PLoS ONE: Grape Proanthocyanidiner inducere apoptose ved Tab af mitokondrie membranpotentiale for Human ikke-småcellet lungekræft celler in vitro og in vivo

Abstrakt

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) udgør ca. 80% af de samlede sager lungekræft. kan betragtes Brugen af ​​ikke-giftige kosten fytokemikalier som en kemoterapeutisk strategi for forvaltningen af ​​NSCLC. Her rapporterer vi at vindruekerneolie proanthocyanidins (annoncer i Gmail) inducerer apoptose af NSCLC-celler, A549 og H1299,

in vitro

som medieres gennem øget ekspression af pro-apoptotisk protein Bax, nedsat ekspression af anti-apoptotiske proteiner Bcl2 og Bcl-xl, forstyrrelse af mitokondrisk membranpotentiale, og aktivering af caspaser 9, 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Forbehandling af A549 og H1299-celler med caspase-3 inhibitor (z-DEVD-FMK) signifikant blokeret annoncer i Gmail-induceret apoptose af disse celler bekræftede, at annoncer i Gmail-induceret apoptose medieres gennem aktivering af caspase-3. Behandlinger af A549 og H1299 celler med annoncer i Gmail resulterede i en stigning i G1 anholdelse. G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen vides at være kontrolleret af cyclinafhængige kinaser (Cdk), cyclinafhængige kinaseinhibitorer (Cdki) og cycliner. Vores western blot analyser viste, at annoncer i Gmail-induceret G1 cellecyklusstop blev formidlet gennem øget ekspression af Cdki proteiner (Cip1 /p21 og Kip1 /P27), og en samtidig reduktion i niveauet af Cdk2, Cdk4, Cdk6 og cycliner. Endvidere administration på 50, 100 eller 200 mg annoncer i Gmail /kg legemsvægt hos mus ved oral gavage (5 d /uge) markant inhiberede væksten af ​​

sc

A549 og H1299 lungetumor xenotransplantater i athymiske nøgne mus, der var forbundet med induktion af apoptotisk celledød, forøget ekspression af Bax, reduceret ekspression af anti-apoptotiske proteiner og aktivering af caspase-3 i tumor xenograft celler. Baseret på de data, der er opnået i dyr undersøgelse, blev menneske ækvivalent dosis af annoncer i Gmail beregnet, som synes overkommelige og opnåelige. Tilsammen tyder disse resultater, at annoncer i Gmail kan udgøre en potentiel terapeutisk middel til ikke-småcellet lungekræft

Henvisning:. Singh T, Sharma SD, Katiyar SK (2011) Grape Proanthocyanidiner inducere apoptose ved tab af mitokondriemembranen Potentiale for human ikke-småcellet lungekræft celler

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 6 (11): e27444. doi: 10,1371 /journal.pone.0027444

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: August 6, 2011; Accepteret: 17 okt 2011; Udgivet: November 8, 2011

Copyright: © 2011 Singh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Veterans Administration Merit anmeldelse Award (SKK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA og på verdensplan [1]. En af hver tre kræftrelaterede dødsfald skyldes lungekræft, og den dystre 5-års overlevelse på ca. 14% har vist nogen forbedring i de seneste tre årtier [2], [3]. Småcellet lungekræft og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for 90% af alle lungekræfttilfælde. NSCLC udgør ca. 80% af alle typer af lungekræft og omfatter planocellulært karcinom, adenocarcinomer, og store celle carcinomer [4], [5]. Selv om en kombination af kemoterapi og strålebehandling kan forbedre overlevelsen af ​​patienterne, de fleste patienter dør af sygdomsprogression, ofte som følge af erhvervet eller iboende resistens over for kemoterapeutiske lægemidler [6]. Derfor vil udforskning og udvikling af mere effektive terapeutiske midler og behandlinger, der kan målrette molekylerne er forbundet med tumorvækst og apoptose modstand føre til forbedrede resultater hos patienter med lungekræft.

Naturlige planteprodukter tilbyde lovende nye muligheder for udviklingen af ​​mere effektive kemoterapeutiske strategier for kræft i forskellige organer. Vindruekerneolie proanthocyanidins (annoncer i Gmail) er lovende fytokemikalier, der har anti-inflammatorisk [7] og anti-oxidant egenskaber [8] – [10], og synes at udvise minimal toksicitet i laboratoriedyr [9], [10]. Annoncer i Gmail let ekstraheres fra drue-frø, et biprodukt af druesaft og vin, men anvendes en blanding af flere polyphenoliske komponenter, der udgør dimerer, trimerer tetramerer, og oligomerer /polymerer af monomere catechiner og /eller (-) -epicatechins, som tidligere beskrevet [9], [10]. Vi mener, at i det mindste nogle af de tilstedeværende bestanddele i annoncer i Gmail virker synergistisk og kan tilvejebringe bedre kemoterapeutiske virkninger end en enkelt bestanddel.

Vi har tidligere vist, at kosttilskud af annoncer i Gmail med AIN76A kontrol kost resulterede i en dosis- inhibering af væksten af ​​A549 og H1299 NSCLC tumor xenograft i athymiske nøgne mus, og den vækstinhiberende virkning af annoncer i Gmail på NSCLC xenotransplantattumorer var forbundet med en forbedring af niveauerne af insulin-lignende vækstfaktor bindende protein-3 og anti- angiogene virkninger i tumoren mikromiljøer (11). I en anden undersøgelse også vi har rapporteret, at annoncer i Gmail hæmmer proliferation og inducere apoptose af NSCLC celler

in vitro

in vivo

tumorxenoplantater, som blev forbundet med deres hæmmende på cyclooxygenase- 2-ekspression og produktion af sin prostaglandin metabolit, PGE

2 (12). I modsætning hertil blev en signifikant inhibering af celleproliferation og induktion af apoptose i normale humane bronchiale epitelceller efter annoncer i Gmail behandling under identiske betingelser ikke observeret [11], [12]. På trods af anti-kræftfremkaldende effekter af annoncer i Gmail på NSCLC celler, er en præcis mekanisme i hæmmende virkning på NSCLC cellevækst og apoptose ved annoncer i Gmail ikke godt forstået. I denne meddelelse, vi gennemført en omfattende undersøgelse af den mekanisme, der er ansvarlig for hæmning af lungekræft celledeling og apoptose ved hjælp A549 og H1299 cellelinjer som

in vitro

cellekultur model og

in vivo

tumor xenograft model. At studere

in vivo

effekt af annoncer i Gmail på tumor xenograft vækst blev annoncer i Gmail givet til mus ved oral sondeernæring 5 dage /uge. Vi rapporterer, at annoncer i Gmail-induceret apoptotisk celledød af NSCLC-celler medieres gennem modulationer i ekspressionsniveauerne af pro- og anti-apoptotiske proteiner, tab af mitokondrie membranpotentiale og caspase-3-aktivering pathways. Annoncer i Gmail også tjekket den deregulerede cellecyklusprogression og tilknyttede regulatoriske proteiner i NSCLC celler. Således vores undersøgelser giver indsigt i den mekanisme, hvormed annoncer i Gmail inducere apoptose i disse celler. Derudover vores resultater giver en overbevisende begrundelse for den farmakologiske aktivitet af annoncer i Gmail mod humane ikke-småcellet lungekræft celler.

Materialer og metoder

Reagenser, kemikalier og antistoffer

de annoncer i Gmail anvendt i denne undersøgelse blev opnået fra Kikkoman Corporation (Noda, Japan). JC-1 mitochondriemembran Potentiel Detection Kit, og Anti-OxPhos Complex IV underenhed IV (Cox IV) blev erhvervet fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Celledød Detection ELISA Kits blev opnået fra Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN). De primære antistoffer blev købt som følger: antistoffer for Bcl-2, Bcl-xl, Bax, blev caspase-9, kløvet caspase-9 og -3, anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og β-actin købt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA); antistoffer til cytochrom c, Smac /DIABLO, cyklin D1, cyklin D2, cyclin E, Cdk2, Cdk4, CDK6, Cip1 /p21, Kip1 /P27 og de sekundære antistoffer, peberrodsperoxidase-koblede antimuse immunoglobulin G og anti-kanin immunoglobulin G var opnået fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Caspase-3-specifik inhibitor (z-DEVD-FMK) blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA). ApoTarget Kit specifikke for caspase-3-aktivitet assay blev opnået fra BioSource International, Inc. (San Diego, CA). Hams F-12, RPMI 1640, penicillin, streptomycin og trypsin /EDTA blev opnået fra Cellgro (Herndon, VA). De forøget kemiluminescens vestlige blotting afsløring reagenser blev indkøbt fra Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

Cell kultur og cellelinjer

Humane ikke-småcellet lungekræft-cellelinjer, A549 og H1299, og normale humane bronchiale epithelceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). A549 og H1299 cellelinier blev dyrket som monolag i Hams F-12 og RPMI 1640 dyrkningsmedium henholdsvis suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt i en inkubator med en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C. De annoncer i Gmail blev opløst i en lille mængde dimethylsulfoxid [DMSO, maksimal koncentration, 0,1% (vol /vol)], som derefter blev tilsat for at fuldføre cellekulturmedium før tilsætning til subsammenflydende celler (60-70% konfluerende). Celler behandlet med bærer alene (DMSO, 0,1% i medier) tjente som kontrol.

Analyse af apoptotisk celledød ved ELISA

Celler blev behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer og derefter høstet. Annoncer i Gmail-induceret apoptose blev bestemt ved anvendelse celledøden Detection ELISA Kit (Roche Diagnostics, Palo Alto, CA), der kvantificerer cytoplasmatiske histon-associerede DNA-fragmenter i form af mononucleosomes eller oligonucleosomes, ifølge producentens instruktioner.

caspase-3-aktivitet assay

aktiviteten af ​​caspase-3 i cellelysater blev målt under anvendelse af kolorimetriske proteaseanalyse ApoTarget Kit (BioSource International, Inc., CA) ved at følge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev A549 eller H1299-celler behandlet med annoncer i Gmail (20, 40, 60 og 80 ug /ml) i 48 timer. Derefter blev cellerne høstet ved hjælp af korte trypsinisering og cellelysater fremstilles ved at følge fabrikantens protokol. Prøver af cellelysaterne (100 ug protein per prøve) blev blandet med reaktionsbuffer og 200 pmol /l substrat (DEVD-pNA for caspase-3) og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C i mørke. Absorbansen blev derefter målt ved 405 nm, og prøveaflæsninger beregnes ved at trække absorbansen af ​​blindprøver.

DNA cellecyklusanalyse

Sub-sammenflydende celler (50-60%) blev behandlet med varierende koncentrationer af annoncer i Gmail i komplet medium i 48 timer. Cellerne blev derefter høstet, vasket med koldt PBS og behandles til cellecyklusanalyse, som beskrevet tidligere [13], [14]. Kort fortalt, cellerne (1 x 10

5) blev resuspenderet i 50 pi kold PBS, hvortil 450 pi kold methanol blev tilsat, og cellerne blev derefter inkuberet i 1 time ved 4 ° C. Cellerne blev centrifugeret ved 1.100 rpm i 5 minutter; pelleten blev vasket med kold PBS, resuspenderet i 500 pi PBS, og inkuberet med 5 pi RNase (20 ug /ml slutkoncentration) i 30 minutter. Cellerne blev inkuberet med propidiumiodid (50 ug /ml) på is i 1 time i mørke. Cellecyklus fordelingen af ​​cellerne blev derefter bestemt under anvendelse FACSCalibur instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) udstyret med CellQuest 3.3 software i Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) maskine på Core Facility af UAB Comprehensive Cancer Center.

Immunopræcipitation og western blot analyse

Efter behandling af A549 og H1299 celler med annoncer i Gmail, cellerne blev høstet, vasket med koldt PBS og lyseret med iskold lysisbuffer suppleret med proteasehæmmere, som detaljeret tidligere [12], [13]. For immunoblotting af cytochrom

c

, Smac /DIABLO og Cox IV, mitokondriske og cytosoliske fraktioner blev fremstillet fra cellerne, og proteinerne blev opløst på 10% Tris-glycin geler og overført til en nitrocellulosemembran. Efter blokering af de ikke-specifikke bindingssteder blev membranen inkuberet med det ønskede primære antistof ved 4 ° C natten over. Membranen blev derefter inkuberet med passende peroxidase-konjugeret sekundært antistof og immunreaktive bånd blev visualiseret under anvendelse af de forøget kemiluminescens reagenser. Hver membran blev strippet og igen undersøgt med anti-β-actin-antistof for at sikre lige protein loading.

I Cdk inhibitor (Cdki) -Cdk bindingsassay blev A549-celler behandlet med vehikel eller 60 ug /ml annoncer i Gmail i 48 timer, vaskes med iskold PBS, og hele cellelysater fremstillet som tidligere beskrevet [13]. Alikvoter indeholdende 200 ug protein blev ryddet med protein A /G-plus agaroseperler (Santa Cruz, CA). CIP1 /p21 og Kip1 /P27 proteiner blev immunopræcipiteret fra helcellelysater anvendelse af specifikke antistoffer efter inkubation i 8 timer efterfulgt af tilsætning af protein A /G-plus agaroseperler (50 uL, Santa Cruz, CA) og fortsatte inkubering natten over ved 4 ° C. Immunpræcipitater blev vasket, og efterfølgende udsat for Western blot-analyse under anvendelse af Tris-glycin-geler efterfulgt af immunoblotting under anvendelse af Cdk2, CDK4 og CDK6 antistoffer.

Assay for mitokondrie membranpotentiale

Ændringen i den mitokondriske membran potentiale i lungecancerceller efter behandling med annoncer i Gmail blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af fluorescerende lipofile kationiske probe JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodid) Påvisning Kit følge producentens anvisninger, og som beskrevet af os tidligere [13], [14]. JC-1 akkumulerer selektivt i intakte mitochondrier til dannelse multimer J-aggregater udsender fluorescens lys ved 590 nm. Den monomere form udsender lys ved 527 nm efter excitation ved 490 nm. Således kan farven af ​​farvestoffet skifter fra orange til grøn, afhængigt af mitochondriemembranpotential, og analyseres ved FACS med grøn fluorescens i kanal 1 (FL1) og orange emission i kanal 2 (FL2).

Dyr og tumor xenograft undersøgelse

Female atymiske nøgne mus (4-5 uger gamle) blev købt fra National Cancer Institute (Frederick, MD), har til huse i overensstemmelse med de retningslinjer Institutional Animal Care og brug Udvalg, og forsynet med steriliseret AIN76A kost og vand

ad libitum

. Alle mus blev holdt under standardbetingelser for en 12-h dark /12-timers lys cyklus, en temperatur på 24 ± 2 ° C og en relativ fugtighed på 50 ± 10%. Dyret, der bruges i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Alabama i Birmingham, og godkendt Animal Protocol Number er: 101109267.

For at bestemme den

in vivo

effektiviteten af ​​annoncer i Gmail mod human lungecancer tumor xenograft vækst, eksponentielt voksende A549 og H1299-celler (2 x 10

6) blev blandet i et 01:01 forhold med Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA), og en 100 uL suspension indeholdende 2 × 10

6 celler blev injiceret sc i den højre flanke af hver mus. Efter 24 timer blev musene tilfældigt inddelt i fire grupper (n = 10). Forsøgsdyr blev behandlet ved oral sondeernæring med 50, 100 eller 200 mg annoncer i Gmail /kg legemsvægt /dag i 100 pi PBS fem dage om ugen (mandag til fredag), der begynder en dag efter tumor celle implantation. Kontrolmus modtog samme volumen PBS. Eksperimentet blev afsluttet 58 dage efter inokulation af tumorceller. Tumorvækst blev overvåget 2 gange om ugen. Legemsvægt /mus og kost forbrug /mus blev registreret regelmæssigt i løbet af eksperimentet. Dyrene blev også overvåget, hvis de bliver syge eller lidende (manglende normale grooming og undgåelse adfærd) under hele eksperimentet periode. Ved afslutningen af ​​forsøget blev hele tumormasse høstet, vejet, og en del af tumoren blev anvendt til fremstillingen af ​​tumorlysater at analysere ekspressionsniveauerne af forskellige proteiner af interesse og resten blev anvendt til immunhistokemisk analyse.

Immunhistokemisk påvisning af PCNA-positive og TUNEL-positive celler

Fem-um tykke tumor snit blev afparaffiniseret og rehydreret i en gradueret serie af alkoholer. Efter rehydrering blev et antigen hentning proces udføres ved at placere objektglassene i 10 mM natriumcitratbuffer, pH 6,0 ved 95 ° C i 20 minutter efterfulgt af 20 minutter afkøling. Snittene blev vasket i PBS og ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med 1% BSA med 2% gedeserum i PBS før inkubation med anti-PCNA-antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask blev sektionerne inkuberet med biotinyleret sekundært antistof i 45 minutter, efterfulgt af HRP-konjugeret streptavidin, vask i PBS, inkubering med diaminobenzidin-substrat, og kontrastfarvning med hematoxylin. Apoptotisk celledød i tumorvæv blev påvist under anvendelse af terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL). Antallet af PCNA-positive og TUNEL-positive celler blev påvist og talt ved anvendelse af et lysmikroskop. Resultaterne er præsenteret som antallet af positive celler x 100 /samlede antal celler.

Statistisk analyse

Resultaterne fra

in vivo

undersøgelser er repræsentative for mindst 2-3 uafhængige forsøg. Den statistiske signifikans af forskellen mellem kontrol og annoncer i Gmail-behandlede grupper blev beregnet ved Students t-test (Sigma Stat 2,03, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Alle kvantitative data er vist som middelværdi ± SD. I tumor xenograft undersøgelse blev den statistiske signifikans af forskellen mellem kontrol og annoncer i Gmail-behandlede grupper bestemt ved ANOVA efterfulgt af Bonferroni t-test, og i hvert tilfælde P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

NSCLC-celler er følsomme for annoncer i Gmail-induceret apoptose

Vi har vist, at behandling af A549 og H1299 NSCLC celler med forskellige koncentrationer af annoncer i Gmail inhiberer væksten eller proliferationen potentiale af disse celler på en dosis- og tidsafhængig måde. Annoncer i Gmail inducerede også apoptotisk celledød af disse celler på en koncentrationsafhængig måde [11], [12]. Den annoncer i Gmail-induceret apoptose af A549 og H1299-celler efter behandling i 48 timer under anvendelse af FACS-analyse er opsummeret i figur 1A. Imidlertid ikke klart forstået en præcis mekanisme af anti-apoptotiske virkninger af annoncer i Gmail mod NSCLC-celler. Derfor blev de gennemførte undersøgelser for at bestemme den præcise mekanisme er involveret i apoptotisk celledød af NSCLC celler ved behandlingen med annoncer i Gmail.

(A)

In vitro

behandling af A549 og H1299 celler med annoncer i Gmail inducerer apoptose i en dosis-afhængig måde. Apoptotisk celledød blev analyseret ved hjælp af FACS-analyse, og den samlede procentdel af apoptotiske celler i A549 og H1299 celler er opsummeret som gennemsnit ± SD, n = 3. Signifikant forskel versus ikke-annoncer i Gmail-behandlede kontroller:

*

P

0,05;

¶

P

0,01;

†

P

0,001. (B) Behandling af A549 og H1299-celler med annoncer i Gmail resulterer i en dosisafhængig reduktion i ekspressionen af ​​anti-apoptotiske proteiner, Bcl-2 og Bcl-xl og samtidig øge ekspressionen af ​​pro-apoptotisk protein, Bax, som bestemt ved Western blot-analyse. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

annoncer i Gmail reducerer ekspressionen af ​​de anti-apoptotiske proteiner Bd-xl og bcl-2 og samtidig øge ekspressionen af ​​pro-apoptotisk protein Bax i A549 og H1299 celler

proteinerne i Bcl-2-familien spiller en stor rolle i regulering af apoptose ved at fungere som initiativtagere (

f.eks

., Bax) eller hæmmere (bcl-2 eller bcl-xl ) af celledød [15] – [17]. Anvendelse af Western blot-analyse, fandt vi, at behandling af A549 og H1299-celler med annoncer i Gmail i 48 timer resulterede i en dosisafhængig reduktion i niveauerne af anti-apoptotiske proteiner Bd-XL og Bcl-2, og en stigning i niveauet af pro-apoptotisk protein, Bax, sammenlignet med de vehikelbehandlede kontrolceller (figur 1 B). Således kan behandling af disse lungecancerceller med annoncer i Gmail ændre proteinniveauer af vigtige medlemmer af Bcl-2-familien på en måde, der favoriserer en stigning i forholdet Bax: Bcl-2, som kan bidrage til modtagelighed af cancerceller til GSP-induceret apoptose [15].

annoncer i Gmail inducerer tab af mitokondrie membran potentiale og en efterfølgende forbedring af frigivelsen af ​​cytochrom c og Smac /DIABLO i NSCLC celler

tab af mitochondriemembranpotential har været knyttet til initiering og aktivering af apoptotisk proces i celler [15], [16]. Frigivelse af cytochrom c og Smac /DIABLO fra mitokondrier i cytosolen bidrager til aktivering af caspaser og efterfølgende fører til apoptotisk celledød. At udforske virkningerne af annoncer i Gmail om denne proces i A549 og H1299-celler, cytosoliske og mitokondriske fraktioner blev fremstillet fra celler, der var blevet behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer. Resultaterne af western blot analyse viste, at behandling af annoncer i Gmail resulterede i en dosisafhængig stigning i cytochrom c og Smac /DIABLO udsætning i cytosolen og en tilsvarende reduktion i niveauet af cytochrom c og Smac /DIABLO i mitokondrie fraktioner i både A549 og H1299 celler (fig. 2A og 2B), hvilket antyder tab af det mitokondrielle membranpotentiale på annoncer i Gmail behandling i disse celler. Blottene blev strippet og re-testet med anti-COX IV antistof for at udelukke muligheden for krydskontaminering af mitochondriske og cytosolisk fraktioner. Tilstedeværelsen af ​​COX IV blev ikke påvist i cytosoliske fraktioner

(A B). Immunoblotting for cytochrom

c

og Smac /DIABLO hjælp cytosol og mitokondrie fraktioner fremstillet ud fra A549 og H1299 celler efter behandling med angivne koncentrationer af annoncer i Gmail i 48 timer. Blottene blev strippet og re-testet med anti-COX IV antistof for at sikre lige mitokondrielle protein lastning samt at udelukke krydskontaminering af mitochondriske og cytosolisk fraktioner. (C) Behandling af A549 og H1299 celler med annoncer i Gmail inducerer tab af mitochondriemembranpotential. Celler blev behandlet med angivne doser af annoncer i Gmail i 48 timer. JC-1 farvestof-farvet celle blev analyseret ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og Metoder. Data er repræsentative for to særskilte forsøg med identiske observationer.

For yderligere at kontrollere, at annoncer i Gmail fremkalde et tab af mitochondriemembranpotential, brugte vi det kationiske lipofile farvestof, JC-1, der ophobes i mitokondrier i en potentiale-afhængig måde. På sprængning af mitokondrielle membranpotentiale, fluorescensemissionen af ​​JC-1 farvestof skifter fra rødt til grønt. Otteogfyrre timer efter tilsætningen af ​​annoncer i Gmail, A549 og H1299-celler blev høstet, inkuberet med JC-1 farvestof og fluorescensemissionen analyseret under anvendelse af flowcytometri. Som vist i figur 2C, GSP behandling af A549 og H1299-celler resulterede i en dosisafhængig stigning i antallet af grønne fluorescens-positive celler, som vist i den nederste højre (LR) kvadrant af FACS-histogrammet. Kollektivt, disse undersøgelser tyder på, at annoncer i Gmail behandling inducere apoptose af både A549 og H1299 lungecarcinomceller gennem afbrydelse af mitochondriemembranpotential.

annoncer i Gmail inducerer aktivering af caspaser og PARP i både A549 og H1299 celler

frigivelsen af ​​cytochrom

c

og Smac /DIABLO i cytosol aktiverer procaspase 9 i apoptosome og fører til aktiv caspase-9 spaltning og spaltning af caspase-3 [18] – [20]. Aktivering af caspase-3 efterfølgende fører til apoptotisk celledød via spaltning af et bredt spektrum af målproteiner, herunder PARP. Derfor har vi fastslået, om induktion af apoptose af A549 og H1299 celler ved annoncer i Gmail medieres gennem aktivering af procaspase-9, caspase-3 og PARP proteiner. Behandling af A549 og H1299-celler med annoncer i Gmail i 48 timer resulterede i en dosisafhængig reduktion i niveauerne af caspase-9 og samtidig øge spaltningen af ​​caspase-9, caspase-3 og PARP-proteiner sammenlignet med de vehikelbehandlede celler (figur 3A ). De annoncer i Gmail-induceret aktivering af caspase-3 i A549 og H1299-celler blev også bestemt under anvendelse af en kolorimetrisk caspase-3-aktivitet assay. Behandling af både A549 og H1299 lungecancerceller med annoncer i Gmail i 48 timer resulterede i en signifikant højere (p 0,05; p 0,001) caspase-3-aktivitet på en dosis-afhængig måde end observeret i de vehikelbehandlede kontrolceller (figur 3B).

(a) Behandling af A549 og H1299-celler med annoncer i Gmail reducerer niveauet af caspase-9, mens forøger aktiveringen /kløvning af caspase-9, caspase-3 og PARP på en dosis-afhængig måde. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af annoncer i Gmail (0, 20, 40, 60 og 80 ug /ml) i 48 timer, derefter blev cellerne høstet, cellelysater fremstillet og underkastet western blot-analyse til påvisning af niveauerne af caspase-9, spaltes caspase-9, caspase-3 og PARP. En repræsentativ blot er vist fra tre uafhængige forsøg med lignende resultater. (B) Den caspase-3-aktivitet i cellelysater fra prøver af panel A blev målt ved anvendelse af et kolorimetrisk protease assay (ApoTarget Kit). Annoncer i Gmail behandling til A549 og H1299-celler øger aktiviteten af ​​caspase-3 dosisafhængigt. Signifikant forskel versus ikke-annoncer i Gmail behandlingsgruppen,

¶

P

0,01 og

*

P

0,001. (C) Virkningen af ​​annoncer i Gmail (60 og 80 ug /ml) blev bestemt på apoptose af A549 og H1299-celler efter 48 timer i fravær eller nærvær af 60 pmol /L i caspase-3 inhibitor (z-DEVD-fmk) . Indholdet af apoptotiske celler blev bestemt ved anvendelse detektion celledød ELISA-kit, som beskrevet detaljeret i Materialer og Metoder. Cellerne behandlet med z-DEVD-fmk blokerede annoncer i Gmail-induceret apoptose i A549 og H1299-celler. Procentdelen af ​​apoptotiske celler i forskellige behandlingsgrupper blev sammenfattet og data er præsenteret som gennemsnit ± SD fra to gentagne forsøg. Signifikant hæmning af caspase-3-inhibitor versus annoncer i Gmail alene behandlede celler,

*

P

0,001. CI = caspase-3-inhibitor, C = kontrol, uden nogen behandling.

Behandling med caspase-3 inhibitor (z-DEVD-FMK) blokerer annoncer i Gmail-induceret apoptose af både A549 og H1299 celler

for yderligere at bekræfte, at annoncer i Gmail-induceret aktivering af caspase-3 er involveret i induktion af apoptotisk celledød af A549 og H1299 human lunge kræftceller, vi stilling til, om annoncer i Gmail-induceret apoptose af A549 og H1299 celler blev påvirket ved tilsætning af caspase-3-specifik inhibitor (z-DEVD-fmk). A549 og H1299-celler var blevet behandlet med annoncer i Gmail med eller uden z-DEVD-fmk (60 pmol /l) i 48 timer. Celler blev høstet og celledød blev analyseret ved hjælp af Cell Død Detection ELISA kit følge instruktionerne fra producenten. Som vist i figur 3C (venstre panel), behandling af A549-celler med annoncer i Gmail ved koncentrationerne på 60 og 80 ug /ml resulterede i 31% og 49% apoptose eller celledød sammenlignet med 6,5% i ikke-annoncer i Gmail-behandlede kontrolceller . Behandlingen af ​​A549-celler med annoncer i Gmail (60 eller 80 ug /ml) i nærvær af z-DEVD-fmk resulterede i kun 14% og 17% apoptose, henholdsvis, hvilket klart viste, at tilstedeværelsen af ​​caspase-3-specifik inhibitor signifikant blokerede annoncer i Gmail-inducerede apoptotiske celler død (

P

0,001) i A549 celler. Lignende resultater blev fundet, når H1299 celler blev behandlet med annoncer i Gmail i nærvær eller fravær af z-DEVD-fmk, som vist i figur 3C (højre panel). Disse resultater indikerer, at annoncer i Gmail-induceret apoptose af både A549 og H1299 humane lungecancerceller er associeret med aktiveringen af ​​caspase-3.

annoncer i Gmail inducerer G1-fasen cellecyklusstandsning i NSCLC-celler

Based på de foreløbige undersøgelser, hvor vi observerede en stærk vækstinhiberende virkning af annoncer i Gmail på NSCLC-celler, vi derefter bestemt den mulige mekanisme af anti-proliferativ aktivitet af annoncer i Gmail hvilket kan føre til apoptotisk celledød. Til dette formål effekten af ​​annoncer i Gmail på cellecyklusprogression i A549 og H1299 celler blev bestemt efter behandling med annoncer i Gmail i 48 timer. Som opsummeret i figur 4, (felt A-D), behandling af A549-celler med annoncer i Gmail resulterede i en signifikant højere antal celler i G1-fasen ved alle koncentrationer anvendes: 20 ug /ml (58,3%,

P

0,05), 40 pg /ml (67,9%,

P

0,001) og 60 mg /ml (75,5%,

P

0,001) i forhold til den ikke -GSPs behandlet kontrol (52,7%). Som angivet i figur 4 (venstre paneler A-D), den dosisafhængige effekt af annoncer i Gmail på G1 standsning i A549-celler var stort set på bekostning af celler i S-fase med en minimal ændring i G2-M-celle population sammenlignet med den ikke -GSPs-behandlede kontrolceller (diagram A). Lignende effekt af annoncer i Gmail på G1 fasen blev også fundet i H1299-celler (figur 4, højre paneler A-D). Resultaterne af cellecyklusfordeling ved hver dosis af annoncer i Gmail er også sammenfattet i Panel E, hvilket indikerede signifikant anholdelse af A549 og H1299 celler i G0-G1 fasen efter annoncer i Gmail behandling.

Cellerne blev behandlet enten med køretøj ( 0,1% DMSO i mediet) eller 20, 40 og 60 ug /ml doser af annoncer i Gmail i komplet medium. Efter 48 timers behandling blev cellerne høstet og spaltet med RNase. Cellulært DNA blev farvet med propidiumiodid og flowcytometrisk analyse blev udført for at analysere fordelingen cellecyklus, som beskrevet detaljeret i Materialer og Metoder. (A-D) cellecyklusfordeling i A549 (venstre paneler) og H1299 (højre paneler) celler med behandlingen af ​​forskellige koncentrationer af annoncer i Gmail. (E) Data fra distributionen cellecyklus blev opsummeret og præsenteret som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikant versus ikke-annoncer i Gmail behandlet kontrolgruppe,

¶

P

0,05 og

*

P

. 0,01

annoncer i Gmail mindske udtryk for G1 regulatoriske proteiner af Cdk’er og cycliner i NSCLC celler

Undersøgelser har vist, at Cdk’er og cycliner spiller afgørende roller i reguleringen af ​​cellecyklusprogression [21], derfor har vi bestemt effekten af ​​annoncer i Gmail på protein niveauer af Cdk’er og cycliner som er negativt reguleret af Cdki (Cip1 /p21 og Kip1 /p27) under G1 fasen cellecyklusprogression. Som vist i figur 5 (panel A), behandling af A549-celler med annoncer i Gmail resulterede i et markant fald i ekspressionen af ​​Cdk2, Cdk4 og Cdk6 på en dosis-afhængig måde ved 48 timer efter annoncer i Gmail behandling. En stærk reduktion i Cdk’er blev observeret ved doser på 40-80 mg /ml koncentrationer af annoncer i Gmail. Tilsvarende blev en markant reduktion i ekspressionen af ​​cycliner D1, D2 og E observeret på en dosis-afhængig måde. blev også fundet identisk virkning af annoncer i Gmail når H1299-celler blev behandlet med annoncer i Gmail og under identiske betingelser (figur 5A, højre paneler).

Cellerne blev behandlet med enten vehikel (0,1% DMSO i mediet) eller annoncer i Gmail (20 , 40, 60 og 80 ug /ml) i 48 timer og derefter høstet, cellelysater fremstillet og derefter underkastet SDS-PAGE efterfulgt af Western blot-analyse, som beskrevet i Materialer og metoder.