PLoS ONE: “Glødende hoved” Mus: En genetisk værktøj Aktivering Pålidelig Prækliniske billedbaserede Evaluering af kræft hos immunkompetente Allografts

Abstrakt

Prækliniske terapeutisk vurdering i øjeblikket afhængig af væksten respons af etablerede humane cellelinjer xenotransplanteret ind immunsvækkede mus, en strategi, der generelt ikke er prædiktiv for kliniske resultater. Immunkompetente gensplejset mus (GEM)-afledte tumor allotransplantat modeller tilbyder meget medgørlige prækliniske alternativer og lette analysen af ​​klinisk lovende immunmodulerende midler. Billedområde reportere er afgørende for præcist at spore tumorvækst og respons, især for metastaser. Desværre, journalister såsom luciferase og GFP er fremmede antigener hos immunkompetente mus, potentielt hindrer tumorvækst og forstyrrende terapeutiske respons. Her vurderede vi værdien af ​​reporter-tolerante perler som allotransplantat ved at målrette minimal ekspression af et luciferase-GFP-fusionen reporter til den forreste hypofyse (døbt “Glowing hoved” eller GH mus). Luciferase-GFP reporter udtrykkes i tumorceller fremkaldte immunresponser hos vildtype mus, men ikke i GH mus, som transplantation værter. Antigeniciteten af ​​optiske reportere resulterede i et fald i både vækst og metastatisk potentiale af det mærkede tumor i vildtype-mus sammenlignet med GH-mus. Desuden kan reporterekspression også ændre tumoren respons på kemoterapi eller målrettet terapi i en kontekst-afhængig måde. Således GH mus og eksperimentelle metoder nøje undersøgt heri give koncept validering og en strategi for effektiv, reproducerbar prækliniske evaluering af vækst- og respons kinetik for sporbare tumorer

Henvisning:. Dag CP, Carter J, Ohler ZW, Bonomi C, El Meskini R, Martin P, et al. (2014) “Glødende hoved” Mus: En genetisk værktøj Aktivering Pålidelig Prækliniske billedbaserede Evaluering af kræft hos immunkompetente Allografter. PLoS ONE 9 (11): e109956. doi: 10,1371 /journal.pone.0109956

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: April 29, 2014 Accepteret: 9. september 2014 Udgivet: November 4, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette projekt er finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr HHSN261200800001E . Dette arbejde blev støttet delvist af Developmental Therapeutics Program i afdelingen for kræftbehandling og diagnose og Intramural Research Program for Center for Cancer Research, NCI, NIH. Leidos Biomedical Research Inc. ydet støtte i form af lønninger til forfatterne John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-Cherry, og Lionel Feigenbaum, men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsesdesign, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser:. Medforfattere John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-Cherry og Lionel Feigenbaum er ansat af Leidos Biomedical Research Inc. Leidos Biomedical Research Inc., er dedikeret til en enkelt kontrakt at betjene Frederick Nationallaboratoriet for Cancer Research (FNLCR), et føderalt finansieret forskning og udvikling center. Det er ikke involveret i nogen beskæftigelse, rådgivning, patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter mv i relation til denne undersøgelse. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Den gennemsnitlige lægemiddel udviklet af store farmaceutiske virksomheder er blevet anslået til at koste mellem 4 og 11 milliarder dollars [1], koster den gennemsnitlige cancerpatient ca. $ 100.000 om året. Disse svimlende omkostninger er drevet delvist af en manglende evne tidligt i udviklingsmæssige pipeline til pålideligt identificere lægemidler, der vil være effektiv, og den samlede godkendelse sats for en onkologisk forbindelse er i øjeblikket omkring 5% [2]. Meget af denne fiasko kan tilskrives den utilstrækkelige prækliniske modeller, der anvendes i terapeutisk vurdering. Historisk set har prækliniske dyreforsøg udnyttede årtier gamle etablerede humane cellelinjer, transplanterede som xenografter subkutant i immunkompromitterede mus [3]. Desværre har disse modeller havde begrænset effekt-prædiktiv værdi for lægemiddeludvikling, men er blevet anset for afgørende for at forbedre farmaceutiske produktivitet og patientpleje [4].

færdighed af prækliniske undersøgelser kræft er knyttet til det hensigtsmæssige ved dyremodel selv. Paramount er tilstedeværelsen af ​​et fuldt funktionelt immunsystem, som er involveret i stort set alle trin i udviklingen sygdom, og kritisk bestemmer behandlingsreaktioner [5]. Tumor celler interagerer gensidigt og dynamisk med immune og andre microenvironmental celler i hele forløbet af metastatisk progression og også følgende terapeutiske [6] intervention. Denne interaktion er passende modelleres både i autoktone gensplejset mus (GEM) kræftmodeller og ved ortotopisk transplantation af GEM-afledte allotransplantater (GDA’er) til fuldt immunkompetente vært mus [7], men ikke effektivt i de nuværende menneskelige kræft xenograftmodeller. Endelig bør terapeutisk og biomarkør evaluering ideelt stole på prækliniske kræftmodeller den gentog

naturligt forekommende

metastase, den mest dødelige kræft fase.

tractable prækliniske modeller kræver evnen til præcist at overvåge sygdomsprogression og terapeutisk respons lette vedtagelsen af ​​relevante kliniske endpoints [8]. overvågning sygdom er afgørende for metastaser og ellers upåviselige tumorer. Optisk billeddannelse af celler, der udtrykker lys-generering proteiner i øjeblikket dominerer overvågningsteknologi på grund af deres evne til at måle realtid begivenheder, omkostningseffektivitet og tid-effektive [9]. Men de fleste sporbare markørproteiner, herunder den populære ildflueluciferase (ffLuc) og vandmænd forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP), er xenobiotiske til pattedyr. Deres udtryk naturligt fremkalder forskellige immunreaktioner i immunkompetente dyr, hvilket resulterer i inkonsistent aktivitet [10], [11], afvisning af transplantater [12] og undertrykkelse af metastatisk aktivitet [13], confounding gyldighed prækliniske konklusioner. Således er den effektive anvendelse af miljøfremmede journalister begrænset til enten kortvarige undersøgelser, eller fuldt immunkompromitterede dyremodeller, begrænser prækliniske muligheder [9], [13].

For at overvinde disse problemer, har vi udviklet et GEM model, der er immun-tolerant over både ffLuc og eGFP at tjene som vært for transplantation af mærkede syngene tumorer. Brug af rottevæksthormon (rGH) promotor, udtryk for en ffLuc-eGFP fusionsproteinet var målrettet til den forreste hypofyse, en ikke-immun privilegeret sted fjernt fra almindeligt overvågede organer i prækliniske undersøgelser, og derved skaber “Glowing hoved” (GH) mus [14]. Vi viser, at i vildtype mus immunrespons hos miljøfremmede journalister betydelig indflydelse på progression og terapeutiske reaktioner af udskriftsområdet transplanterede tumorer. Vigtigt er det, at brugen af ​​præ-tolerante GH mus minimerer eller eliminerer disse afvigelser, hvilket resulterer i mere pålidelige, medgørlige prækliniske modeller.

Materialer og Metoder

lentivirusvektorer

lentiviral vektor, som udtrykker ildflueluciferase-forstærket grønt fluorescerende protein-fusionsprotein (FerH-ffLuc-eGFP) blev beskrevet tidligere [10]. Det blev her modificeret til at fjerne eGFP og indsætte et internt ribosombindingssted (IRES) og histon H2B-mærket eGFP (H2B-eGFP) til at generere FerH-ffLuc-IRES-H2B-eGFP, som er rettet mod ekspression af ffLuc og eGFP til cytoplasmaet og kernen hhv. Nærmere oplysninger om vektor sekvens vil blive ydet efter anmodning til Dr. Dominic Esposito (e-mail: [email protected])., Leidos Biomedical Research, Frederick, MD, USA

Dyr

for at reducere bioluminescens absorption og eksperimentel variation, albino 6- til 8 uger gamle indavlede hunmus på en C57BL /6 (C57BL /6

c-brd /c-brd /Cr) eller FVB /N baggrund blev anvendt som værter for transplantationsstudier. F1-mus fra avl af C57BL /6 med 129 (B6; 129) mus blev anvendt som isogene værter i studiet af NTM

Q61K /p19

ARF-null melanom, som blev afledt af en blandet genetisk baggrund [ ,,,0],15], [16]. Alle dyr, der anvendes i dette forskningsprojekt blev plejet og anvendt humant i henhold til følgende politikker: Den USA Public Health Service Policy på Humane Pleje og brug af dyr (1996); Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (1996); og den amerikanske regering principper for Udnyttelse og pleje af hvirveldyr, der anvendes i Testing, forskning og uddannelse (1985). Alle mus blev udført i nøje overensstemmelse med Animal Study protokoller godkendt af Animal Care og brug Udvalg (ACUC), NCI, i Frederick Nationallaboratoriet for Cancer Research, som er akkrediteret af AAALACi og følger Public Health Service Politik for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Følgende protokoller blev godkendt af ACUC til at udføre denne undersøgelse:. ASP # 08-084, 11-044, og 11-058

Musene i denne undersøgelse blev aflivet med CO2 kvælning efter NCI-godkendte ACUC retningslinjer : (1) Overfør musene til en CO2 kammer lige før eutanasi. (2) Tænd for CO2 på 2 liter per minut for en standard størrelse af kammeret. (3) Inden for cirka to til tre minutter, bør voksne mus være immobile og ikke reagerer; når dette er tydeligt, forøge strømningshastigheden til høj eller tilnærmelsesvis 10 liter /min. (4) Når vejrtrækning ophører for alle dyr set gennem buret, indstille timeren til 2 minutter. Ved udgangen af ​​to minutter, kan musene fjernes fra CO2-fyldte bur. Sørg døden ved at sørge for der er ingen bevægelser af enhver art i yderligere 60 sekunder uden for CO2-fyldte bur, ved hjælp af timeren.

Generation af “Glowing hoved” mus

rGH -hGH konstruere [17] (en gave fra Dr. Rhonda Kineman, University of Illinois-Chicago, Chicago, IL) blev modificeret ved insertion af en ffLuc-eGFP fusionsgen at generere den forreste hypofyse-targeting vektor, der blev anvendt til generere transgene mus i begge de C57BL /6 og FVB /N genetiske baggrunde ved blastocyst mikroinjektion. Små kolonier af homozygote transgene mus blev opretholdt til avl, og deres heterozygot afkom bruges til alle prækliniske undersøgelser. Al den transgene og avlsarbejde blev udført gennem Laboratory Animal Science Program, Frederick National Laboratory.

Murine tumorer, kræft cellelinjer, og deres mærkning

Lewis lungecancer (LLC) væv var opretholdes kun

in vivo

siden sin afledning fra den oprindelige lunge tumor C57BL /6 mus [8]. Den spontant metastaserende serielle HGF-tg /CDK4

R24C melanom hudtransplantation blev dannet fra en primær melanom induceret i HGF-tg /CDK4

R24C C57BL /6 mus ved epikutan anvendelse af carcinogen DMBA [18]. HGF-tg /CDKN2A

– /- melanom blev afledt fra tumorer induceret i HGF-tg /CDKN2A

– /- FVB-mus ved UV-bestråling [19]. Disse tumorer blev opretholdt, for syngene mus. Til transplantation, blev de høstede tumorvæv opdelt i 3 mm × 3 mm stykker og hver enkelt blev indsat i en 5-mm snit på huden på en mus. MVT-1 murine brystcancerceller blev afledt fra brysttumorer af MMTV-c-Myc /MMTV-VEGF bi-transgene mus på en FVB /N indavlede baggrund [20]. De blev etableret som en cellelinje og opretholdes gennem in vitro dyrkning. Til transplantation, blev 1,0 x 10

6 celler fremstillet fra kultur og injiceret subkutant i hver mus. Mutant nationale tilsynsmyndigheder

Q61K /P19

ARF-nul melanom celler blev dannet som beskrevet [15], [16]. I den første passage blev 1,0 × 106 celler fra in vitro kultur inokuleret i C57BL /6×129 F1-mus til dannelse af tumorer. I de følgende passager blev fragmenterne fordelt fra høstede tumor anvendes til transplantation, som beskrevet ovenfor.

For at mærke den

in vivo

vedligeholdte tumorer, cellesuspensioner fremstillet ud fra

in vivo

-expanded tumorer blev smittet

ex vivo

med lentivirus af

ex vivo

spinoculation [10], [21]. LLC væv blev inficeret med lentivirus kodende ffLuc-eGFP eller ffLuc-IRES-H2B-eGFP og derefter underkastet

in vivo

cykling til opnåelse ensartet mærkede tumorer, som tidligere beskrevet [8]. Cellelinier blev mærket med ffLuc-eGFP lentivirus

in vitro

, og EGFP

+ populationer blev isoleret under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS).

Prækliniske undersøgelser og patologisk analyse

For prækliniske studier, et kryogent bevaret mærket tumor blev genoplivet og udvidet ved subkutan transplantation i mus. Disse tumorer blev resektion efter at have nået 500 mm

3 og udvidet gennem passagen ind i det nødvendige antal mus for det faktiske undersøgelser, der er beskrevet i teksten. Tumorstørrelse blev målt manuelt, og beregnes som V (mm

3) = 0,5 × L × W

2, hvor L er længden og W er bredden i mm. For den prækliniske modellering af primære tumorer blev mus randomiseret i grupper efter at studere design, når deres tumorer nåede 125 mm

3. Kontrolgruppen fik vehikel-opløsning, og den eksperimentelle gruppe modtog behandlinger af kemoterapeutiske midler. Dosis og tidsplan i hvert forsøg er angivet i resultaterne. Når tumorer voksede til 2000 mm

3, mus havde nået deres endepunkter og blev aflivet til yderligere undersøgelse.

For prækliniske modeller af spontan metastase, blev primære tumorer fjernes kirurgisk efter at have nået 500 mm

3, og musene blev randomiseret i grupper efter undersøgelsens design. Metastase og gentagelse blev overvåget periodisk ved billeddannelse ved hjælp af Xenogen IVIS systemet [8] for at måle BL flux (foton /sek /radial grad). Kontrolgruppen fik vehikel-opløsning, og den eksperimentelle gruppe modtog behandlinger af kemoterapeutiske midler. Dosis og tidsplan i hvert forsøg er angivet i resultaterne. Når mus viste tegn på morbiditet, defineret ved dyreforsøg protokol den (f.eks kort af breathiness, svært ved at bevæge sig), de nåede deres endpoint og blev aflivet til yderligere undersøgelse.

De lægemidler, der anvendes i denne undersøgelse blev indhentet fra Drug Synthesis Kemi Branch, DTP, NCI (Bethesda, MD). Paclitaxel blev opløst ved 10x den ønskede koncentration i 100% ethanol, fortyndes med et tilsvarende volumen Cremaphor EL og derefter fortyndet til 1 x koncentration med saltopløsning før intravenøs injektion i mus. Gemcitabin blev opløst i vand og injiceres intraperitonealt i mus. Crizotinib blev resuspenderet i 0,5% methylcellulose i 0,9% saltvand, og indgives en gang dagligt ved oral sondeernæring (PO) over en 3-ugers periode på 10 ml /kg. Mus, der bærer subkutane tumorer blev randomiseret i 3 grupper baseret på tumormåling (200-500 mm

3), og behandlet med bærer alene, crizotinib ved 50 mg /kg, eller Crizotinib ved 100 mg /kg.

Høstede væv blev fikseret i 10% formaldehyd og paraffin-indstøbt. Tilstødende serielle snit blev farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05. Den mediane overlevelse blev beregnet som den mindste overlevelsestid, som overlevende funktionen nåede 50%. Beregningerne blev udført med GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA).

Resultater

Reporter aktivitet ffLuc-eGFP-mærkede murine tumorer er inkonsekvent i immunkompetente syngene mus

Den subkutant transplanteret Lewis lungecancer (LLC) er en velkarakteriseret metastatisk model, der for nylig er blevet udnyttet i flere højt profilerede prækliniske undersøgelser [22] – [24]. Vi har for nylig hentet arkiveret LLC væv aldrig tilpasset cellekultur, og viste, at efter transplantation og resektion metastase forekom med meget kort latenstid i 90% af syngene WT C57BL /6-mus vært [8]. Her mærkede vi LLC med en ffLuc-eGFP-kodet lentivirus

ex vivo

[10]. Da virale transduktion resultater i heterogen cellepopulation [25], udsætter vi denne mærkede tumor til

in vivo

cykling at gøre dem ensartet mærket [8], [26]. Kort fortalt mus med transplanterede tumorer overvåges for metastase, og metastatiske knuder vil blive høstet til subkutan transplantation at indlede næste cyklus. Da hver knude blev afledt fra en enkelt celle, tumoren afledte formentlig klonal. Derfor vil homogenitet blive styrket gennem hver cyklus. Som vist i fig. 1A, efter subkutan transplantation og resektion af det mærkede LLC i fem mus, der opstår metastaser blev let påvises ved

in vivo

bioluminescens (BL) billeddannelse. I denne passage, selv om tumorer voksede i alle værter, blev påvist metastaser i kun én (# 160 i fig. 1A, nedre panel). Vi høstede lunger fra mus og undersøgte det med

ex vivo

billeddannelse (fig. 1B, øverste panel). Den ulige fordelt BL intensitet afspejlede heterogenitet af transducerede celler i primær tumor (fig. 1B, øverste panel). Vi indsamlet fra værten mus tre individuelle godt mærkede lungemetastaser, formodes at være klonal, opdele dem i fem fragmenter til transplantation i fem C57BL /6 mus. Mærkede lungeknuder fra denne mus blev opsamlet og transplanteret ind i en anden fem C57BL /6-mus; men disse tumorer derefter voksede meget langsomt og /eller udviste ingen detekterbar reporter-aktivitet (fig. 1B). Disse resultater viser, at reporter-aktivitet i mærkede celler kunne ikke konsekvent opretholdt over passager i syngene immunokompetente mus, selv efter klonselektion.

A, murin Lewis lungecarcinoma (LLC) -celler blev inficeret med ffLuc-eGFP-udtrykkende lentivirus

ex vivo

, og subkutant transplanteret i fem syngene albino C57BL /6 (c-Brd) mus (# 160-164). Reporter-aktivitet blev overvåget ved BL billeddannelse af subkutan tumorvækst (kroppen) og pulmonal metastase (bryst). På dag 15 efter inokulering blev en metastatisk BL signal fundet i et af musene (# 160 i det nedre panel). B, blev Lungen høstet fra # 160, og en enkelt glødende metastatisk nodule valgt at bruge

ex vivo

imaging (øvre panel) blev transplanteret til fem C-Brd mus i den anden passage. Imaging Resultaterne viste, at reporter aktiviteten ikke kunne konsekvent fastholdt i de resulterende palpable tumorer (nederste panel).

For at afgøre, om reporter konsistens var afhængig af tumortype, vi udvidet vores analyse til mus melanom. En nationale tilsynsmyndigheder

Q61K-transformerede, p19

ARF-mangelfuld melanocytisk cellelinje [15], [16] blev mærket ved hjælp af ffLuc-eGFP lentivirus og transplanteret subkutant i syngene immunkompetente mus. Efter resektion en høj BL pulmonal knude blev valgt til subkutan transplantation i to mus (fig. S1a, venstre paneler). Begge tumorer udviste en signifikant reduktion i normaliseret BL aktivitet under subkutan vækst (Fig. S1A, højre paneler). Vi bekræftede disse resultater i to andre modeller. Melanomceller høstet direkte fra en HGF-transgene /CDKN2A-knockout FVB /N mus blev transduceret med ffLuc-eGFP-genet

ex vivo

, og transplanteres subkutant i syngene FVB /N-mus. Mens alle tumorer voksede, blev BL intensitet enten reduceres eller forøges langsommere (fig. S1B), og BL intensitet /størrelsesforhold, der tjener som indikator opbevaring mærkning, blev reduceret i tre af fem tumorer. I en anden model, ffLuc-eGFP-udtrykkende muse MVT-1 brystcancerceller transplanteret orthotopisk i bryst-fedtpuder syngene FVB /N-mus viste også ringe fastholdelse af BL-signalering (se nedenfor). Vi konkluderer, at ffLuc-eGFP udtryk i allotransplantater i immunkompetente vildtype (WT) mus inkonsekvent opretholdes mellem mus og /eller passager, uanset tumortype, genetisk baggrund eller transplantation site.

Generering af en PERLE model immunologisk tolerant til GFP og luciferase reportere

Vores resultater antydede, at immunogeniciteten af ​​miljøfremmede reporter genprodukter er i høj grad ansvarlig for deres uoverensstemmelse i forbindelse med et fuldt funktionelt immunsystem. For at omgå dette problem, genereret vi C57BL /6- og FVB /N-baserede GEM modeller anerkender ffLuc og eGFP proteiner selv. For sin høje specificitet, RGH gensekvenser [17] (Fig. 2A) blev anvendt til at målrette ekspressionen af ​​et ffLuc-eGFP fusion gen til den forreste hypofyse af musen og derved undgå at forstyrre signalering fra de mest almindelige metastatiske steder.

A, opbygning af ekspressionsvektor til frembringelse af glødende Head (GH) transgene mus. Ekspression af et ildflue-luciferase-eGFP fusionsgenet (ffLuc-eGFP) blev målrettet mod muse forreste hypofyse ved hjælp af rottevæksthormon promotoren (rGH) og humane væksthormon gensekvenser, som omfatter en polyadenylylation websted (hGHpA)

20. B, Optisk ekspressionsmønster af transgenet i GH mus som visualiseret ved BL billeddannelse. Reporter-aktivitet blev påvist i hypofyseforlappen af ​​begge køn og testiklerne af hanmus. C, Serum niveauer af væksthormon fra alderskategori GH mus og vildtype (WT) c-Brd mus blev vurderet ved ELISA (gennemsnit ± SE). Blod blev trukket tilbage på samme tidspunkt af dagen. Ingen signifikante forskelle i cirkulerende væksthormon niveauer mellem GH og WT mus blev fundet. D, ffLuc-eGFP-mærkede LLC tumorer blev subkutant transplanteret ind WT, GH og NOD-SCID-mus. Blod blev udtaget til fremstilling af sera, når tumorerne nåede 500 mm

3 og serumniveauerne af anti-GFP-antistof blev analyseret ved ELISA. Niveauerne af anti-GFP-antistof i WT mus er væsentligt højere end i GH og NOD-SCID-mus (p 0,005), men ingen forskel blev fundet mellem de i GH og NOD-SCID-mus (p = 0,19). Den sera fra raske mus uden tumor transplantation tjente som kontrol for at definere nulpunktet.

hypofyse er ikke en immun-privilegeret sted og er dermed en del af den systemiske cirkulation [27]. De transgene-kodet ffLuc og eGFP proteiner udtrykt i den forreste hypofyse under fosterudviklingen deltager derfor i udvælgelsen af ​​T og B-celler og er anerkendt som selv-antigener, hvilket resulterer i deres toleranceudvikling. For at reducere lys adsorption af pigment i ffLuc-eGFP transgen blev avlet i albino C57BL /6F (c-Brd) baggrund. Grundlægger linjer blev valgt fra hver stamme, der viste Mendelsk transgen arv og normal frugtbarhed. I vores tidligere undersøgelse, vi identificeret detektionsgrænse BL signal fra in vivo mus imaging var 1,5 × 10

5 foton /sek /rad [8]. For at undgå eventuelle forstyrrende effekter forbundet med høj transgen ekspression, de stiftende linjer udviser lav, men konsekvent BL signal over baggrund læsning (ca. 2-6 × 10

5 foton /sek /rad) blev udvalgt (fig. S2A). I overensstemmelse med målretning rapporteret for rGH-promotoren [17], BL signal var tydelig i hovedet og testiklerne af transgene linier (Fig 2B.); beskedne signal kunne også påvises i skjoldbruskkirtel, men kun ved hjælp af

ex vivo

imaging (ikke vist). BL niveauer i kroppen af ​​GH mus er tæt på dem i WT-mus, hvilket indikerer den høje specificitet af transgenet (fig. S2B). Baseret på det sted, reporter aktivitet og rGH promotor anvendes til målretning klenodier blev døbt “Glødende hoved” (GH) mus.

Den mulige effekt af transgen ekspression på hypofysen funktion blev evalueret ved at sammenligne cirkulerende væksthormon niveauer i GH og WT C57BL /6-mus. Vi fandt, at serum vækst hormon niveauer ikke var signifikant forskellig mellem transgene og WT (Fig. 2C), uanset køn, hvilket indikerer, at ekspressionen af ​​ffLuc-eGFP transgen ikke åbenlyst påvirker anterior hypofyse funktion i GH-mus.

for at vurdere de immunologiske konsekvenser af reporterekspression blev celler fra ffLuc-eGFP-mærkede LLC tumorer transplanteret subkutant i GH og WT C57BL /6-mus, såvel som MHC-uovertruffen, immunkompromitterede ikke-obese diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus (BALB /c baggrund). Når tumorerne nåede 500 mm

3 blod blev udtaget og sera testes for tilstedeværelsen af ​​anti-GFP-antistof. Mens tumorbærende WT mus besad signifikante niveauer af cirkulerende anti-GFP-antistof (fig. 2D og fig. S2C), blev ingen signifikant forskel mellem tumorbærende GH og NOD-SCID-mus, som er kendt inkompetente til at producere antistof (Fig . S2C). Disse data viser, at mens immunogen i WT mus, er ffLuc-eGFP tolereres og anerkendt som selvstændige i GH-mus.

Vækst og metastase af tumorceller, der udtrykker udskriftsområdet miljøfremmede reportere ændres i WT og NOD /SCID-mus i forhold til GH mus

for at teste funktionen af ​​GH mus, vi implanteret ffLuc-EGFP-mærkede tumorer subkutant i syngene WT og GH mus. Selvom tumorstørrelse steg ligeledes i begge typer vært mus blev BL stigninger i tumorer betydeligt forsinket i WT-mus sammenlignet med GH-mus (fig. S3A). Dette resultat antydede, at bruge GH mus som allotransplantat modtagere kunne bidrage til at afhjælpe de uoverensstemmelser, observeret i BL signaler fra mærkede tumorer transplanteret ind immunkompetente mus. For at validere dette punkt, testede vi GH mus i en større skala undersøgelse, der involverer både primær tumor og metastase. Metastatisk MVT-1 brystkræftceller [20], [28] blev transduceret med ffLuc-eGFP lentivirus og transplanteres orthotopisk i yverfedt puder af GH eller WT syngen FVB /N modtagende mus. Mærkede MVT-1-celler udviste en signifikant forøgelse i BL signalering over tid, når transplanteret ind GH mus vs. WT, som ikke har indeholdt signalering (fig. 3A og højere paneler af fig. S4A). Da billedområdet journalister er vigtige for overvågningen metastase, er ansvarlig for det store flertal af kræft patient dødsfald blev primære MVT-1 tumorer resektion og vært mus fulgt over tid.