PLoS ONE: En Coding Variant i TMC8 (EVER2) er forbundet med høj risiko HPV-infektion og hoved- og halscancer Risk

Abstrakt

HPV-infektion er en kausal agent i mange epiteliale kræftformer, men vores forståelse af genetiske modtagelighed for HPV-infektion og deraf cancer risiko er begrænset. Epidermodysplasia verruciformis er en sjælden tilstand af ekstrem følsomhed over for kutan HPV-infektion kan primært henføres til mutationer i

TMC6

og

TMC8

. Genetisk variation i

TMC6 /TMC8

region er blevet forbundet med beta-typen HPV-infektion og pladecellekarcinom i huden, livmoderhalskræft, HPV persistens og progression til cervikal cancer. Her har vi testet den hypotese, at de fælles

TMC8

SNP rs7208422 er forbundet med høj risiko HPV-infektion og risiko for hoved og hals pladecellekræft (HNSCC). Seropositivitet til HPV L1-protein (HPV 16, 18, 11, 31, 33, 35, 45, 52, 58) blev målt i 514 tilfælde og 452 befolkningsbaserede kontroller. Genotype var signifikant associeret med seropositivitet til HPV18 L1 (OR

TT vs AA = 0,48, 95% CI = 0,22-0,99) og borderline signifikant associeret med HPV 16 L1 (OR

TT vs AA = 0,58, 95% CI = 0,22-1,17). Der var en konsekvent omvendt sammenhæng mellem

TMC8

genotype og infektion med andre HPV-typer, herunder statistisk signifikante associationer til HPV31 og HPV52. I overensstemmelse med disse resultater, blev varianten T genotypen forbundet med en reduceret risiko for HNSCC (OR

AT: 0,63, 95% CI 0,45-0,89, OR

TT: 0,54, 95% CI 0,36-0,81), selv blandt fag seronegative for alle HPV-typer (eller

AT: 0,71, 95% CI 0,45-1,11, OR

TT: 0,54, 95% CI 0,31-0,93). Vores data viser, at fælles genetiske variation i

TMC8

er forbundet med høj risiko HPV-infektion og HNSCC ætiologi

Henvisning:. Liang C, Kelsey KT, McClean MD, Christensen BC, Marsit CJ, Karagas MR, et al. (2015) En Coding Variant i

TMC8

(EVER2) er forbundet med høj risiko HPV-infektion og hoved- og halscancer Risk. PLoS ONE 10 (4): e0123716. doi: 10,1371 /journal.pone.0123716

Academic Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, UNITED STATES

Modtaget: December 13, 2013; Accepteret: 6 Marts 2015; Udgivet: April 8, 2015

Copyright: © 2015 Liang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af følgende tilskud: NIH R01CA118443, R01CA078609. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Null mutationer i

TMC6

og

TMC8

tillægger ekstrem modtagelighed for infektion med kutant (beta-type) HPV. Disse gener koder EVER1 og EVER2 der danner en heterodimer, der interagerer med zink transporteren molekyle ZnT-1 til at styre zink niveauer i cellen [1]. Den sjældne syndrom epidermodysplasia Verrucciformis (EV) er forbundet med mutation i en af ​​disse gener, og er kendetegnet ved et stort antal flade-lignende læsioner inficeret med beta-HPV’er, primært HPV5 og HPV8 virus. Vi har tidligere bemærket, at den genetiske variation i

TMC8

var forbundet med seropositivitet for kutan (beta) HPV og øget risiko for planocellulært hudkræft (SCC) [2]. Observationerne fra EV og hud kræftpatienter tyder på, at

TMC6

og

TMC8

gener kunne være vigtige faktorer for host beskyttelse mod papillomavirus. Mens det kompleks af NOGENSINDE proteiner er kendt for at regulere zink homeostase i keratinocytter, er det for nylig blevet påvist, at de

TMC6 /8

gener også udtrykkes ved høje niveauer i T-lymfocytter [3,4]. Derfor genetisk variation i

TMC6 /8

gener kan påvirke HPV-infektion og kræftrisiko enten direkte ved at modulere HPV-infektion i epitelceller, eller indirekte gennem immun overvågning.

Selvom fælles genetisk variation i

TMC8

har været forbundet med beta-HPV-infektion, er det også muligt, at

TMC8

genetisk variation bidrager til højrisiko-HPV-infektion og ledsagende kræftrisiko (cervikal, anden anogenital, og hoved og hals maligniteter). Faktisk arbejde af Wang et al [5] ved hjælp af tætte genotype metode identificeret en sjælden SNP i

TMC6

/

TMC8

gen region som værende forbundet med HPV 16 vedholdenhed. En nyere undersøgelse fra Castro et al [6], viste, at to almindelige SNPs i TMC6 /TMC8 genet var associeret med livmoderhalskræft (i mangel af andre HPV-målinger). Uanset om fælles variation i dette gen region giver modtagelighed for højrisiko-HPV-infektion forbliver ufuldstændigt forstået. Derudover rolle af dette gen i andre HPV-relaterede cancere, såsom svælg cancer (rev i [7]), er ikke blevet testet. Her har vi forsøgt at afgøre, om de fælles SNP rs7208422 i

TMC8

er forbundet med seropositivitet til HPV-typer højrisiko og risiko for HNSCC.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelse protokoller og materialer til rekruttering af cases og kontroller blev godkendt af Institutional Review Boards på de ni medicinske faciliteter og Brown University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle forsøgspersoner.

Undersøgelse emner

Denne population-baserede case-kontrol undersøgelse blev gennemført i Greater Boston, MA mellem december 1999 december 2003 og er blevet beskrevet tidligere [8]. Sager var HNSCC patienter identificeret fra hoved og hals klinikker og afdelinger i otolaryngology eller stråling onkologi på ni medicinske faciliteter i undersøgelsesområdet i undersøgelsesperioden. Støtteberettigede tilfælde var beboere i undersøgelsesområdet i alderen 18 år eller ældre, og med en patologisk bekræftet diagnose af HNSCC ikke mere end 6 måneder før tidspunktet for patientkontakt. Patienter med karcinom

in situ

, læbe, spytkirtel, eller nasooropharyngeal kræft eller tilbagevendende HNSCC blev udelukket. Cancerregisteret blev forespurgt at sikre, at alle berettigede sager i området blev identificeret. HNSCC sager omfattede diagnosekoder 141-146, 148, 149, og 161 i henhold til International Classification of Disease, Ninth Revision (ICD-9). Sager blev yderligere klassificeret ved stedet i orale (ICD-9-koder 143-145), oropharygeal (ICD-9-koder 146, 148, 149), og strube (ICD-9 kode 161) sygdom. Kontroller blev frekvens-matchede til tilfælde af alder (± 3 år), køn og byen bopæl identificeret fra Massachusetts by bøger gennem systematisk tilfældig udvælgelse. Byen Bogen indeholder alle beboerne mere end 17 års opført af adresse og enemærker alder. søgt En potentiel kontrol af samme køn og alder som sagen fra denne liste, skiftevis søgningen retning gennem bogen starter ved sagen adresse.

Påvisning af antistoffer ved multiplex serologi

Venøs blodprøver blev opnået fra og kontrolpersoner. Serum blev separeret inden 12-24 timer af blod tegning og prøver blev opbevaret ved -80 ° C. Til påvisning af antistoffer mod HPV, blev en glutathion S-transferase (GST) capture enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) anvendes i kombination med fluorescerende vulst teknologi, som beskrevet detaljeret tidligere [9,10,11,12]. Kort fortalt blev fuld længde virale proteiner fusioneret med en N-terminal GST-domæne udtrykkes i

E

.

coli

bakterier. Glutathion tværbundet til kasein blev koblet til fluorescensmærkede polystyrenperler (SeroMAP mikrosfærer, Luminex Corp, Austin, TX) og GST-fusionsproteiner blev

in situ

affinitetsoprenset på perlerne direkte i en en- trin. Hver Fusionsproteinet blev bundet til en spektralt distinkt perle sæt. Fusionsprotein-loaded perlesæt blev blandet og inkuberet med humane sera. Antistoffer bundet til perlerne via de virale antigener blev påvist med biotinyleret gede-anti-humant IgG (H + L) sekundært antistof og streptavidin-R-phycoerythrin. En Luminex 100 analysatoren (Luminex Corp., Austin, TX) blev anvendt til at identificere den interne farve af de individuelle perler og kvantificere deres reporter fluorescens (udtrykt som gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) på mindst 100 perler pr sæt per serum).

MFI-værdier blev dikotomiseret som antistof-positive eller negative. En standardiseret cut-off for HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 og 58 L1-antistoffer blev defineret tidligere [13] og anvendes her. Sero-positive cut-offs for HPV16 tidlige proteiner blev bestemt ved anvendelse af en lignende algoritme til serumprøver af 117 kvindelige, HPV DNA negative, selvrapporterede jomfruer fra en tværsnitsundersøgelse blandt koreanske studerende [13]. Gennemsnittet plus 5 standardafvigelser blev beregnet, og det resulterende enkelt cut-off blev fordoblet til stringent adskille seropositive og-negative reaktioner (HPV 16 E6, 484 MFI, HPV 16 E7, 1096 MFI) [14]

afsløring TMC8 genotype

Vi indsamlede data på en (a T) kodende SNP i exon 8, codon 306 i

TMC8

gen (rs7208422), hvilket resulterer i en ændring fra asparagin til isoleucin. DNA blev ekstraheret fra fibrinlag ved hjælp af Qiagen genomisk DNA ekstraktion kit. Genotypebestemmelse af

TMC8

polymorfi blev udført ved hjælp af Taqman diskrimination allel teknik (Applied Biosystems, Foster City, CA), som tidligere offentliggjort [2]. Kendt genotype kontroller blev inkluderet for hvert genotypebestemmelsesassay. For kvalitetsvurdering, hver tiende prøve var en indlejret to eksemplarer, og der var 100% konkordans blandt QA genotyper.

Statistisk analyse

Dataanalyse var begrænset til kaukasiske personer med både

TMC8

genotype og HPV serologiske data. For at estimere sammenhængen mellem

TMC8

genotype og HNSCC, vi beregnede odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CIS) fra ubetingede logistiske regressionsmodeller. Modeller omfattede undersøgelsen matcher faktorer køn og alder, men den tredje matching parameter, by bopæl, blev ikke medtaget i disse ubetingede regressionsmodeller: antallet af byer, der er repræsenteret. Risiko modeller blev også justeret for rygning (pack-år) og drikke (gennemsnit genstande om ugen). Vi har desuden foretaget en analyse stratificeret ved tumor hjemmeside samt ved HPV16 serologi status. For at undersøge forholdet mellem

TMC8

genotype og HPV serologiske markører, brugte vi logistisk regression med positiv serologi som responsvariabel og

TMC8

genotype som en uafhængig variabel. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp SAS9.1, og alle de statistiske tests var to-sidet.

Resultater

Blandt de 775 forsøgspersoner, 361 var tilfælde med HNSCC (148 mundhulen kræft, 148 oropharyngeal kræft, 65 larynx kræft) og 414 var kontrolpersoner (tabel 1). Der var ingen signifikante forskelle i fordelingen af ​​alder og køn mellem cases og kontroller (tabel 1). De fleste forsøgspersoner var mænd (74%). Sammenlignet med kontroller, HNSCC sager var mere tilbøjelige til at ryge (P 0,001) og drikke kraftigt (P 0,001), og havde en højere forekomst af seropositivitet til HPV 16 (P 0,0001), HPV 18 (p 0,04), HPV11 (p 0,01), HPV35 (p 0,001), HPV52 (p 0,0003) og HPV58 (p. 0,003) (tabel 1)

Vi evaluerede sammenhængen mellem genotype og HPV serologi (tabel 2); i betragtning af den meget lave seroprævalens blandt kontroller (tabel 1), var det nødvendigt at teste denne associering ved hjælp af data fra alle fag.

TMC8

genotype var forbundet med HPV18 seropositivitet (OR

AT: 0,65, 95% CI 0,38-1,11, OR

TT: 0,48, 95% CI 0,24-0,99), med tilsvarende ikke-signifikant tendenser observeret for HPV16 (OR

AT: 0,91, 95% CI 0,54-1,55, OR

TT: 0,58, 95% CI 0,22-1,17), HPV31 (OR

AT: 0,60, 95% CI 0,33 -1,09, OR

TT: 0,48, 95% CI 0,22-1,04), og HPV52 (OR

AT: 0,25, 95% CI 0,09-0,67, OR

TT: 0,36, 95% CI 0.11- 1.13). Vi undersøgte yderligere sammenhængen mellem genotype og serologi blandt svælg kræfttilfælde; lignende OR s blev observeret, men med statistisk unøjagtighed (data ikke vist).

TMC8

genotype var også forbundet med en nedsat risiko for alle typer HNSCC (tabel 3). Sammenlignet med

TMC8

AA genotype, AT og TT genotyper blev omvendt forbundet med HNSCC (OR = 0,63; 95% CI: 0,45-0,89 og OR = 0,4954; 95% CI: 0,36-0,81 henholdsvis). Disse fund var konsistente på tværs anatomiske steder af HNSCC (tabel 3). For at bestemme om genotypen sammenslutning var uafhængig af HPV serologi, gennemførte vi undergruppe analyse af forsøgspersoner seronegative for HPV16 såvel som dem seronegative for alle testede HPV-typer (tabel 4). I overensstemmelse med tidligere analyser

TMC8

genotype blev omvendt forbundet med HNSCC blandt dem seronegative for HPV 16 (OR

AT = 0,67; 95% CI: 0,45-1,03; OR

TT = 0,58; 95% CI: 0,34-1,00); dette forhold forblev for dem negative for alle HPV-typer (eller

AT = 0,713; 95% CI: 0,45-1,11; OR

TT = 0,54; 95% CI: 0,31-0,93). Undergruppe analyse begrænset til dem seropositive ikke var muligt i betragtning af den lave forekomst af seropositivitet blandt kontroller (tabel 1).

Diskussion

I vores case-kontrol undersøgelse af hoved og halscancer, finder vi tegn på, at den genetiske variation i

TMC8

er omvendt forbundet med seropositivitet til HPV-typer højrisiko. Endvidere

TMC8

variant genotype er omvendt forbundet med risiko for HNSCC, uafhængig af anatomiske placering, og uafhængig af HPV-status.

Vi har tidligere rapporteret, at denne samme genetiske variation i

TMC8

var positivt associeret med kutane-typen HPV-infektion [2]. Ved første øjekast, disse påfaldende forskellige resultater mellem HPV-typer er overraskende. Men hvis vi overveje de strukturelle forskelle i alfa- og beta HPV genomer, dukker en model baseret på den virale E5 protein. En vigtig forskel mellem kutane (beta) HPV’er og høj risiko (alfa) typer er tilstedeværelsen af ​​E5 protein. I højrisiko HPV, E5 proteinet binder direkte til EVER /ZnT-1-komplekset [15]. Som Larzarczyk forklarer, EVER /ZnT-1-kompleks er et restriktionskort punkt for HPV-infektion, hvorved ændring af dette kompleks (og dens efterfølgende dysregulering af zink) er nødvendig for infektion at forekomme [1]. Det er sandsynligt, at

TMC8

polymorfi ændrer bindende potentiale HPV E5 proteinet til EVER /ZnT-1-kompleks, og det mindsker sandsynligheden for en produktiv HPV-infektion. I modsætning har de kutane typen HPV’er ikke stole på E5 for produktiv infektion (som kutane HPV genomet er blottet for E5). Gaud et al har vist, at

TMC8

polymorfi ændrer evne EVER2 til at interagere med TRADD og derved ændre apoptose potentiale [16]. Vi hypotesen, at den fælles genetiske variation i

TMC8

påvirkninger HPV modtagelighed ved to forskellige mekanismer, afhængig af tilstedeværelsen af ​​fravær af E5 protein.

In vitro

nødvendigt at endeligt besvare disse spørgsmål eksperimenter.

Mens EVER2 udtryk i keratinocytter har fået betydelig opmærksomhed, givet sin rolle i den nedarvede syndrom epidermodysplasia verruciformis, seneste arbejde viser, at EVER2 udtryk i T-lymfocytter overstiger den, der findes i keratinocytter. I T-celler er denne høje ekspression af EVER2 hurtigt nedreguleres ved TCR-stimulering, fører til en stigning i intracellulære Zn-niveauer. Vi hypotesen, at

TMC8

polymorfi modulerer denne biologi, påvirker T-celle overvågning funktioner og kræftrisiko. Yderligere epidemiologiske studier af ikke-virale medierede kræftformer vil hjælpe belyse, om

TMC8

er en generaliseret kræft modtagelighed faktor.

Der er flere begrænsninger på data i dette studie. Den serologiske endpoint anvendes, er yderst specifik for en højrisiko-HPV-infektion. Det skal dog bemærkes, at serologi som et slutpunkt har begrænset sensitivitet, da ikke alle individer montere en serologisk reaktion med HPV-infektion. I forbindelse med vores hypotese om

TMC8

genotype og modtagelighed for infektion, denne potentielle begrænsning i følsomhed ville skævhed vores resultater til null. En anden begrænsning af disse data er, at den serologiske respons vi vurderer ikke nødvendigvis afspejler en infektion ved tumorstedet, men måske i stedet afspejler en høj risiko infektion et andet sted end tumoren webstedet. Men den lave seroprævalens af højrisiko HPV blandt ikke-syge individer (tabel 1) viser, er dette sandsynligvis ikke en stor misklassifikation problem. Endelig på grund af denne lave seroprævalens af HPV-typer højrisiko i vores kontrol befolkning kan vi ikke teste, om

TMC8

genotype er associeret med infektion i ikke-syge individer, og dette vil være vigtigt at tage fat på fremtidige arbejde.

af interesse, en tidligere undersøgelse for livmoderhalskræft ved Wang et al, ved hjælp af en GWAS tilgang, identificeret en sjælden SNP i

TMC6 /8

region som er forbundet med HPV 16 viral vedholdenhed (rs9893818, A-allelen frekvens 2,5%) [5], hvilket indikerer, at genetisk variation over den fælles SNP præsenteret her, kan være vigtige for forståelsen af ​​HPV-infektion. En nylig undersøgelse fra Castro et al [6], rapporterede yderligere to almindelige SNPs i

TMC6 /TMC8

gen var forbundet med livmoderhalskræft, men denne undersøgelse manglede foranstaltninger på HPV (selv om det ville være underforstået blandt tilfælde) . Klart en omfattende evaluering af omfanget, karakter og fænotype af variation i

TMC6

/

TMC8

gen region vil tjene til at afgrænse mere fuldstændigt vores forståelse af genetiske modtagelighed for HPV-infektion. Endelig givet vores meget stærke associationer mellem

TMC8

genotype og HNSCC i dem uden tegn på HPV-infektion er det vigtigt at fastslå, om

TMC8

gen er en generaliseret kræft modtagelighed faktor.