PLoS ONE: Billedbehandling CXCL12-CXCR4 Signaling i kræft i æggestokkene Therapy

Abstrakt

Chemokine CXCL12 og receptor CXCR4 er dukket op som lovende terapeutiske mål for kræft i æggestokkene, en sygdom, der fortsat har en dystre prognose. CXCL12-CXCR4 signalering drev spredning, overlevelse, og invasion af æggestokkene kræftceller, hvilket fører til tumorvækst og metastase. Pleiotropiske virkninger af CXCR4 på flere vigtige skridt i kræft i æggestokkene tyder på, at blokering af denne vej vil forbedre resultaterne for patienter med denne sygdom. For at kvantificere CXCL12-CXCR4 signalering i cellebaserede assays og levende musemodeller af ovariecancer, udviklede vi et klik bille rød luciferase komplementation reporter, der detekterer aktivering af CXCR4 baseret på ansættelse af det cytosoliske adapter protein β-arrestin 2. Både i to- dimensionelle og tredimensionale cellekulturer, vi konstateret, at bioluminescens fra denne reporter måler CXCL12-afhængig aktivering af CXCR4 og inhibering af denne vej med AMD3100, et klinisk godkendt lille molekyle, som blokerer CXCL12-CXCR4 binding. Vi anvendte denne billeddannelsessystem at kvantificere CXCL12-CXCR4 signalering i en musemodel af metastatisk ovariecancer og viste, at behandling med AMD3100 afbrudt denne vej

in vivo

. Kombinationsbehandling med AMD3100 og cisplatin signifikant reduceret tumorbyrde i mus, selv om forskelle i samlet overlevelse var ikke signifikant større end behandling med hvert middel som monoterapi. Disse undersøgelser etablere en molekylær billeddannelse reporter system til analyse CXCL12-CXCR4 signalering i kræft i æggestokkene, som kan bruges til at undersøge biologi og terapeutiske målretning af denne vej i cellebaserede assays og levende mus

Henvisning:. Salomonnson E , Stacer AC, Ehrlich A, Luker KE, Luker GD (2013) Imaging CXCL12-CXCR4 Signaling i kræft i æggestokkene Therapy. PLoS ONE 8 (1): e51500. doi: 10,1371 /journal.pone.0051500

Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: August 23, 2012; Accepteret: November 1, 2012; Udgivet: 23 Jan 2013

Copyright: © 2013 Salomonnson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Research var støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH R01CA136553, R01CA136829 og P50CA093990) og Department of Defense (W81XWH-09-1-0128). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Chemokine CXCL12 (SDF-1) og dets receptor CXCR4 er stærkt impliceret som vigtige determinanter for tumor initiering og intraperitoneal metastaser af kræft i æggestokkene [1]. CXCL12 secerneres af ≈70-90% af ovariecancerceller samt mesotelceller i peritoneum hos mennesker og mus [2] [3] [4] [5]. Patienter med de højeste niveauer af CXCL12 udtryk i æggestokkene kræftceller har en betydeligt dårligere prognose, understreger den biologiske betydning af denne signalmolekyle i sygdomsprogression [6]. Virkninger af CXCL12 på ovariecancer synes at være medieret af CXCR4, en af ​​to kendte receptorer for dette kemokin. Amplifikation af CXCR4 er en tidlig begivenhed i malign transformation af ovarieepitelceller, hvilket antyder, at CXCL12-CXCR4 er kritisk for patogenesen af ​​denne sygdom [7]. Ca. 60% af patienter med kræft i æggestokkene har CXCR4 på maligne celler, og disse patienter har reduceret samlet overlevelse [4]. CXCL12 signalering via CXCR4 fremmer proliferation, invasion og metastase af ovariecancerceller, som alle bidrager til mere aggressiv sygdom. Bivirkningerne af CXCL12 på kræft i æggestokkene kan også skyldes virkninger på det stromale rum af tumor mikromiljø, herunder forbedrede angiogenese og rekruttering af immunosuppressive celler [8] [9] [10] [11].

Central funktioner af CXCL12-CXCR4 signalering i maligne celler og tumor mikromiljø position denne signalering akse som en vigtig målsætning at forbedre behandlingen for patienter med kræft i æggestokkene. I musemodeller, har vi og andre vist, at blokering af CXCL12-CXCR4 signalering med RNA-interferens mod CXCL12 eller et lille molekyle inhibitor for CXCL12-CXCR4-binding (AMD3100) begrænser væksten af ​​ovariecancercellelinjer implantater [12], [13], [14 ]. Inhibering CXCL12-CXCR4 signalering udvider også overlevelsen af ​​mus med ovariecancer. Men effekten af ​​monoterapi terapi er beskedne, hvilket tyder på, at målrette CXCL12-CXCR4 i kombination med et andet middel kan være mere gavnligt.

Etablering, at en forbindelse effektivt rammer sit tilsigtede mål er afgørende for udvikling af lægemidler i præklinisk modeller og kliniske forsøg. For at analysere farmakodynamik agenter målrettet CXCL12-CXCR4 signalering i musemodeller af kræft i æggestokkene, udviklede vi et klik billeluciferase komplementering reporter til at afbilde og kvantificere aktivering og hæmning af denne vej

in vivo

. I dette system er CXCR4 og det cytosoliske adapter protein β-arrestin 2 fusioneret til inaktive amino (CBRN) og carboxy (CBC) terminale fragmenter af smældere rød luciferase. Journalisten måler CXCL12 aktivering af CXCR4 signalering baseret på rekruttering af cytosoliske adapter protein β-arrestin 2 til denne receptor. Rekruttering af β-arrestin 2 er en almindelig, tidlig begivenhed i aktivering af kemokinreceptorer og den større familie af syv transmembrane receptorer [15]. Med luciferase komplementeringssystem, at interaktioner mellem CXCR4 og β-arrestin 2 Rekonstituer aktiv klik billeluciferase producere lys, hvilket giver et billeddannende metric for CXCR4 signalering i intakte celler tredimensionale sfæroide kulturer, og levende mus. Sfæroider er et vigtigt mellemprodukt mellem standard todimensionale celledyrkningsassays og tumorxenoplantater siden tumor sfæroider reproducere begrænset diffusion af forbindelser i tumorer og dannelse af ovariecancer sfæroider i ascitesvæske fra patienter. Da luciferase komplementering er reversibel, kan denne imaging reporter også bruges til at måle effekter af forbindelser blokerer CXCL12-CXCR4 signalering

in vitro

in vivo

.

Vi brugte dette imaging reporter til at analysere CXCL12-CXCR4 signalering i kræft i æggestokkene og fastslå, at AMD3100, et lille molekyle hæmmer af CXCR4, blokerer receptor aktivering i tumoren mikromiljø. Ved hjælp af denne billedbehandlingssystem, vi bestemt, at kombinationsbehandling med AMD3100 og cisplatin faldt betydeligt samlet tumor byrde i en musemodel af human ovariecancer med intraperitoneale metastaser. Disse resultater etablere en ny molekylær billeddannelse metode til at analysere CXCL12-CXCR4 signalering i kræft i æggestokkene og foreslå mulige terapeutiske fordele for at kombinere selektiv hæmning af denne kemokinreceptor vej med standard kemoterapeutiske lægemidler.

Materialer og metoder

Plasmider

for at generere fusioner af CXCR4 med det N-terminale fragment af klik bille rød luciferase (CBRN) (Promega), vi forstærket CXCR4 ved PCR og klonet produktet ind i Xhol- og Agel- steder af EGFP-N1 (Clontech). Vi anvendte PCR til at amplificere DNA-sekvensen for aminosyrerne 2-413 af smældere rød luciferase (CBRN) og klonet dette produkt i Agel- og Notl-stederne i EGFP-N1 [16]. Denne kloningsstrategi fjerner EGFP fra vektoren. Vi amplificeret sekvensen for aminosyrerne 395-542 af klik billeluciferase (CBC) ved PCR og klonet produktet i Agel- og Notl-stederne i EGFP-N1 til at skabe en fusion til C-terminalen af ​​β-arrestin 2 (gave fra Robert Lefkowitz). At overføre konstruktioner fra EGFP-N1 rygrad til lentiviral vector FUW anvendte vi PCR til at amplificere mål-DNA-sekvensen og tilføje Xbal-stederne til kloning. Konstrukter anvendt til denne undersøgelse er opsummeret i figur 1 (fig. 1A), og PCR-primere anvendt til kloning, er vist i tabel 1.

A) Panel viser lentivirale vektorer og stabilt transducerede celler til billeddannende undersøgelser. B) Skematisk diagram af klik bille rød komplementering system. N- og C-terminale fragmenter af smældere røde luciferase er fusioneret til den C-terminale ender af CXCR4 og β-arrestin 2. CXCL12 binding til CXCR4 forårsager rekruttering af β-arrestin 2 til den aktiverede receptor, rekonstituering klik bille rød luciferase til at producere lys.

Cells

HeyA8 ovariecancerceller (forudsat af Gordon Mills, MD Anderson Cancer center) blev stabilt transduceret med rekombinante lentivira for CXCR4-CBRN og Ar-CBC (HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC) [17]. Vi brugte lentiviral transduktion til at etablere populationer af HeyA8 celler stabilt udtrykker CXCL12 fusioneret til

Gaussia

luciferase (HeyA8-CXCL12-GL), ikke kondenseret

Gaussia

luciferase (Hey-GL), og ildflueluciferase og grønt fluorescerende protein (GFP) (HeyA8-FL /GFP) [18], [19]. Vi transduceret også HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler med fluorescerende protein eqFP650 [20]. Figur 1 viser en liste af stabilt transducerede celler anvendt i denne undersøgelse (Fig. 1A). Alle celler blev holdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 0,1% penicillin /streptomycin.

Flowcytometri

Intakte celler blev farvet med et antistof mod CXCR4 (klon 12G5 , R eller 2) HeyA8-FL /GFP celler kombineret med lige mange enten HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL celler henholdsvis for analyser af cellelevedygtighed i respons på cisplatin. For eksperimenter med AMD3100, stigende koncentrationer af forbindelse, blev tilsat til sfæroider én dag efter podning i hængende drop plader. Vi inkuberede sfæroider med AMD3100 eller køretøj i en eller to dage før kvantificering af bioluminescens. HeyA8-FL /GFP celler i sfæroider med enten HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL celler blev behandlet til en eller to dage med stigende koncentrationer af cisplatin. Vi kvantificeret fluorescens fra eqFP650 på en IVIS Spectrum før kvantificere bioluminescens efter tilsætning 6 ug /m luciferin til hver klumpformet. Vi normaliseret bioluminescens fotonflux til fluorescens udstråling at tage højde for forskelle i celle numre.

Dyreforsøg

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Michigan Udvalg for brug og pasning af dyr. Dyrene blev skiftet til klorofyl-fri chow (Research Diets) for alle undersøgelser for at minimere baggrundsfluorescens i billeddiagnostiske undersøgelser. 2,5 × 10

5 celler hver af HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL-celler blev injiceret intraperitonealt i 100 pi 0,9% NaCl i 5-7 uger gamle kvindelige NOD /SCID

IL2rγ

– /- hunmus (Taconic). At inhibere CXCL12 binding til CXCR4, anvendte vi 5-dages, 1,0 pl /time osmotiske pumper (for forsøget er vist i fig. 5) eller 14-dages, 0,5 pl /time osmotiske pumper (for forsøget er vist i fig. 6) (Alzet) lastet med 25 mg /ml AMD3100 eller 0,9% NaCl køretøj kontrol. Pumperne giver 1,25 eller 0,625 mg AMD3100 /g /time til hver mus. Pumper blev implanteret på tidspunkter, der er angivet i teksten for hver figur. Til undersøgelser behandling er vist i figur 6, vi injicerede mus med 4 mg /kg cisplatin eller matchet køretøj i.p. hver 5 dage. Cisplatin eller PBS vehikelinjektioner fortsatte i hele den periode på to uger, at osmotiske infusionspumper var på plads. Alle mus modtog aktiv forbindelse (AMD3100 og /eller cisplatin) eller matchet køretøj for begge administrationsveje (osmotisk infusionspumpe og i.p.-injektion). Som eksempler køretøj kontrolmus modtog osmotiske pumper med 0,9% NaCl og i.p. injektioner af PBS, mens mus i AMD3100 behandlingsgruppen havde osmotiske pumper med AMD3100 og i.p. PBS.

Mus imaging

Bioluminescens imaging blev udført på en IVIS Spectrum (Perkin Elmer). Fluorescensimagografi og billeluciferase billeddannelse med luciferin blev udført som tidligere [23] beskrevne. Imaging data blev kvantificeret som fluorescens udstråling eller fotonflux hhv. Data for klik bille rød luciferase komplementering blev normaliseret til den samlede tumorbyrde vurderet af fluorescens fra eqFP650.

Statistik

Grafer og statistiske analyser blev forberedt med GraphPad Prism. Cellekultur blev udført 3-5 gange, mens dyreforsøg blev udført to gange. Data blev afbildet som gennemsnitsværdier med standardfejl på middelværdien (SEM). Datapar blev analyseret ved Mann-Whitney U test for at afgøre statistisk signifikante forskelle. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev analyseret ved Gehan-Breslow-Wilcoxon Test.

Resultater

Klik bille komplementering reporter for interaktion af CXCR4 og β-arrestin 2

CXCL12 binding til receptor CXCR4 resulterer i rekruttering af det cytosoliske adapter protein β-arrestin 2 til den aktiverede receptor. Til billedet og kvantificere denne vigtigt skridt i signaltransduktion, brugte vi en nyligt beskrevet proteinfragment komplementation assay baseret på klik bille rød luciferase [16]. I dette system er CXCR4 fusioneret til N-terminalt fragment af klik billeluciferase (CXCR4-CBRN) og β-arrestin 2 til det C-terminale fragment af dette enzym (Ar-CBC) (fig. 1B). Rekruttering af β-arrestin 2 til CXCR4 også samler luciferase fragmenter for at producere bioluminescens som et kvantitativt mål for denne protein-interaktion i CXCR4 signalering.

Vi transducerede HeyA8 ovariecancer celler med lentivirusvektorer for CXCR4-CBRN og Ar- CBC. HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler phosphoryleret AKT som respons på inkubering med CXCL12 som bestemt ved Western blotting, der viser, at disse celler aktiveret en kendt nedstrøms effektor af CXCL12-CXCR4 (fig. 2A). I forhold til forældrenes HeyA8 celler, viste HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler større aktivering af AKT som reaktion på CXCL12, i overensstemmelse med transducerende ekstra funktionelle CXCR4 i imaging reporter cellerne. Vi viste også, at HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler viser tidsafhængig aktivering af kinaser ERK1 /2, der blev inhiberet af en fusion mættende (1 uM) af CXCR4 inhibitor AMD3100 (fig. 2B). HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler overekspression β-arrestin 2-CBC i forhold til den endogene protein, som bestemt ved Western blotting.

A) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og forældreorlov HeyA8 celler behandlet med stigende koncentrationer af CXCL12 i 10 minutter. Western blot af totale cellelysater viser phosphoryleret og total AKT hhv. Vi brugte GAPDH som en belastning kontrol. Graf viser relative band intensiteter for phosphoryleret AKT i hver cellelinje normaliseret til total AKT og GAPDH. B) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler blev behandlet med 100 ng /ml CXCL12-α i 0, 5, 15 eller 30 minutter i fravær eller nærvær af 1 uM AMD3100. Totale cellelysater blev probet for phosphoryleret og total ERK1 /2. Lysater blev også analyseret ved Western blot for ekspression af β-arrestin 2-CBC og endogen β-arrestin 1 og 2. GAPDH er vist som en loading kontrol. C) Flowcytometri af CXCR4-ekspression i forskellige HeyA8 cellelinier anvendt i dette studie. Mørk linie og stiplede linier i histogram plots betegne isotypekontrol og farvning med CXCR4 antistof.

Vi bruges flowcytometri til at vurdere celleoverfladeekspression af CXCR4 på HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler, som samt forældrenes HeyA8 celler og celler stabilt transduceret med

Gaussia

luciferase (HeyA8-GL), CXCL12 fusioneret til Gaussia luciferase (HeyA8-CXCL12-GL), eller ildflueluciferase og GFP (HeyA8-FL-GFP). Alle celler udtrykte tilsvarende niveauer af celleoverfladen CXCR4 (Fig. 2C). Selvom transduceret med CXCR4-CBRN, HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler havde niveauer af celleoverfladen CXCR4 som var sammenlignelige med parentale HeyA8 celler, sandsynligvis fordi overekspression af β-arrestin 2 årsager internalisering af denne receptor fra celleoverfladen. [24], [25].

CXCL12 drev komplementering mellem CXCR4 og β-arrestin 2

For at fastslå, at bioluminescens fra HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler foranstaltninger aktivering af CXCR4 signalering behandlede vi monolagskulturer af disse celler med stigende koncentrationer af CXCL12 i 60 minutter. Vi behandlede parallelle kulturer af celler med en inhibitorisk koncentration (1 uM) af CXCR4 inhibitor AMD3100 eller vehikelkontrol i inkubationsperioden [26] [27]. Behandling med CXCL12 produceret en koncentrationsafhængig forøgelse bioluminescens fra sammenslutning af CXCR4-CBRN og Ar-CBC, når maksimal 3 gange induktion ved 1 ug /m CXCL12 (fig. 3A). Til sammenligning celler behandlet med AMD3100 viste kun basal bioluminescens med nogen reaktion på CXCL12.

A) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler blev udpladet som todimensionale kulturer i plader med 96 brønde og inkuberet med stigende koncentrationer af CXCL12-α i nærvær af 1 uM AMD3100 eller vehikelkontrol. Data blev afbildet grafisk som middelværdier for luminescens i forhold til celler ikke behandlet med CXCL12 (n = 4 pr betingelse). Fejlsøjler angiver SEM. B) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler blev behandlet med 100 ng /ml CXCL12 til forøgelse tidsperioder i nærvær af 1 uM AMD3100 eller vehikelkontrol. Data blev afbildet grafisk som middelværdier ± SEM for luminescens i forhold til celler der ikke er inkuberet med CXCL12 (n = 4 pr betingelse). *, P 0,05; **, P. 0,01

Vi inkuberes også HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler med 100 ng /ml CXCL12 og 1 uM AMD3100 eller køretøj kontrol for at øge perioder gennem 4 timer før måling luciferaseaktivitet. I forhold til ubehandlede celler, celler inkuberet med 100 ng /ml CXCL12 og kontrolvehikel viste tidsafhængige stigninger i bioluminescens og toppede på ca. 2 gange induktion ved 2 timer og derefter faldende beskedent (fig. 3B). AMD3100 fuldstændig blokeret virkninger af CXCL12 på bioluminescens komplementering mellem CXCR4-CBRN og Ar-CBC. Kollektivt, disse undersøgelser viser, at bioluminescens fra HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler reagerer på CXCL12 og fastslå, at denne reporter systemet kan kvantificere hæmning af CXCL12-CXCR4 signalering.

Drug effekter i klumpformet kultur

Nylige undersøgelser tyder på, at sfæroider og lignende tredimensionelle cellekultursystemer er mere fysiologiske modeller af narkotika målretning og effekt, på grund af faktorer, herunder direkte intercellulære interaktioner og begrænset diffusion af forbindelser [28], [29]. Desuden ovariecancerceller hos patienter danner sfæroider i ascites, hvilket udgør en potentiel barriere for drug delivery [30]. For at modellere tumor mikromiljø af ovariecancer

in vivo

, vi brugte sfæroider af HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler kombineret med lige mange HeyA8-CXCL12-GL celler, gengive menneskelig ovariecancer, hvor tumor celler udskiller CXCL12 og /eller udtrykke CXCR4. Mens parentale HeyA8 celler ikke udtrykker CXCL12 som bestemt ved QRT-PCR (data ikke vist), HeyA8-CXCL12-GL celler udskiller ca. 12 ng /ml CXCL12 i en 24 timers periode, som kan sammenlignes med værdier rapporteret for andre ovariecancerceller at udskille dette chemokin endogent [19] [31]. Vi behandlede sfæroider med stigende koncentrationer af AMD3100 i 24 timer før kvantificering af bioluminescens. I forhold til sfæroider behandlet med kontrol køretøj, AMD3100 hæmmede bioluminescens fra sammenslutning af CXCR4-CBRN og Ar-CBC. Luciferaseaktivitet fra komplementation reporter faldt med ≈50% i sfæroider blev behandlet med 1 uM AMD3100 (p 0,05) (fig 4A.). Vi observerede lignende resultater, når vi udvidede inkubationer til to dage med AMD3100 (data ikke vist). Inhibering af CXCR4, som kvantificeret ved komplementering assayet, var mindre effektiv til sfæroider sammenlignet med monolagskultur, hvilket antyder, at tredimensionale arkitektur grænser penetration af AMD3100 til alle celler. Det bemærkes imidlertid, at kugleformede kulturer teste virkningerne af kronisk eksponering for CXCL12 snarere end akut tilsætning af kemokin som udført i to-dimensionelle kultur, hvilket også kan bidrage til forskelle i effekten af ​​AMD3100.

A) sfæroide kulturer af HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler blev behandlet i 24 timer med stigende koncentrationer af AMD3100. Data blev afbildet som middelværdier ± SEM for luminescens for klik bille komplementering forhold til sfæroider behandlet kun med køretøj kontrol (n = 10 spheroids pr tilstand). B) HeyA8-FL-GFP-celler blev dyrket som sfæroider med HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL-celler og derefter behandlet med stigende koncentrationer af cisplatin i 24 timer. Data blev afbildet grafisk som middelværdier ± SEM for ildflueluciferase luminescens forhold til sfæroider ikke behandlet med cisplatin (n = 10 sfæroider pr betingelse). *, P. 0,05

Vi testede beskyttende virkninger af CXCL12 mod cytotoksicitet fra cisplatin, en standard kemoterapeutisk lægemiddel til kræft i æggestokkene. Til disse assays anvendte vi HeyA8-FL-GFP-celler, som endogent udtrykker CXCR4 (se fig. 2C). Ildflue-luciferaseaktivitet er direkte proportional med antallet af tumorceller, hvilket giver en let assay for cellelevedygtighed i intakte sfæroider [32]. Vi genererede sfæroider kombinerer HeyA8-FL-GFP-celler med HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL-celler, henholdsvis og derefter behandlet sfæroider med stigende koncentrationer af cisplatin i 24 timer. I sfæroider indeholdende HeyA8-CXCL12-GL celler blev HeyA8-FL-GFP celler beskyttes beskedent mod cytotoksiske virkninger af cisplatin, men kun på 10 uM vi konstatere væsentlige forskelle i cytotoksicitet i forhold til sfæroider indeholder HeyA8-GL-celler (p 0,05) (fig. 4B). Omfanget af cytotoksicitet var sammenlignelig efter lægemiddelbehandlinger mod 48 timer (data ikke vist). Disse undersøgelser viser, at CXCL12 giver meget beskeden beskyttelse mod cisplatin i sfæroider består udelukkende af æggestokkene cancerceller.

In vivo

billeddannelse af CXCR4 og β-arrestin 2 komplementering i æggestokkræft

Vi brugte en menneskelig tumor xenograft model af metastatisk intraperitoneal ovariecancer at afgøre, i hvilket omfang komplementering mellem CXCR4 og β-arrestin 2 registrerer CXCR4 aktivering og hæmning

in vivo

. Vi co-injicerede lige mange HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler intraperitonealt i mus og brugte bioluminescens imaging at kvantificere rekruttering af β-arrestin 2 til CXCR4. Under baseline betingelser, vi let observeret bioluminescens fra komplementering mellem HeyA8-CXCR4-CBRN og Ar-CBC (fig. 5A), hvilket indikerer aktiv CXCR4 signalering i maligne celler. Vi adskilles derefter tilfældigt mus i grupper behandlet i fem dage med enten AMD3100 eller kontrol køretøj leveret fra osmotiske infusionspumper. Der var ingen fænotypiske tegn på toksicitet i mus behandlet med AMD3100. Mus behandlet med AMD3100 havde relativt mindre vækst af kræft i æggestokkene celler end dyr, der modtager kun kontrol køretøj som kvantificeret ved fluorescens fra langt rødt fluorescerende protein eqFP650 udtrykt i maligne celler (Fig 5B.) (P 0,05). Anvendelse af fluorescens fra eqFP650 at normalisere for forskelle i det totale antal ovariecancerceller, bioluminescens fra interaktionen af ​​CXCR4-CBRN med Ar-CBC var signifikant lavere i mus, der modtog AMD3100 i fem dage sammenlignet med vehikelkontrol. Tilsammen viser disse data anvendeligheden af ​​denne imaging system til måling farmakologisk målretning af CXCL12-CXCR4 signalering og resulterende virkninger af tumorvækst

in vivo

(figur 5C.) (P 0,05).

A) Repræsentative billeder af mus med intraperitoneale implantater af HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler. Billeder blev opnået før og efter 5 dages behandling med osmotiske pumper indeholder AMD3100 eller kontrol køretøj. Scale bar viser intervaller af fotonflux værdier vises på pseudofarve billeder. B) Fluorescens fra ovariecancerceller blev målt i levende mus behandlet med AMD3100 eller vehikelkontrol. Graf viser middelværdier + SEM for fluorescens i forhold til værdier målt på dag 0, før du begynder behandlingen. Pile viser den periode, hvor osmotiske pumper var på plads. C) Kvantificeret foton flux data for klik bille rød komplementering i mus behandlet med AMD3100 eller kontrol køretøj, hhv. Data blev normaliseret til tumor fluorescens for hver mus og plottes som middelværdier + SEM (n = 7 mus pr gruppe). *, P. 0,05

Kombinationsbehandling med AMD3100 og cisplatin reducerer tumor byrde

Vi har tidligere vist, at enkeltstofbehandling behandling med AMD3100 alene beskedent forbedrer overlevelsen af ​​mus med intraperitoneal dissemineret æggestokkræft [14]. Vi antager, at kombineret behandling med AMD3100 og en standard kemoterapeutisk lægemiddel i væsentlig grad forbedre tumor kontrol og overlevelse, baseret på undersøgelser i leukæmi viser, at CXCL12 i tumormikromiljøet giver resistens mod standard cytotoksiske lægemidler [33]. For at teste denne hypotese, vi implanterede mus med HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler. En uge efter implantering tumorer vi randomiseret mus til fire behandlingsgrupper: 1) vehikelkontrol; 2) AMD3100 leveret af to-ugers osmotisk infusionspumper; 3) cisplatin indgivet som 4 mg /kg i.p. hver 5 dage; og 4) kombineret AMD3100 og cisplatin. Vi fortsatte cisplatin injektioner gennem to-ugers leveringstid på AMD3100 pumper og derefter ophørte al terapi.

Vi brugte bioluminescens fra HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC at analysere CXCR4 signalering

in vivo

og fluorescens billeddannelse til eqFP650 at kvantificere tumorbelastning over tid. Vi beregnede arealet under kurven for bioluminescens og fluorescens og anvendes forhold mellem disse parametre til at vurdere inhibering af CXCR4 over tid (fig. 6A). Mus behandlet med AMD3100 eller kombinationen af ​​AMD3100 og cisplatin havde signifikant lavere bioluminescens fra CXCR4-CBRN og Ar-CBC komplementering i forhold til den samlede tumor byrde, der viser, at dette stof succes blokerer CXCR4 signalering i æggestokkene cancerceller

in vivo

(p 0,01)

A) Arealet under kurven analyse af billeddata for forhold mellem smældere røde luciferase komplementation for CXCR4 og β-arrestin 2 normaliseret til eqFP650 fluorescens (tumorbelastning) i mus implanteret med HeyA8. -CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler. Data er vist for grupper behandlet med vehikelkontrol, AMD3100, cisplatin, eller begge AMD3100 og cisplatin i to uger begynder en uge efter implantering celler. Graf viser middelværdier + SEM (n = 7 mus per gruppe). *, P 0,05. B) Areal under kurven analyse af fluorescens fra eqFP650 produceret af implanterede ovariecancerceller løbet af eksperimentet. Graf viser middelværdier + SEM. *, P 0,05, **, p 0,01. C) Kaplan-Meier-kurver for overlevelsen af ​​mus behandlet med vehikel, AMD3100, cisplatin, eller AMD3100 og cisplatin. Alle behandlingsgrupper adskiller sig fra køretøj kontrol (p 0,05). Men ikke fra hinanden

Mus behandlet med enkeltstof AMD3100 eller cisplatin havde beskeden, men signifikant, reduktioner i tumor byrde målt ved fluorescens billeddannelse løbet løbet af forsøget (p 0,05) (fig 6B.). Til sammenligning kombinationsbehandling med både AMD3100 og cisplatin væsentligt reduceret samlede antal HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler i forhold til køretøjets styring eller enten narkotika alene (p 0,01 og p 0,05, henholdsvis). Disse forskelle var tydelige, selvom mus fik kun to ugers behandling med disse lægemidler. Mus der fik implanteret HeyA8 ovariecancer celler udviklet ascites, men der var ingen forskel i samlede vægte krop mellem forskellige behandlingsgrupper (data ikke vist). Der var en tendens til forbedret overlevelse hos mus behandlet med både AMD3100 og cisplatin (fig. 6C). Men forskelle mellem AMD3100, cisplatin, og kombineret AMD3100 og cisplatin var ikke signifikant, selv om alle behandlinger forbedret overlevelse i forhold til køretøjets kontrol (p 0,05).

Diskussion

Kræft i æggestokkene er fortsat den førende dødsårsag fra gynækologiske maligniteter med et samlet fem år overlevelse ≈50%. Dårlig prognose af kræft i æggestokkene skyldes til dels det faktum, at de fleste patienter stede med fremskreden sygdom associeret med intraperitoneal, lever, eller systemiske metastaser [34]. Kræft i æggestokkene oprindeligt er følsom over for kemoterapi med platin-baserede lægemidler, selv om de fleste patienter tilbagefald med resistente tumorceller inden for ca. et år.