disse rapporter viser, at DSPP er stærkt opreguleret i dårligt differentieret og histologisk aggressiv OSCC [9]. Betydeligt, OEDs udtrykker DSPP med eller uden BSP udstillet en 4-fold tilbøjelighed til overgang til OSCC forhold til OEDs udtrykker BSP alene, hvilket tyder på, at DSPP udtryk øget risiko for lokale primære OSCC mens BSP udtryk faldt sådan risiko [10]. Men der i øjeblikket er ingen data vedrørende den funktionelle og mekanistiske rolle DSPP i oral cancer udvikling og progression.
I den foreliggende undersøgelse designet til at etablere funktionelle sammenhænge mellem DSPP udtryk og den biologiske adfærd OSCC, kort hårnål RNA (shRNA) interferens blev anvendt til at producere lyddæmpning af
DSPP
i OSCC cellelinje OSC2.
DSPP
-silenced OSC2 celler blev derefter evalueret for at afgøre, i hvilket omfang dæmpende undertrykker eller ophæver vigtige maligne fænotypiske karakteristika OSC2 celler ved anvendelse af forskellige standard
in vitro
teknikker.
Resultater
DSPP er opreguleret i orale cancer cellelinjer, OSC2 og SCC25, og dysplastiske oral epitelial cellelinje, DOK
OSC2 og SCC25 er humane OSSC cellelinjer afledt regional cervikal lymfeknude metastaser af en primær human tunge pladecellekarcinom, og en primær tunge pladecellecarcinom, henholdsvis [11] – [13]. DOK er en human oral epitel- dysplastiske cellelinje afledt af dorsale tunge [14]. For at evaluere de endogene ekspressionsniveauer af DSPP protein og mRNA i OSC2, SCC25, og DOK celler, western blot og semikvantitativ-revers transkriptase (RT) -PCR analyser blev udført på hel-cellelysater og totalt RNA ekstrakter, henholdsvis som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Positive og negative kontroller bestod af hel-cellelysater og totalt RNA ekstrakter fra MCF-7 celler (afledt af bryst-adenocarcinom) og HOK-celler (afledt fra primær kultur af humane orale keratinocytter), hhv. DSPP signifikant opreguleret i OSC2, SCC25, og i DOK sammenlignet med HOK celler ved den translationelle (figur 1A) og transkriptionelle (figur 1B) niveauer. Disse
in vitro
resultater stemmer overens med resultaterne af vores seneste undersøgelser indikerer opregulering af DSPP i OSCC fra patienter, og dets fuldstændige fravær i normal oral slimhindeepitelet [9].
(A) Western blot (WB) og densitometriske analyser viser signifikant opregulering af DSPP i OSC2, SCC25, og DOK celler sammenlignet med HOK negative kontroller. Der er en basal ( 10%) niveau af DSPP udtryk i primære HOK celler. MCF7-cellelinie kendt for at udtrykke DSPP blev anvendt som positiv kontrol. Normalisering var med β-actin. (B) Semikvantitativ RT-PCR-analyse viser DSPP-mRNA-ekspression i OSC2, SCC25, og DOK celler i overensstemmelse med WB resultater i (A) med ikke-detekterbare DSPP-mRNA-niveauer i HOK celle. Normalisering var med GAPDH. Celler, der anvendes i undersøgelsen: OSC2, en human OSCC cellelinie afledt fra regional cervikal lymfeknude metastase af en primær human tunge pladecellecarcinom; SCC25, en primær tunge skælcellecarcinom; DOK, et menneske oralt epitel dysplastiske cellelinje afledt fra dorsal tungen; og MCF7 (akronym af Michigan Cancer Foundation – 7)., en human brystcancer cellelinje isoleret fra en 69-årig kaukasisk kvinde
Forbigående DSP-shRNA transfektion resulterer i ændret morfologi OSC2 celler
Efter at have konstateret baseline ekspressionsniveauer af DSPP i to OSCC cellelinjer, vi fortsatte med at undersøge, hvordan stabil
DSPP
-silencing via lentiviral-medieret lille hårnål RNA (shRNA) interferens påvirker tumorigene profiler OSC2 celler. Vi valgte OSC2 celler over deres SCC25 modstykke på grund af de påviseligt højere ekspressionsniveauer af DSPP i OSC2 celler på både proteinet og mRNA-niveauer (figur 1) og også fordi OSC2 celler udviser meget stærk invasiv fænotype som påvist i eksperimentelle nøgne musemodeller [11 ] – [13]. For at vurdere de umiddelbare virkninger af DSP-shRNA transfektion på OSC2 cellemorfologi blev transficerede celler sammen med kontroller fotograferet ved 24- og 48-timer efter transfektion (forbigående fase) før påbegyndelse af puromycin selektion af stabilt transficerede celler. Som vist i figurerne 2C og 2F (illustrative områder fotograferet), DSP-shRNA transficerede OSC2 celler udviste et langt større antal celler med betydelige tab af celle-celle-kontakt og en mere ægformede og uregelmæssig kontur sammenlignet med ikke-transficerede OSC2 celler (figur 2A) eller krypterede sekvensstyringer (figur 2B, 2E). Fluorescens mikroskopi af forbigående transficerede coGFP-shRNA kloner viste en stærk grøn fluorescens indikerer høj procentdel transfektionseffektivitet (figur 2D). Vi fortsatte med at etablere stabile DSP-shRNA-tavshed OSC2 celler via puromycinselektion for at undersøge omfanget af eventuelle ændringer i andre fremtrædende fænotypiske kendetegnende for OSCC.
(A) OSC2 celler før lentiviral-transducerede transfektion med DSP-shRNA udviser karakteristiske morfologi af levedygtige epiteliale tumorceller i kultur. (B, E) Scrambled (kontrol) sekvens-transficerede OSC2 celler ved 24- og 48 timer udviser levedygtige epitelceller og morfologi svarende til (A). (C, F; illustrative områder) DSP-shRNA transfektion OSC2 celler udviser signifikant øget antal celler med tab af celle-celle kontakt, mere afrundet og uregelmæssig kontur, fremtrædende nukleare blæredannelse, og cellulære disintegration uændret i forhold til udlevet og døende celler på 24- og 48-t. (D) copGFP transficerede OSC2 celler bekræfter meget høj transfektionseffektivitet (grøn fluorescens).
Generering af en stabil
DSPP
-silenced OSC2 cellelinje
Stald linjer af DSP-lyddæmpet og forvrænget sekvens kontroller blev udvalgt ved hjælp af puromycin antibiotika som beskrevet i Materialer og Metoder. Effektiviteten af DSP-shRNA lentiviral konstruktion i stabilt silencing DSPP i OSC2 celler blev verificeret ved Western blot og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) analyser. Som vist i figur 3, western blot og densitometriske analyser af seks forskellige DSP-shRNA transficerede OSC2 stabile linjer viste DSPP lyddæmpning i området fra -5% [Line (L) 4] til ~ 95% L2 sammenlignet med stabil shRNA-scramblet sekvens (SHC ) kontrol (figur 3A). Disse resultater blev yderligere bekræftet ved immunfluorescens konfokalmikroskopi viser signifikant reduceret DSPP signal (grøn fluorescens) i L2 stabile linjer sammenlignet med kontrol (figur 3C).
Stabil linjer udvalg af lentiviral-transducerede shRNA blev gennemført via puromycine valg. (A) WB og tilsvarende densitometrisk analyser af niveau af DSPP-dæmpning efter udvælgelse af seks stabile linjer viser niveau af tavshed spænder fra -5% (linje [L] 4) til ~ 95% (L2) sammenlignet med røræg sekvens (SHC) kontrol. (B) QRT-PCR-analyse viser signifikant reduceret DSPP-mRNA i DSPP-lyddæmpet L1 ( 90%) og L2 ( 95%) celler (der udviser den mest knockdown på WB) sammenlignet med SHC kontrol. (C) Immunfluorescence konfokal mikroskopi kontrollerer DSPP-tavshed som betydeligt reduceret DSPP signal (grøn fluorescens) i L2.
Samtidig vi kontrolleret effektiviteten af DSP-shRNA i nedbrydende DSPP mRNA i lentivirally inficerede celler ved QRT-PCR under anvendelse af L1 og L2 udviser den mest knockdown af de seks linjer (se figur 3A) på western blot. Resultaterne indikerer signifikant reduceret DSPP mRNA-niveauer i L1 ( 99%) og L2 ( 95%) sammenlignet med shRNA SHC styreledning (figur 3B). C
T værdier opnået fra QRT-PCR-analyse af de relative DSPP mRNA-niveauer i SHC kontrol og
DSPP
-silenced L1 og L2 blev normaliseret med husholdning genet GAPDH. Dette shRNA-medieret effekt var specifik, da GAPDH niveauer ikke adskilte sig væsentligt blandt DSP-shRNA transfekterede celler og kontroller.
DSPP
-silencing reducerer p53, Ki-67 og PCNA, og hæmmer celledeling og koloni-dannelse i OSC2 celler
virkningerne af
DSPP
-silencing på niveauerne af proliferativ markør, Ki-67, PCNA, og cellecyklus regulator p53 blev analyseret ved western blot for alle seks
DSPP
-silenced OSC2 stabile linjer. Sammenlignet med SHC kontrolledning, niveauerne af Ki-67, PCNA, og p53 blev væsentligt reduceret, hvilket indikerer, at DSPP kan forstærke proliferation i orale cancerceller via mekanismer, der involverer p53, Ki-67, og PCNA (figur 4A).
(A) WB af ki-67, PCNA, og p53 følgende
DSPP
-silencing i OSC2 celler viser signifikant nedregulering for hvert af disse proteiner. (B) Spredningen status
DSPP
-silenced OSC2 celler sammenlignet med forældrenes OSC2 og SHC kontrol udføres via MTT assay shows faldt celledeling på 53% for L2 (demonstrere mest grad af tavshed) i forhold til 5% for L4 (mindst lyddæmpning), og -30% for L6 (moderat lyddæmpning) og SHC kontrol (p 0,05; n = 3). (C) L2 celler dannes mindre og betydeligt færre ( 25%) kolonier i blød agar sammenlignet med forældrenes OSC2 og SHC kontrol celler (* p 0,05).
For at bestemme omfanget som
DSPP
lyddæmpning påvirker spredningen af OSC2 celler, vi udført MTT assays for tre af de seks
DSPP
-silenced stabile linjer, der omfattede L2 demonstrerer den højeste grad af
DSPP
-silencing, L4 demonstrere mindst nedregulering, og L6 demonstrerer moderat lyddæmpning. Sammenlignet med SHC kontrol og parentale OSC2 cellelinier, nedregulering af
DSPP
var forbundet med et gennemsnit på 53% fald i celleproliferation på dag 6 i L2 (figur 4B; P 0,05; n = 3). Med hensyn til evnen til at danne kolonier, L2-celler dannede kolonier i blød agar, der var betydeligt mindre og færre end dem fra SHC kontroller, og fra parentale OSC2 celler (figur 4C). Antallet af kolonier dannet i L2-celler var signifikant reduceret ( 25% af forælder OSC2 celler og ca. 20% af SHC kontrol) som vist i figur 4C søjlediagram. Disse resultater tyder på en betydelig rolle for DSPP i oral cancer cellevækst og proliferation. L2 celler demonstrerer den mest signifikant grad af
DSPP
-silencing af alle seks linjer blev ansat til undersøgelser af effekterne af lyddæmpning om migration og invasion, og celle-cyklus aktiviteter.
DSPP
-silencing nedsætter OSC2 migration og invasion
som beskrevet i Materiale og metoder sektion, vi udført invasion og migration analyser ved hjælp modificerede Boyden Chamber eksperimenter for at bestemme, i hvilket omfang
DSPP
nedregulering påvirker migration og invasion af OSC2 celler. Som vist i figur 5, nedregulering af
DSPP
(L2) faldt invasion (figur 5A) og migration (figur 5B) af OSC2 celle med 25% i hvert tilfælde, sammenlignet med SHC kontrol og parentale OSC2 celler (p lt 0,05 for hver sammenligning i Dunn fremgangsmåde til multiple sammenligninger). Baseret på disse resultater hypotese vi, at DSPP spiller en væsentlig rolle i migration og invasivitet inden OSCC mikromiljø til mindst støtte lokal spredning af tumor. Desuden resultaterne af disse in vitro assays tillade os at spekulere, at DSPP kan spille en rolle i fjernt sted metastase af primære OSCCs.
(A, B) Modificeret Boyden-Chamber eksperiment viser, at
DSPP
-silencing i (L2) faldt invasion (A) og migrering (B) af OSC2 celler ved -25%, sammenlignet med SHC kontrol og parentale OSC2 celler (for hver sammenligning i Dunn metoder til multiple sammenligninger).
Stabil
DSPP
-silencing i OSC2 celler inducerer G
0 /G
1 anholdelse
for at verificere virkninger
DSPP
undertrykkelse på OSC2 cellecyklus aktiviteter, flow cytometri af
DSPP
-silenced OSC2 stabil linje, L2, blev gennemført. Andelen af L2-celler i G
0 /G
1 fase blev signifikant forøget sammenlignet med den for SHC kontrol og den for parentale OSC2 celler (figur 6). Som vist i figur 6A, 79,51% af L2-celler akkumuleret i G
0 /G
1 fase i modsætning til 44,77% og 45,98 af parental OSC2 og SHC kontroller, henholdsvis. Andelene af celler i S og G
2 /M faser af L2-celler var 14,62% og 5,88%, sammenlignet med 30,74% (S) og 24.49% (G
2 /M) i forbindelse med forældre- OSC2 celler og 32.92% (S) og 21,11% (G
2 /M) for SHC kontrolceller. Men der var ingen påviselige forskelle i apoptotisk sats mellem L2 celler og SHC kontroller som yderligere bekræftet ved DNA laddering eksperimenter (Figur 6B), hvilket indikerer, at
DSPP
-silencing alene ikke øger apoptose sats OSC2 celler.
(A) Flowcytometrisk analyse viser andelen af DSPP-lyddæmpet L2 celler i G
0 /G
1 fase signifikant forøget (79,51%) i forhold til forældrenes OSC2 (44,7%) og SHC kontrol (45.98%). (B) Omvendt DNA laddering eksperimenter viser ingen signifikant forskel i antallet af apoptose mellem L2 celler og kontroller. Dette resultat indikerer, at
DSPP
-silencing alene ikke øge hastigheden af apoptose i OSC2 celler.
Stabil
DSPP
-silencing sensibiliserede OSC2 celler til cisplatin induceret apoptose
hoved og hals planocellulære celler karcinomer (HNSCC), herunder OSCCs, udvikle erhvervet eller iboende modstand mod cisplatin-baseret kombinationskemoterapi [15], [16]. Det er blevet foreslået, at mekanismen for interferens med cisplatin-induceret apoptose i HNSCCs er ved opregulering af EGFR [15]. Vi søgte derfor at bestemme virkningen af
DSPP
-silencing på EGFR samt omfanget af virkningerne af
DSPP
-silencing på respons af OSC2 celler til cisplatin-induceret apoptose.
Efter behandling af
DSPP
-silenced OSC2 (L2) celler og kontroller (forældrenes OSC2 og SHC) med forskellige doser af cisplatin i en tid-retters eksperiment som beskrevet i Materialer og Metoder sektion, sats af apoptose i L2-celler blev analyseret ved Annexin V /FITC flowcytometri, og sammenlignet med priser i kontroller. Med næsten 100% af celler indhegnet og FACS sorteres, figur 7A viser, at den apoptotiske cellefraktion var signifikant forøget fra 41,28% i parentale OSC2 celler (og 43.69% i SHC kontroller) blev behandlet med 50 uM cisplatin i 24 timer til 56.19% i L2 celler behandles med samme dosis af cisplatin. På den anden side, de apoptotiske cellefraktioner uden cisplatin for OSC2 (9,63%), SHC kontrol (12,81%), og L2-celler (13.99%) var ikke signifikant forskellige. Tilsvarende resultater af trypanblåt-farvning indikerer ligeledes signifikant stigning i hastigheden af apoptose i L2-celler behandlet med cisplatin sammenlignet med SHC kontrol og parentale OSC2 celler behandlet med cisplatin i forskellige doser (figur 7B).
(A) Behandling af
DSPP
-silenced L2, forældrenes OSC2, og SHC kontrol celler med 50 uM i 24 timer efterfulgt af Annexin V /FITC flowcytometri analyse viser en stigning i apoptotisk sats 56,19% (målt ved sub-G1 cellulære DNA-indholdet) for L2-celler sammenlignet med 41,28% i forældrenes med cisplatin og OSC2 og 43,69% i SHC kontrol med cisplatin. (B) Trypan blåfarvning søjlediagram kvantificering indikerer sammenlignelige apoptotiske kurser, der i (A). (C) WB viser signifikant nedregulering af EGFR i
DSPP
-silenced OSC2 celler, herunder L2. Symboler: Cis = cisplatin; L2 =
DSPP
-silenced OSC2 celler linje 2; OSC2 = forældrenes (uden knockdown) OSC2 celler, M1 = levende celler; M2 = deal celler.
Desuden blev niveauet af EGFR signifikant reduceret i L2-celler sammenlignet med SHC kontroller, hvilket antyder, at EGFR-inhibering er påkrævet for cisplatin-induceret apoptose i OSC2 celler (Figur 7C). Kollektivt antyder disse resultater, at DSPP nedregulering i OSC2 celler, samtidig resulterer i G
0 /G
1 arrest (se figur 6A) og derfor reducerede proliferativ aktivitet, ikke øger apoptose; kan dog DSPP undertrykkelse væsentlig grad at øge følsomheden af OSC2 celler til cisplatin-induceret apoptose via mekanisme involverer nedregulering af EGFR.
Stabil
DSPP
-silencing i OSC2 celler undertrykker MMP-2, MMP -3, og MMP-9 udtryk
Tidligere rapporter har identificeret specifikke interaktioner mellem nogle medlemmer af søskende familie af proteiner med specifikke matrixmetalloproteinaser (MMP’er). Specifikt til BSP partnere med proMMP-2, OPN med proMMP-3, og DMP-1 med proMMP9 for aktivere de respektive proteaser [4], [17]. Imidlertid MMP partner (e) til DSPP og MEPE eventuelt ikke er blevet identificeret. Ikke desto mindre, vi har forsøgt at bestemme udtrykket status for disse tre kendte søskende-partnering MMP i alle seks genererede
DSPP
-silenced OSC2 linjer.
Som det fremgår af Western blot og densitometriske analyser, niveauer af både pro- og aktiverede MMP-2, MMP-3 og MMP-9-niveauer blev reduceret i alle undtagen en af de seks
DSPP
-silenced OSC2 linjer sammenlignet med SHC kontroller (figur 8A, 8B). Lige så vigtig er en direkte sammenhæng mellem graden af
DSPP
-silencing og MMP undertrykkelse, som angivet med mindste kvadraters regressionsanalyse gennem oprindelse: MMP-2 {(y = 0.850x, s 0,001) (y = 1.156x, s 0,001)}, MMP-3 {(y = 0.994x, s 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, og MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005 , y 0,809, p = 0,013); Figur 8C)}. Men niveauet af MMP undertrykkelse ikke signifikant mellem pro- og spaltede former. Tilsvarende fald i VEGF-niveauer i stabil
DSPP
-silenced linjer varierede fra 5% (L4) til 86% (L2) med niveauet af suppression direkte proportional med graden af
DSPP
-silencing (figur 8D), hvilket tyder på en dosisafhængig relation mellem DSPP ekspression og angiogen aktivitet i OSCCs. Kollektivt, disse resultater tyder på en regulerende rolle for DSPP i opregulering og aktivering af søskende-partnering MMP’er samt angiogenese i kræft i mundhulen.
(A) WB og (B) svarende densitometriske analyser viser betydelig down- regulering af pro- og aktiverede MMP-2, MMP-3 og MMP-9 i alle undtagen en (L4) af de seks
DSPP
-silenced stabile linjer. (C) Mindst firkantet regressionsanalyser viser signifikant reducerede niveauer af pro-og aktiveret MMP-2 {(y = 0.850x, s 0,001) (y = 1.156x, s 0,001)}; MMP-3 {(y = 0.0.994x, s 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, og MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013) }, og en direkte sammenhæng mellem graden af
DSPP
-silencing og MMP undertrykkelse; havde imidlertid niveauet af MMP undertrykkelse ikke signifikant mellem pro- og spaltede former. (D) Densitometrisk analyse af WB af VEGF-niveauer viste nedregulering spænder fra 5% (L4) til 86% (L2) med niveauet for nedregulering direkte proportional med graden af
DSPP
– nedregulering.
In vivo
anti-tumor effekt af
DSPP
-silencing på OSC2 celler
anti-tumor effekt af DSPP- nedregulering i OSC2 celler blev testet i to Balb /c nøgne mus implanteret subkutant med DSPP-tavshed OSC2 celler (L2 poster) til venstre flanke, mens den scrambled sekvens kontrol (SHC linjer) blev implanteret subkutant på højre flanke. Som vist i den supplerende Figur S1, var en tendens til langsommere tumor udvikling og vækst resulterede i en generel mindre tumorvolumen observeret for L2 tumor sammenlignet med SHC kontroltumorer over en periode på 6 uger [fig S1A og S1G (scatter plot]. Histologisk evaluering af hematoxylene og eosin (H . Se Ref [20]), som forårsager, at cellerne udskiller kun fuld længde DSPP, der kunne bruges som en standard vil være behov for efterfølgende henvendelser rettet nogen specifik mekanistisk rolle for DPP, DSP eller den fulde længde DSPP i biologi oral cancer.
anmeldelser af de specifikke gener produkter profileret i denne undersøgelse, efter
DSPP
lyddæmpning, viser, at ingen af dem har indtil nu været forbundet med potentielle rolle DSPP i oral cancer. Som et udskilt protein DSPP repræsenterer et ideelt mål for en shRNA-medieret lyddæmpning, og ved at analysere de funktionelle effekter af
DSPP
-silencing i OSC2, viser vi, at
DSPP
-silencing nedregulerer centrale proteiner involveret i tumorcelleproliferation, angiogenese, og lokal invasion. Specifikt vore data viser, at inaktivering af
DSPP
i orale cancerceller er associeret med signifikant nedregulering af søskende-partnering MMP’er, VEGF, p53, og celleproliferationsmarkører Ki-67 og PCNA. Up-bestemmelser af MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, og p53 med niveauer korrelerer med resultater og prognostiske parametre såsom fremskreden sygdom stadium, invasion og metastase, er tidligere blevet associeret med oral cancer [22] – [ ,,,0],24]. Således er vores resultater indikerer en signifikant nedregulering af MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, og p53 efter stabil
DSPP
-silencing i OSC2 celler antyder, at DSPP kan drive opstrøms for disse proteiner produkter. Endvidere nedreguleringen af p53 indikerer, at DSPP kan direkte eller i det mindste på afstand, regulere aspekter af celle-cyklus-aktivitet.
Nylige rapporter viser også, at MMP-medieret omformning af ekstracellulær matrix (ECM) er faktisk en af flere initierende hændelser tillader OSCC celler at invadere det omgivende stroma [25]. Det postuleres, at tidlig ekspression af MMP ved tumor eller omgivende stromale celler letter ombygningen af ECM, hvilket resulterer i frigivelse af vækstfaktorer for at sikre en levedygtig udklækningssted for primær tumorvækst [26], [27]. Til gengæld, tumorvækst fører til angiogen omskifter i hvilken balancen i proangiogene faktorer, såsom VEGF overvinder ekspressionen af angiogene inhibitorer [28]. VEGF-medieret angiogenese er kendetegnende for OSCC progression [25], [29], og MMP-2 og MMP-9 er begge blevet impliceret i induktion af den angiogene kontakten i forskellige modeller [26], [27].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.