PLoS ONE: Microseminoprotein-Beta Expression i forskellige stadier af prostatakræft

Abstrakt

Microseminoprotein-beta (MSMB,

MSMB

) er en rigelig sekretorisk protein bidraget med prostata, og er impliceret som en prostatakræft (PC) biomarkør baseret på observationer af dens lavere ekspression i cancerceller sammenlignet med benign prostata epitel. Men da den nuværende litteratur om MSMB er inkonsekvent, vurderede vi udtryk for MSMB på protein og mRNA niveauer i et omfattende sæt af forskellige kliniske faser af PC. Immunhistokemi under anvendelse af monoklonale og polyklonale antistoffer mod MSMB blev anvendt til at undersøge proteinekspression i vævsprøver, der repræsenterer prostatektomi (n = 261) og i diagnostiske nålebiopsier fra patienter behandlet med androgen deprivation terapi (ADT) (n = 100), og i lokalt tilbagevendende kastration resistent PC (CRPC) (n = 105) og CRPC metastaser (n = 113). Udskriften niveauer af

MSMB

, nuklear receptor co-aktivator 4 (

NCOA4

) og

MSMB-NCOA4

fusion blev undersøgt ved QRT-PCR i prostatektomi prøver og RNA -sequencing i benign prostatahyperplasi, PC, og CRPC prøver. Vi målte også serum MSMB niveauer og genotype de enkelt-nukleotid polymorfisme rs10993994 anvendelse af DNA fra blodet fra 369 PC patienter og 903 kontroller. MSMB udtryk i PC (29% af prostatektomi og 21% af nål biopsier) var hyppigere end i CRPC (9% af lokalt tilbagevendende CRPCs og 9% af CRPC metastaser) (

s

0,0001). Påvisning af MSMB protein blev omvendt korreleret med Gleason score i prostatektomi prøver (

s

= 0,024). Den read-through

MSMB-NCOA4

udskrift blev opdaget på et meget lavt niveau i PC. MSMB niveauer i serum var ens i tilfælde af PC og kontrol, men var signifikant associeret med PC risiko, når der korrigeres for alder ved diagnose og niveauer af frit eller total PSA (

s

0,001). Serum niveauer af MSMB i både PC patienter og kontroller var signifikant associeret med rs10993994 genotypen (

s

0,0001). Afslutningsvis, nedsat udtryk for MSMB paralleller den kliniske progression af pc og justerede serum MSMB niveauer er forbundet med PC risiko

Henvisning:. Sjöblom L, Saramäki O, Annala M, Leinonen K, Nättinen J, Tolonen T, et al. (2016) Microseminoprotein-Beta Expression i forskellige stadier af prostatakræft. PLoS ONE 11 (3): e0150241. doi: 10,1371 /journal.pone.0150241

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, UNITED STATES

Modtaget: 30 oktober, 2015; Accepteret: 2 februar 2016; Udgivet: 3 mar 2016

Copyright: © 2016 Sjöblom et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. arbejdet blev støttet af tilskud fra det finske Funding Agency for Teknologi og Innovation Finland Distinguished professor program, Finlands Akademi, Kræftens Bekæmpelse Finland, den Sigrid Juselius Foundation, Medical Research Fund af Tampere University Hospital, National Cancer Institute ved National Institutes of Health (R01 CA160816, R01 CA175491); Sidney Kimmel Center for Prostata og Urologiske Kræft; David H. Koch gennem Prostata Cancer Foundation; National Institute for Health Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre Program; Cancer Research UK Oxford Centre; den svenske Cancer Society (projekt nr 14-0722.); og Fundacion Federico SA samt ved University of Tampere

Konkurrerende interesser:. Hans Lilja besidder patenter for frit PSA (US 5.501.983), hK2 (US Patent No. US 5.614.372), og intakt PSA (US Patent No . US 7.872.104 B2) analyser, og er opkaldt på en patentansøgning om en statistisk metode til at opdage prostatakræft. De assay patenter og patentansøgningen for den statistiske model er blevet licenseret og kommercialiseret af OPKO og Dr. Lilja modtager royalties fra salget af disse tests. Dr. Lilja ejer lager i OPKO. Andre ikke videregiver Cois.

Introduktion

Prostatakræft (PC) er den anden mest almindelige kræftform blandt mænd over hele verden [1]. Målinger af prostataspecifikt antigen (PSA) i blodet er almindeligt anvendt til at detektere mænd på PC-risiko og overvåge mænd med PC. På grund af lav test-specificitet ved moderat forhøjede niveauer, vilkårlig brug af PSA-test resultater i stort antal unødvendige biopsier og over-diagnose med en deraf følgende risiko for overbehandling [2,3]. Der er derfor et presserende behov for yderligere biomarkører, der kan give øget specificitet for tidlig påvisning af aggressive, dødelige former af sygdommen.

Microseminoprotein-beta (

MSMB

, MSMB aka MSP, PSP94) er en af ​​de tre hyppigst forekommende proteiner udskilt af prostata, sammen med PSA og prostata-sur phosphatase (PAP) [4]. Adskillige undersøgelser har vist højere MSMB ekspression i normale og godartet prostata væv end i cancervævet [4-7]. Observationer af højere MSMB ekspression i godartet prostata væv bedt nogle forskere til at foreslå, at MSMB har en tumor undertrykkende rolle i PC [8]. Funktionelle studier

in vivo

in vitro

også foreslå en tumor undertrykkende rolle for MSMB [9]. Niveauer af MSMB i serum og urin har også vist sig at være lavere i pc-patienter end i kontrollerne [10]. Positive MSMB ekspression er blevet rapporteret at associere med gunstig prognose i nålebiopsier [11] og tab af MSMB farvning er vist at være associeret med kortere tid til biokemisk tilbagefald hos klinisk lokaliseret PC [7]. Derimod har øget MSMB ekspression i prostatektomerede prøver blevet foreslået at være forbundet med ugunstige sygdomstilstande resultater [12]. Således prognostisk betydning MSMB ekspression i prostatavæv forbliver kontroversiel.

Det er blevet vist, at serum niveau af MSMB er forbundet med en enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) i rs10993994 i promotorregionen af ​​

MSMB

genet kodende for MSMB [13,14]. T allel af SNP rs10993994 har også været forbundet med PC risiko [15,16], som er blevet gentaget i flere undersøgelser [17-19]. Alligevel er der tegn på en sammenhæng mellem lave niveauer af MSMB i serum og øget risiko for PC uanset rs10993994 genotype [20].

Offentliggjorte data om regulering af

MSMB

udtryk ved androgener er uforenelige. Nogle undersøgelser har vist, at MSMB ekspression er uafhængig af androgener [21,22]. Men Dahlman og medforfattere [23] fandt, at

MSMB

udskrift og MSMB protein blev begge væsentligt reduceret efter kortvarig androgen deprivation terapi (ADT). Enhancer af Zeste homolog-2 (EZH2), en kendt epigenetisk lyddæmper af genekspression, er blevet foreslået at lukke munden

MSMB

udtryk i avanceret PC [24]. EZH2 har også vist sig at være overudtrykt i sen-fase PC [25].

MSMB

gen er placeret på kromosom 10q11.2 [26]. En læse-through fusion udskrift kombinerer

MSMB

med tilstødende gen nukleare receptor co-aktivator 4 (

NCOA4

) er for nylig blevet demonstreret ved Nacu et al. [27] og bekræftet i PC væv og normal prostata væv af Lou et al. [28]. De rapporterede også, at

MSMB-NCOA4

fusion gen omfatter androgen respons elementer (ER), tyder på, at fusion gen kunne reguleres af androgener.

NCOA4 (

aka

ARA70)

koder en AR-associeret protein, der øger transkriptionsaktivitet af AR i prostata celler [29]. Det er blevet foreslået, at

MSMB-NCOA4

fusion kunne have en rolle i pc på grund af de vigtige roller i

MSMB

i prostata væv og

NCOA4

som en forstærker af AR aktivitet [27].

på grund af de inkonsistente data om væv udtryk for MSMB /

MSMB

i prostata, vi ønskede at evaluere proteinekspression ved immunhistokemi (IHC) i omfattende grupper af PC repræsenterer hormon-naive lokaliseret og fremskreden sygdom, såvel som lokalt tilbagevendende kastrationsresistent PC (CRPC) og CRPC metastaser. Derudover transcript niveauer af

MSMB

,

NCOA4

og

MSMB-NCOA4

blev undersøgt for at vurdere betydningen af ​​den read-gennem fusion udskrift. Endelig blev serumniveauer af MSMB samt rs10993994 genotype analyseret i en kohorte af PC patienter og kontroller.

Materialer og metoder

Kliniske tumorprøver

prostatektomi, nål biopsi og lokalt tilbagevendende CRPC vævsprøver samt serumprøver blev opnået fra Tampere University Hospital (TAUH). Prøverne blev de-identificeret og analyseret anonymt. Brugen af ​​prospektivt indsamlede prøver blev godkendt af Etisk udvalg i Tampere University Hospital og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienterne. Godkendelsen til brug af retrospektiv samling af vævsprøver uden informeret samtykke blev opnået fra den nationale myndighed for retsbeskyttelse på sundhedsområdet i henhold til den finske lov. Brugen af ​​CRPC metastaser blev godkendt af Johns Hopkins Medicine Institutional Review Board, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra fag. Alle prøver, der anvendes til IHC blev formalin-fikseret, paraffinindlejrede (FFPE) prøver. Tissue microarray (TMA) slides blev skabt fra prostatektomi og CRPC prøver.

prostatektomi prøver.

MSMB udtryk blev evalueret med IHC i 261 prostatektomi prøver. De karakteristiske træk i den kohorte er vist i S1 tabel. De samme prostatektomi prøver er tidligere blevet analyseret for Ki-67 og EZH2 [25]. Sygdomsprogression blev defineret i henhold til blodet PSA-niveau, med biokemisk recidiv (BCR) defineret som en PSA-niveau ≥ 0,5 ng /ml i to på hinanden følgende blod trækker.

Needle biopsi prøver.

nål biopsi kohorte bestod af 99 diagnostiske nål biopsier fra patienter, som efterfølgende fik primær ADT. Gleason score og behandling information er præsenteret i S2 tabel. De samme prøver er tidligere blevet analyseret for Ki-67- og EZH2-immunhistokemi [30]. Sygdomsprogression blev defineret af PSA målinger i to på hinanden følgende blod trækker at være 25% over nadir med en absolut stigning på ≥2 ng /ml over nadir eller udvikling af nye metastaser [30,31].

Lokalt tilbagevendende CRPC prøver .

transuretral resektion af prostata (TURP) eksemplarer af 105 mænd med tegn på sygdomsprogression under ADT. Behandling oplysninger vises i S2 tabel.

CRPC metastaser.

Et hundrede og tretten CRPC metastaser blev indsamlet fra 32 patienter, der døde af CRPC og gennemgik hurtig obduktion. Alle patienter var blevet behandlet med ADT. De samme metastaser er også blevet analyseret for Ki-67 og EZH2 [25].

Prostatektomi kohorte for QRT-PCR-analyser.

syvtiseks frisk frosne prostatektomi prøver indeholdende mindst 70% kræftceller blev anvendt til QRT-PCR-analyse. De karakteristiske træk i den kohorte er præsenteret i S1 tabel. TRI-reagens (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, USA) blev anvendt til at isolere total RNA fra de frisk frosne kliniske prøver og cellelinjer ifølge producentens anvisninger.

RNA-sekventering kohorter.

data fra frisk frossen tumor materiale fra 12 benign prostatahyperplasi (BPH) prøver, 28 hormon-naive prostatektomi prøver og 13 CRPCs [32] samt 301 prøver, herunder 251 ondartede prøver og 45 tilstødende normale vævsprøver fra Kræft Genome Atlas (TCGA) – kohorte, blev brugt til at vurdere ekspressionsniveauerne af

MSMB

,

NCOA4

MSMB-NCOA4

Immunhistokemi.

Alle FFPE-prøver blev farvet med et monoklonalt MSMB antistof (ab19070, Abcam, Cambridge, UK), og prostatectomy- og CRPC-prøver blev også farvet med et polyklonalt MSMB antistof (4) .For farvningen , Power Vision

+ Poly-HRP IHC kit (immunologiske AD, Duiven, Holland) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev prøverne først afparaffiniseret og varmebehandlet i pH 6 trinatriumcitrat-buffer, indeholdende 0,05% Tween. Snit blev inkuberet natten over med det fortyndede primære antistof. For museafledt kommerciel MSMB antistof, blev prøver blokeret i post-blokeringsopløsning og blev derefter inkuberet med poly-HRP-opløsning. UltraVision Detection System (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA, USA) blev anvendt til visualisering af det bundne primære antistof. Negativ kontrol uden det primære antistof blev inkluderet i alle farvninger. Slides blev scannet med Aperio ScanScope XT scanner (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA, USA). Scoring blev udført i en blindet måde under anvendelse af et virtuelt mikroskop (https://jvsmicroscope.uta.fi). Intensitet og procentdelen af ​​det farvede tumorområdet blev evalueret. Ekspression af MSMB blev anset høj, når 20% eller mere af tumorvævet blev farvet med en intensitet på mindst 1 på en intensitet skala fra 0-3. Middelværdier for Ki-67 definerede lav og høj ekspression af Ki-67. EZH2 udtryk blev defineret som høj, når 50% af tumorcellerne blev farvet

QRT-PCR for

MSMB

,

NCOA4

MSMB-NCOA4.

og sekventering af

MSMB-NCOA4

SYBR Green assay (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA, USA) blev anvendt ifølge producentens protokol til påvisning af mRNA-ekspression niveauer af

MSMB

,

NCOA4

og

MSMB-NCOA4

fusion. Sekvenserne for primerne blev opnået fra Lou et al. [28]. Varmecykler var som følger:.. 95 ° C i 5 min, 95 ° C i 10 sek, annealing temperatur 59 ° C (efter

MSMB

), 62 ° C (efter

NCOA4

) og 59,5 ° C (for

MSMB-NCOA4

) i 30 sek. og 72 ° C i 20 sek. Genet kodende for TATA- boks-bindende protein (

TBP

) blev anvendt til normalisering. Endelig blev PCR -produkter separeret på 1% agarosegeler at bekræfte specificiteten af ​​reaktionen.

MSMB-NCOA4

fusion produkt blev sekventeret for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​fusion. For sekventering blev PCR -produkter ekstraheret fra gelen og oprenset med en QIAquick kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Oprenset PCR-produkt blev klonet under anvendelse af en TOPO-TA kloning kittet (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). En BigDye terminator sekventeringskit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) blev anvendt til sekventeringsreaktionerne. I dataanalyser blev medianværdier brugt som en grænse mellem høj og lav udtryk for mRNA niveauer af

MSMB

,

NCOA4

MSMB-NCOA4

.

genotypebestemmelse SNP rs10993994 i kim-line-DNA og måling af serum MSMB niveauer

måling af serum MSMB niveauer og genotypning af rs10993994 blev udført fra 369 PC patienter og 903 voksne mandlige alder-matchede (± to år) kontrolgruppen henvist til Urologisk afdeling uden tegn på PC. Kendetegnene for de tilfælde, er præsenteret i S3 tabel. Den SNP rs10993994 blev genotype fra DNA-prøver ved hjælp af Sequenom MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA) systemet ved Institut for Molekylær Medicin Finland (Fimm). Immunoassay målinger af MSMB blev gennemført på AutoDelfia 1235 automatiske immunoassay-system (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) ved Dr. Lilja laboratorium I Wallenberg Research Laboratories, Institut for Translational Medicine, Lunds Universitet, Skåne Universitetshospital, Malmö, Sverige som tidligere beskrevet [20,33,34]. Fri og total PSA blev målt ved hjælp af den dobbelt-label DELFIA Prostatus alt /frit PSA-Assay (PerkinElmer, Turku, Finland) [35] kalibreret mod WHO 96/670 (PSA-WHO) og WHO 68/668 (free PSA- WHO) standarder. Alle assaymålinger blev udført med prøver blindet til resultatet.

Statistiske analyser

Fishers eksakte test, Chi-squared test, Mann-Whitney U-test og uparrede t-tests blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem MSMB,

MSMB

,

NCOA4

og

MSMB-NCOA4

udtryk og forskellige klinisk-patologisk og udtryk variabler. Parret t-test blev anvendt til at analysere forskelle mellem ekspressionsniveauerne af

MSMB

,

NCOA4

og

MSMB-NCOA4

. Kaplan-Meier-analyse af progressionsfri overlevelse blev anvendt til at analysere den prognostiske betydning af MSMB ekspression i forskellige kohorter med Mantel-Cox test. Fishers eksakte test og Kappa-testen blev anvendt når sammenligner resultaterne opnået under anvendelse af kommercielle MSMB antistof og sådanne opnået med vores polyklonalt MSMB antistof. Mann-Whitney U-test blev anvendt til sammenligning serumniveauerne af MSMB og PSA mellem PC patienter og kontroller. Data blev analyseret med analyse af kovarians (ANCOVA) for at undersøge sammenslutningen af ​​pc og serum MSMB niveauer, korrigeret for alder ved diagnose og frit PSA eller total PSA. Både MSMB og PSA variabler blev log forvandlet. Logistisk regressionsanalyse blev udført, også med SPSS, at studere sammenhængen mellem serum MSMB niveau og PC risiko angivet af Gleason score og den fase af PC. Spearman korrelation blev brugt til at studere sammenhængen mellem frie, total og fri for total PSA niveauer og MSMB niveauet i blodet hos patienter og kontroller. Kruskal-Wallis test blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem serum MSMB niveau og genotypen af ​​SNP rs10993994. Spearman korrelation blev brugt til at analysere sammenhængen mellem serum MSMB niveau og alder ved diagnose.

Resultater

Sammenligning af monoklonale og polyklonale MSMB antistoffer

prostatektomi og lokalt tilbagevendende CRPC prøver blev farvet med både en kanin polyklonalt MSMB antistof som beskrevet af Abrahamsson et al. [4] og en kommerciel monoklonalt MSMB antistof (ab19070, Abcam, Cambridge, UK). Både farvningsintensitet og areal af kræft væv blev vurderet i lave med MSMB ekspression defineret som positiv, når 20% eller mere af tumor område havde farvningsintensitet fra 1 til 3. Farvning resultater med det monoklonale og polyklonale antistoffer var ens. Firs procent af de prostatektomi prøver manifesterer lavt niveau MSMB ekspression farvet med det polyklonale MSMB antistof viste også lave MSMB ekspression ved farvning med det monoklonale antistof (κ = 0,559,

s Restaurant 0,0001; tabel 1). I CRPC prøver, farvningsresultaterne var endnu mere konsekvent mellem polyklonale og monoklonale MSMB antistoffer (K ​​= 0,77,

s

0,0001; tabel 1). På grund af den konsekvente karakter af farvning blev alle andre prøver kun farves med det monoklonale antistof.

prostatektomi og lokalt tilbagevendende CRPC prøver blev farvet med et kanin-polyklonalt MSMB antistof (33) og et kommercielt monoklonalt MSMB antistof ( ab19070, Abcam, Cambridge, UK).

prostatektomi prøver

MSMB blev uensartet udtrykt i cytoplasmaet af den maligne prostata epitel med tydelige intensitet forskelle observeret i separate carcinomatøse kirtler i samme prøve. Godartede kirtler var almindeligt farvet med høj intensitet, mens kræft kirtler kun sjældent viste høj farvning intensitet og MSMB udtryk var almindeligt lav (figur 1). MSMB blev udtrykt på et højt niveau i 29% (75/261) af kræft væv i prostatektomi prøver. Kræft havde farvning intensitet på 0 i 89% (166/186) af de prostatektomi prøver, som blev defineret som lav udtryk for MSMB niveau. MSMB ekspression tendens til at blive omvendt forbundet med Gleason score, men ikke med Gleason bedømmelse (

s

= 0,0544 og 0,1669, henholdsvis tabel 2). Høj MSMB ekspression blev observeret i 52/178 tilfælde (29%) af PT2 prøver og 21/82 tilfælde (26%) i PT3 prøver (tabel 2). Der var ingen sammenhæng mellem MSMB udtryk og diagnostisk PSA niveauer eller mellem MSMB udtryk og alder (

s

= 0,8248, 0,2563, henholdsvis; tabel 2).

(A) Høj, middel og lav MSMB farvning i normal prostata væv. (B) Høj, middel og lav MSMB farvning i prostatakræft væv.

Disse resultater er baseret på IHC-analyse af forskellige årgange.

Selv om der ikke var nogen signifikant association mellem MSMB udtryk og EZH2 udtryk EZH2 udtryk tendens til at være højere i prøver, der udtrykker lave niveauer af MSMB (

s

= 0,1040; tabel 2). Der var ingen sammenhæng mellem udtryk for MSMB og udtryk for spredning markør Ki-67 (

s

= 0,2208; tabel 2) eller med tid til biokemisk recidiv (

s

= 0,8997; S1 Fig ).

nål biopsi prøver

Vævssnit af diagnostiske nål biopsi prøver repræsenterede en kohorte af ældre patienter og /eller mere fremskreden sygdom på diagnosetidspunktet end prostatektomi kohorte, og som modtog primære ADT. Enogtyve ud af 99 (21%) af de biopsiprøver udtrykte MSMB på et højt niveau (Tabel 2), med ingen sammenhæng mellem MSMB ekspression og Gleason score eller T-fase (

s

= 0,7869; 0,8097, henholdsvis; tabel 2). Ligeledes var der ingen sammenhæng mellem MSMB udtryk og udtryk for EZH2 eller Ki-67 (

s

= 0,4849 og 0,4055, henholdsvis; tabel 2). Endvidere sager med høje i forhold til lav MSMB udtryk viste ingen forskel i tiden til biokemisk progression af Kaplan-Meier analyse (

s

= 0,5621, S1 Fig).

Lokalt tilbagevendende CRPC prøver

MSMB udtryk var høj i kun 9% (9/105) af lokalt tilbagevendende CRPC prøver (tabel 2), med ingen sammenhæng mellem ekspressionen af ​​MSMB og EZH2 eller Ki-67-ekspression (

s

= 0,1024, 0,1545, henholdsvis;. tabel 2)

CRPC metastaser

høj MSMB ekspression blev observeret i 9% af tilfældene (3/32) (tabel 2). En ud af disse tre patienter havde høj MSMB udtryk i en ud af to af hans metastaser. En anden patient havde høj MSMB ekspression i 3 af 5 i metastaser, og den tredje patient i 3 ud af 4 af metastaserne. MSMB blev udtrykt på et højt niveau i 6% (7/112) af alle de metastaser (tabel 2). MSMB udtryk var ikke forbundet med ekspressionen af ​​Ki67 eller med EZH2 (

s

= 0,2412 og 0,3295, henholdsvis; tabel 2).

MSMB

,

NCOA4

MSMB-NCOA4

fusion

først, udskrifter af

MSMB

,

NCOA4

fusion af

MSMB-NCOA4

blev målt ved QRT-PCR i RNA isoleret fra cancervæv i en kohorte af patienter med klinisk lokaliserede PC behandlet med prostatektomi (n = 76). Dataene havde en ikke-Gauss fordeling, med de fleste prøver, der viser nedenfor- gennemsnit

MSMB

udtryk og kun 25% (19/76) af prøver manifesterer MSMB-udtryk over gennemsnittet.

NCOA4

blev udtrykt på et højt niveau i 41% (31/76) af prøverne og høje niveauer af

MSMB-NCOA4

fusion blev fundet i 32% (23/73) af det prøver (tabel 3). Udtrykket af

MSMB-NCOA4

fusion udskrifter var korreleret med ekspressionen af ​​

MSMB

(Pearson r = 0,5092,

s

0,0001, fig 2).

MSMB

udtryk tendens til at være lavere ved højere tumor kvalitet, men ekspressionsniveauerne af

MSMB

,

NCOA4

, og

MSMB-NCOA4

fusion afskrift blev ikke signifikant associeret med Gleason score (

s

= 0,0913, 0,2577 og 0,1963, henholdsvis), pT-stadium (

s

= 0,2760, 0,4819 og 1,000 henholdsvis; Table 3), eller tid til biokemisk recidiv (

s

= 0,3862, 0,4126 og 0,5940, henholdsvis;. S2 figur)

MSMB

udtryk var positivt korreleret med udtryk for

MSMB-NCOA4

.

Disse resultater er baseret på Q-RT-PCR-analyse. Midler til de normaliserede værdier blev brugt som en cut-off værdi mellem høj og lav udtryk for

MSMB

,

NCOA4

og

MSMB-NCOA4

. Alder refererer til alder ved diagnose.

For det andet, påvisning af

MSMB

,

NCOA4

MSMB-NCOA4

fusion udskrifter blev vurderet anvendelse af RNA-seq i to kohorter; det ene indeholder 12 BPH, 28 hormon-naive PC, og 13 CRPC prøver [32], samt en anden TCGA-kohorte bestående af 301 prostataadenokarcinomceller tumorer. Samlet set ekspressionen af ​​

MSMB-NCOA4

var lav og ekspression blev observeret mere hyppigt i PC end i BPH væv, selv om der blev påvist lave niveauer af ekspression i 2 af de 12 BPH prøver (figur 3). I prøve, der gav udtryk for

MSMB-NCOA4

på højeste niveau, kun 2,2% af de udskrifter startende fra

MSMB

promotor dannet en udskrift med

NCOA4

(Fig 3B ).

NCOA4

blev udtrykt på et væsentligt lavere niveau end

MSMB

i begge kohorter (Fig 3 og S3 Fig).

(A)

MSMB

var udtrykt på højere niveau end

NCOA4

. (B) Nederste panel viser den procentdel af

MSMB-NCOA4

læser fra den samlede læser af

MSMB

MSMB-NCOA4

.

NCOA4

blev udtrykt på et lavere niveau end

MSMB

. Fusionen genekspression del var 2,2% ved højeste, ud af summen af ​​MSMB og MSMB-NCOA4 læser. Y-aksen repræsenterer normaliseret læse tæller.

Serum MSMB niveauer og SNP rs10993994

Der var ingen signifikant sammenhæng mellem MSMB niveauer i serum og alder ved diagnose af PC-patienter (Spearman r = 0,1550) eller alder ved blod uafgjort blandt kontroller (Spearman r = 0,1876, S4 fig). I PC tilfælde, median niveau MSMB i serum (23,0 ng /ml; interkvartile område (IQR) 15,9) var ikke forskellig (

s

= 0,2422) end i kontrollerne (21,8 ng /ml; IQR 15.3 ; tabel 4). Men når justeres efter alder og gratis eller total PSA på diagnose, var der en signifikant sammenhæng mellem PC risiko og serumniveauer af MSMB i kovariansanalyse (

s

0,001; tabel 5). MSMB niveauer var højere i kontroller (det betyder MSMB niveau var 29,7 ng /ml, når justeres efter alder og total PSA på diagnose og 29,2 ng /ml, når justeres efter alder og frit PSA ved diagnose) sammenlignet med pc-patienter (det betyder MSMB niveau var 21.1 ng /ml, når justeret efter alder og total PSA på diagnose og 22,4 ng /ml, når den blev justeret efter alder og frit PSA ved diagnose) (tabel 5). Endvidere blev serum MSMB niveau er forbundet med risiko angivet ved Gleason score og med kliniske stadium ved diagnose (S4 Table), med foreningen resterende signifikant i ikke-metastatiske eller metastatiske tilfælde alene. Derudover PC patienter havde en signifikant lavere fri /total PSA-forhold sammenlignet med kontroller (

s

0,0001; tabel 4). Der var en statistisk signifikant om end svag positiv korrelation mellem niveauer af MSMB og gratis PSA samt mellem MSMB og total PSA i serum fra kræfttilfælde (Spearman r = 0,3990 og 0,3200, henholdsvis) og i kontroller (Spearman r = 0,3421 og 0,2710, henholdsvis),

s

0,0001 i alle (S5 fig), og signifikant sammenhæng mellem free-to-total PSA-forholdet og serumniveauer af MSMB i cases og kontroller (Spearman r = 0,2142; r = 0,1351, henholdsvis),

s

. 0,0001 i alle (S5 fig)

Blandt pc patienterne, de MSMB niveauerne i serum var ikke associeret med Gleason score i prostatektomi eller biopsi prøver (

s

= 0,6621, 0,819, henholdsvis, tabel 6), men serum MSMB niveauer og pT-stadium (

s

= 0,0288) og alder ved diagnose (

s

= 0,0452) tendens til at være svagt forbundet i prostatektomi tilfælde (tabel 6). Kaplan-Meier analyse viste ingen sammenhæng mellem serum MSMB niveau og tid til biokemisk tilbagefald hos patienter behandlet med prostatektomi eller strålebehandling (

s

= 0,1396, 0,1925, henholdsvis, S6 Fig) eller hormon-behandlede patienter (

s

= 0,2070;. S6 figur)

i modsætning hertil var en meget stærk sammenhæng mellem lave MSMB niveauer i serum og TT risiko genotype af SNP rs10993994 af både kræfttilfælde og kontroller (

s

0,0001 0,0001 henholdsvis fig 4). Imidlertid var SNP rs10993994 ikke forbundet med Gleason score på biopsi eller prostatektomi prøver eller med pT-scenen på prostatektomi (

s

= 0,7959, 0,4683, 0,3584, henholdsvis; Tabel 7). Selvom hyppigheden af ​​TT genotypen tendens til at være lidt højere i kræfttilfælde (15%) sammenlignet med kontroller (12%), var der ingen association af rs10993994 genotype og kræftrisiko i denne kohorte (

s

= 0,5114 ; tabel 7)

Genotype af SNP rs10993994 og MSMB niveau i blod af (A) PC patienter og (B) kontrol.. Lavere MSMB niveau var associeret med T-allel af SNP rs10993994. Kruskal-Wallis test blev anvendt til at sammenligne de forskellige grupper. Linjer repræsenterer middelværdien MSMB niveau af de forskellige genotyper. *** betegner

s

. 0,0001

Diskussion

I dette papir, vi studerede potentielle rolle MSMB /

MSMB

/

MSMB-NCOA4

som pc-biomarkører i kohorter svarende til forskellige stadier af PC fra tidligt til fremskreden sygdom. Vi viste, at MSMB udtryk er reduceret i mere avanceret PC, bliver laveste i CRPC. De lave MSMB protein niveauer i CRPC var i overensstemmelse med vores RNA-seq data indikerer lav

MSMB

transkriptniveauer i CRPC forhold til pc-prøver. Konstateringen af ​​nedsat udtryk for MSMB /

MSMB

i PC sammenlignet med ikke-maligne prostata, samt forening af tabet af udtryk med mere avancerede og højere Gleason-score sygdom, er i overensstemmelse med flere tidligere udgivelser [5-7]. Men CRPC sager er ikke blevet grundigt undersøgt før. Dahlman et al., [23] undersøgte MSMB udtryk i 3 CRPC metastaser og fundet lave

MSMB

transkriptniveauer. Her viste vi, at både udskrift og MSMB protein niveauer er lave i CRPC med kun 9% af de CRPC sager udtrykker MSMB.

I vores undersøgelse blev MSMB protein eller mRNA-niveauer ikke er forbundet med prognosen i prostatektomi eller ADT – behandlede patienter. Nogle tidligere publikationer har vist en sammenhæng mellem lav MSMB og dårlig prognose i PC [7,11], mens andre viste høj MSMB eller

MSMB

transkriptniveauer og dårlig prognose [12,36]. Der kan være flere årsager til de uharmoniske resultater. Patientkohorter variere. Her har vi brugt tre kohorter: (a) en prostatektomi kohorte af 261 sager med en gennemsnitlig opfølgning på 7,3 år, (b) en prostatektomi kohorte af 76 sager med en gennemsnitlig opfølgning på 5,2 år og (c) en kohorte af primært ADT-behandlede patienter med en gennemsnitlig opfølgning på 3,6 år. Kohorter en og C blev anvendt til immunhistokemisk påvisning af MSMB protein og kohorte B for QRT-PCR måling af

MSMB

udskrift. Konsekvent, ingen af ​​kohorter viste prognostisk værdi for MSMB /

MSMB

. En formodet variabel er antistoffet anvendes til immunfarvning. Vi testede to almindeligt anvendte antistoffer, et monoklonalt antistof og et polyklonalt en. De gav stærkt overensstemmende farvningsmønstre. Således antistofferne sandsynligvis ikke årsagen til de afvigende data.

En læse-through fusion udskrift af

NCOA4

og

MSMB

er for nylig blevet påvist i nogle prostatakræft [27,28]. Således sigtede vi at måle ekspressionen af ​​fusions-transkriptet i kliniske prøver.