Abstrakt
PIK3CA
(phosphoinositid -3-kinase, kan katalytiske, alfa-polypeptid) mutationer hjælpe med at forudsige antitumoraktiviteten af phosphotidylinositol-3-kinase (PI3K) /mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway hæmmere i både prækliniske og kliniske omgivelser. I lyset af den nylige opdagelse af tumorfremkaldende cancerstamceller (CSCS) i forskellige tumortyper, udviklede vi et
in vitro
CSC model fra xenotransplantattumorer etableret i mus fra en colorectal cancer patient tumor, hvor CD133 + /EpCAM + repræsenterede tumorfremkaldende celler. CD133 + /EpCAM + CSCS blev beriget under stamceller celledyrkningsbetingelser og dannede 3-dimensionelle tumor sfæroider. Tumor sfæroide celler udviste CSC egenskaber, herunder evnen til differentiering og selvfornyelse, højere tumorigent potentiale og kemo-resistens. Genetisk analyse ved hjælp af en OncoCarta ™ panel afslørede en
PIK3CA (H1047R)
mutation i disse celler. Ved hjælp af en dobbelt PI3K /mTOR-hæmmer, PF-04.691.502, så viste vi, at blokering af PI3K /mTOR pathway hæmmede
in vitro
spredning af CSCS og
in vivo
xenograft tumorvækst med håndterbare toksicitet. Tumorvækstinhibering i mus var ledsaget af en signifikant reduktion af phosphoryleret Akt (Pakt) (S473), en veletableret surrogat biomarkør for PI3K /mTOR signalvej inhibering. Kollektivt, vores data tyder på, at PF-04691502 udviser potent anticancer aktivitet i kolorektal cancer ved at målrette både
PIK3CA (H1047R)
mutant CSCS og deres derivater. Disse resultater kan hjælpe med den kliniske udvikling af PF-04691502 til behandling af en delpopulation af kolorektal cancer patienter med dårlige resultater
Henvisning:. Fang DD, Zhang CC, Gu Y, Jani JP, Cao J, Tsaparikos K, et al. (2013) antitumorvirkningen af Dual PI3K /mTOR Inhibitor PF-04.691.502 i en human xenograft Tumor Model Afledt af kolorektal cancer Stamceller huser en
PIK3CA
Mutation. PLoS ONE 8 (6): e67258. doi: 10,1371 /journal.pone.0067258
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea
Modtaget: December 23, 2012; Accepteret: 13. maj 2013; Udgivet: 27 juni 2013
Copyright: © 2013 Fang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere
Konkurrerende interesser:. forfatterne har følgende interesser. Alle forfattere er enten nuværende eller tidligere ansatte i Pfizer, at bidragyder med denne undersøgelse. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.
Introduktion
Tyktarmskræft er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft for både mænd og kvinder i USA. Ca. 103.170 nye tilfælde af kolorektal cancer er diagnosticeret årligt, med omkring 51.690 årlige dødsfald [1]. I kolorektal cancer er PI3K /mTOR pathway ofte dysreguleret grund af mutationer i p110α underenheden af
PI3K
. PI3K /mTOR signalvej er et centralt regulator af forskellige celleprocesser, herunder proliferation, differentiering, apoptose, motilitet, metabolisme og autofagi. Således har onkogen-aktivering blevet en attraktiv terapeutisk mål for lægemiddeludvikling [2]. Prækliniske og kliniske studier indikerer, at
PIK3CA
mutation i fravær af en
KRAS
mutation er en prædiktiv markør for respons på PI3K og mTOR-hæmmere [3] -. [6]
Udover den nyligt lancerede mTOR inhibitor everolimus, som anvendes til behandling af en lang række cancertyper, en række små molekyler inhibitorer af PI3K /mTOR-signalvejen er i øjeblikket i klinisk udvikling [7] – [10]. Disse midler omfatter PI3K-selektive inhibitorer, AKT inhibitorer, mTOR katalytiske sted inhibitorer og dobbelt PI3K /mTOR-hæmmere. PF-04691502, 2-amino-8-[trans-4-(2-hydroxyethoxy)cyclohexyl]-6-(6-methoxypyridin-3-yl)-4-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one, er en potent dobbelt inhibitor af alle PI3K-isoformer og mTOR (TORC1 og TORC2). De farmakologiske egenskaber af dette oralt virkningsfuldt middel blev for nylig rapporteret [11]. PF-04691502 potent hæmmede rekombinant klasse I PI3K og mTOR i biokemiske analyser og undertrykt omdannelsen af aviær fibroblaster medieret af vildtype PI3Kγ, δ eller mutant PI3Kα. PF-04691502 inhiberede også mTORC1 aktivitet i celler. I
PIK3CA
-mutant cancer cellelinjer, PF-04.691.502 undertrykt phosphorylering af AKT (S473) og hæmmet celledeling [11]. PF-04691502 demonstrerede antitumoraktiviteter i æggestokkene og glioblastoma tumor xenograftmodeller afledt af kræft cellelinjer der bærer enten en
PTEN
sletning eller
PIK3CA
mutation [11] og i en gensplejset musemodel af æggestokkene cancer drevet af en
Kras
mutation og
PTEN
sletning [12]. De antitumor aktiviteter PI3K /mTOR-hæmmere, herunder PF-04.691.502, i kolorektal cancer mangler at blive udforsket.
Nylige undersøgelser har vist, at de hierarkisk opbyggede kolorektale tumorer komponere en lille delmængde af CD133 + /EpCAM + udtrykker CSCS [13 ], [14]. CSCS er afgørende for tumorudvikling og progression, samt lægemiddelresistens og tumormetastase [15], [16]. Flugten af CSCS fra nuværende kemo- og radiotherapies kunne forklare modstand og tumor tilbagefald [15], [16]. Betydningen af PI3K /mTOR signalnet i CSC biologi er blevet bemærket for nylig [17]. Korrelationen af AKT aktivering og øget tumorgenicitet, stemness, og invasionsevne blev identificeret i en glioblastom model [18]. PI3K signalering viste sig at spille en afgørende rolle i tumorigenese af prostata basal /stamceller [19], [20]. I kombination med andre midler, blokering af PI3K /mTOR pathway i pancreascancer var i stand til at fjerne pancreas CSCS og leukæmi stamceller, hvilket viser anti-CSC effektivitet til at inhibere PI3K /mTOR pathway [21], [22]. I betragtning af de vigtige funktioner i CSCS, er det interessant at undersøge, om terapeutiske midler rettet mod PI3K /mTOR-signalvejen er effektive i kolorektal cancer drevet af CSCS huser en somatisk
PIK3CA
mutation.
Vi rapporterer her den orale virkningsfuldhed af en dobbelt PI3K /mTOR inhibitor, PF-04.691.502, i en human coloncancer xenograftmodel drevet af stærkt tumorigene CD133 + /EpCAM + CSCS. I patientens tumor, CD133 + /EpCAM + celler repræsenterede tumorfremkaldende celler efter xenotransplantation. CD133 + /EpCAM + celler blev derefter opformeret og beriget som tumor sfæroide celler under stamceller betingelser. Tumor sfæroide celler besad de yderligere kendetegn for CSCS, herunder selvfornyelse, kemo-modstand, højere tumorigent potentiale
in vivo
, og evnen til at rekapitulere de histopatologiske træk af den oprindelige tumor
in vivo patient
. Genetisk analyse af 19 fælles onkogener viste, at CSC befolkning bliver testet nærede en
PIK3CA (H1047R)
mutation. Desuden en dobbelt PI3K /mTOR-hæmmer, PF-04.691.502, markant hæmmet udbredelsen af CSCS
in vitro,
samt væksten i xenotransplantattumorer afledt af CSC befolkning i mus. Western blot analyse viste, at Pakt (S473) blev nedreguleret i xenotransplantattumorer der blev behandlet med PF-04.691.502. Samlet set vores resultater tyder på, at PI3K /mTOR pathway inhibitor PF-04.691.502 har potent anti-proliferativ aktivitet i
PIK3CA
mutant CSCS, berettiger yderligere evaluering af inhibitorer i kolorektal cancer patienter bærer PIK3CA mutationer.
Materialer og metoder
Dyr, patientprøve og etableringen af Patient-afledte xenograft (PDX) Tumor Model
skriftligt informeret samtykke blev opnået fra undersøgelsen deltager, en 39-år- gammel mand med kolorektal cancer, før kirurgi og indsamling af vævsprøve. Procedurerne blev godkendt af University of California i San Diego menneskelige forskningspotentiale Protections Program Institutional Review Board (IRB). Alle eksperimentelle dyreforsøg efterkommet Guide for pleje og brug af forsøgsdyr (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) og blev godkendt af Global Research and Development Institutional Animal Care og brug Udvalg Pfizer. Kort fortalt resektion afslørede en scene T3N2 dårligt differentieret kolorektal mucinøs carcinom med signet-ring celle funktioner. Kirurgisk resektion tumorvæv blev skåret i 2 til 4 mm
3 fragmenter og subkutant implanteret i flanken af NOD /SCID-mus (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Palpable P
0 xenotransplantattumorer (den første generation i mus) dannet i mus ved seks uger efter implantation. Når størrelsen af tumorer nåede ca. 500 mm
3, P
0 tumorer blev derefter udvidet i ti NOD /SCID-mus ved subkutan re-implantation af tumor fragmenter til at generere P
1 xenotransplantattumorer. Den histopatologi af xenotransplantattumorer blev revideret i forhold til patienten tumor af en bestyrelse certificeret patolog (PBL).
Tissue Processing og Tumor klumpformet Kulturer af CSCS
kirurgisk fjernet xenograft tumorvæv fra mus blev enzymatisk dissocieret ved anvendelse Accumax opløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i enkelte celler og dyrket i serumfrit stamcelle medium ved 37 ° C i en CO 5%
2, fugtig atmosfære. Stamcelle medium blev genereret ved konditionering serumfrit dyrkningsmedium, der rutinemæssigt blev brugt til humane embryonale stamceller (hESC), i muse embryonale fibroblastkulturer for 24 timer, og derefter blande den konditionerede medium med frisk embryonale medium (ved en 01:01 forhold) suppleret med 4 ng /ml bFGF, 10 ng /ml EGF, 10 mg /ml bovint insulin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 5,5 mg /ml humant transferrin (Sigma-Aldrich), og 5 ng /ml natriumselenit (Sigma-Aldrich, 23). Primære tumorceller blev dyrket i Ultra-lave fastgørelsesflade kolber (Corning, Lowell, MA) i de første 3 måneder at danne ikke-vedhæftende tumor sfæroider. Efter sfæroid cellekulturer blev stabil, blev CSC kulturerne overført til Nunc ™ ubehandlet polystyren celledyrkningskolber (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY).
flowcytometri og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)
Standard celleoverfladeantigen mærkning og flowcytometri evalueringer blev udført. Dissocierede tumorceller blev analyseret ved anvendelse phycoerythrin-konjugeret CD133 (Miltenyi Biotech) og APC-konjugeret epitel-specifikt antigen EpCAM (CD326, epitelial celleoverfladeantigen, BD Biosciences) antistoffer. Cellesortering blev udført på et FACSAria I cellesorterer (BD). Ufarvede celler og celler farvet med isotype-matchede kontrol antistoffer blev anvendt som negative kontroller. I primære celler isoleret fra xenotransplantattumorer, døde celler og murine celler blev udelukket ved anvendelse af propidiumiodid (PI) og et anti-muse-monoklonalt antistof konjugeret med fluorescein isothiocyanat (H-2k [d] FITC, BD). Henholdsvis
Cell levedygtighedsassayet efter behandling med forbindelse
dissocieret levedygtig, enkelt sfæroide CSCS og differentierede celler blev udpladet ved 10.000 og 5.000 celler /brønd i henholdsvis klare bund plader med 96 brønde (Corning) og behandlet med de angivne forbindelser i 5 dage. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved hjælp af en CellTiter Glo® selvlysende cellelevedygtighed (Promega).
Cell Proliferation og differentiering Induktion
Cell spredning og cytokeratin udtryk blev målt samtidigt ved hjælp af en fluoresceinisothiocyanatkonjugatet 5- bromdeoxyuridin (BrdU) strømning kit (BD Biosciences) og anti-cytokeratin antistoffer (phycoerythrin-konjugeret cytokeratin 7/8 CAM 5.2, BD Biosciences). CSC differentiering blev induceret ved dyrkning sfæroide CSCS i DMEM medium suppleret med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) i regelmæssige celledyrkningskolber.
Mutationsanalyse af oncogen Mutationer
Mutationsanalyse sekventering blev tilvejebragt ved Sequenom (www.sequenom.com) ved hjælp af en OncoCarta ™ panel v1.0, som indeholder 238 hotspot mutationer i 19 onkogener inden for 24 multiplex. Resultaterne blev analyseret ved anvendelse af funktionen Oncomutations Rapport i Typer 4,0 (Sequenom Inc, San Diego, USA) under anvendelse af funktionen “OncoMutation Reports”. Denne algoritme oparbejder de rå spektrale data og automatisk kompenserer toparealer baseret på tidligere etablerede salt og matrix addukt formationer, der kan skjule C til A og G til T mutationer. De resulterende korrigerede data blev derefter screenet for mutation toppe på over 7% i forhold til spids vildtype, og hver rapporteret assay blev individuelt analyseret og vurderet for gyldighed ved anvendelse kriterier såsom forlængelse sats, form af topareal og placering af toparealet over den forventede topposition.
In vivo
tumorigenese Assay
FACS-sorteres CD133 + /EpCAM + og CD133- /EpCAM + celler isoleret fra P
1 (nemlig 2
nd generation i mus) xenotransplantattumorer blev blandet med Matrigel (BD, 01:01 volumenforhold) og implanteret subkutant i NOD /SCID-mus (The Jackson Laboratory) at analysere deres evne til at initiere tumorer. Tumor mængder, der blev beregnet som længde × bredde × højde × 0,5, blev målt på dag 84 efter implantation og er vist som middelværdien ± SEM (n = 5).
In vivo
Begrænsning Fortynding Assay
forskellen tumorigene potentialer i de dyrkede CSCS og deres differentierede afkom blev bestemt i SCID-bg mus (Jackson Laboratory) ved at indsprøjte titrerede antal celler blandet med Matrigel ved et 01:01 forhold. Tumorvolumener blev målt med jævne mellemrum i en periode på 63 dage og plottet som middelværdien ± SEM (n = 5).
In vivo
antitumorvirkning Evaluering
Tumor Væksthæmningstestene blev udført i SCID-bg-mus. Kort fortalt, 2 × 10
6 levedygtige dissocierede CSCS blev subkutant inokuleret, og mus med -200 mm
3 tumorer blev tilfældigt opdelt i tre grupper og blev behandlet med 10 mg /kg PF-04.691.502 (PO, QD × 14 n = 8) eller vehikel (0,5% methylcellulose i vand, PO, QD × 14; n = 8). Tumorvolumener er vist som middelværdien ± SEM. Relativ ændring i kropsvægt (RCBW,%) blev beregnet som produktet af (BWI-BW0) /BW0 × 100%. BWI var kropsvægten på dagen for dosering, og BW0 var legemsvægt den første dag af behandlingen.
Western blot analyse
Vehicle eller PF-04.691.502-behandlede tumorer var lynfrosset med flydende nitrogen. Frosne tumorer blev homogeniseret og lyseret med 1 × cellelyse-buffer (cellesignalering Technologies). Lysater blev renset for cellerester ved centrifugering ved 14.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C blev supernatanterne opsamlet, og proteinniveauer blev kvantificeret ved BCA-proteinassay (Pierce). Lige store mængder protein blev opløst ved polyacrylamidgeler. Efter overførsel af proteinet til nitrocellulosemembraner blev membranerne blottet med det primære antistof Pakt (Ser473; cellesignalering Technologies) eller α-tubulin (Sigma). Sekundære antistoffer blev købt hos Amersham Biosciences. Bånd blev detekteret ved kemiluminescens med SuperSignal West Dura Substrat (Pierce), og billeder blev taget med et AlphaImager system.
Statistisk analyse
Alle analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism (V.5.00 for Windows). Værdier af p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Resultater
Etablering af PDX Tumor Modeller og Bekræftelse af CD133 + /EpCAM + Tumorgenetisk CSC Befolkning
Fragmenter af frisk resektion tumor prøve fra. en kolorektal cancer patient blev subkutant implanteret i to NOD /SCID-mus for at etablere en kolorektal cancer PDX model, som derefter blev anvendt til at generere sfæroide CSCS i kultur (arbejdsgang til generering af kugleformede CSCS vist i fig. 1A). Samtidig blev frisk dissocierede primære celler fra patientprøver vurderet for ekspression af colon CSC markører CD133 /EpCAM ved flowcytometri (fig. 1B). Efter at udelukke ikke-levedygtige celler ved propidiumiodidfarvning (Fig. 1B-a), blev ca. 4-6% CD133 + /EpCAM + celler detekteret i tumorvæv (fig. 1B-C), hvilket antyder tilstedeværelsen af formodede CSCS.
en
, Schema illustrerer arbejdet strøm af klumpformet CSC generation og differentierede cellepopulationer som et eksperimentelt system, herunder transplantation af en patients tumor i NOD /SCID-mus, spredning af CSCS fra P
1 xenotransplantattumorer (kugleformede, 10 × objektiv forstørrelse) og differentiering af CSCS i vedhæftende celler med epitelial morfologi (differentieret, 20 ×).
B
. Flowcytometrisk analyse af de primære celler isoleret fra den oprindelige patient tumor. PI-farvning udelukker døde celler (a). APC og PE-konjugerede isotypekontroller er vist i (b). Der blev fundet en population af CD133 + /EpCAM + celler (c).
C
. FACS af CD133 + /EpCAM + colon CSCS fra den primære cellepopulation afledt af P
1 xenograft tumorer. Døde celler og murine celler blev først udelukket af PI-farvning og anvendelse af et anti-muse-specifikke monoklonale antistof H-2k [d] henholdsvis (a b). CD133 + /EpCAM + og CD133- /EpCAM + populationer blev gated ifølge basislinjer isotypekontroller og sorteres (c). Endelig blev berigelse af begge populationer i de sorterede prøver bekræftet ved flowcytometri (d . Figur 1C-d) eller CD133- /EpCAM + (~96%;. Figur 1C-e) celler. Begge cellepopulationer blev straks blandet med Matrigel (ved en 1:01 volumenforhold) og implanteret subkutant i NOD /SCID-mus for at bestemme deres tumorigene potentiale. Baseret på de mulige celleantal, CD133 + /EpCAM + og CD133- /EpCAM + -celler blev implanteret i fem NOD /SCID mus ved 2.400 og 25.000 celler pr dyr hhv. Tydelige tumorer blev først påvist i CD133 + /EpCAM + gruppe i 6 uger og derefter påvist i CD133- /EpCAM + gruppe på 7 uger efter implantation. Når dyrene blev aflivet i uge 12, volumenet af tumorerne afledt af CD133 + /EpCAM + celler var signifikant større end dem, der hidrører fra CD133- /EpCAM + celler (Fig 2A;. P 0,01). Disse resultater bekræfter, at kolorektal cancer består af en lille population af tumor-initierende CSCS, der er positive for CD133 og EpCAM udtryk.
A
. Gennemsnitlige tumorvolumener hos NOD /SCID mus inokuleret med CD133 + /EpCAM + (3.400 celler /dyr; formodet CSCS) eller CD133- /EpCAM + (25.000 celler /dyr; formodede differentierede) celler efter 12 ugers implantation (middelværdi ± SEM, n = 5 ).
B
. Procentdel af CD133 + /EpCAM + udtrykkende celler i CSC og differentierede cellepopulationer (middelværdi ± SEM, n = 3; uparret, to-halet student t-test, P 0,05).
C
. Repræsentative resultater af celleproliferation satser og ekspressionsniveauer for cytokeratin i CSCS og differentierede celler. Cell numre på Y-akser justeres som en procentdel af de maksimale celletal analyserede.
D
. Repræsentative data, der viser den
in vitro
narkotika følsomhed CSCS og deres differentierede afkom som reaktion på oxaliplatin som vurderet af CellTiter Glo® assay.
Generation of Stabile klumpformet Kulturer af CSCS
Efter dyrkning primære celler isoleret fra P
1 xenotransplantattumorer i serumfrit stamcelle medium, ikke-klæbende 3-dimensionale sfæroider blev observeret inden for 2-3 uger (fig. 1A), og yderligere udvidelse af kultur genereret en stor mængde af sfæroider inden for 2 måneder. Flowcytometrisk analyse af dyrkede sfæroide celler viser, at CD133 + /EpCAM + celler består 33,2% af de totale celler (figur 1D;. Højre panel), hvilket antyder, at CD133 + /EpCAM + celler blev beriget ca. 5 gange i tumor kugleformet kultur sammenlignet med 4-6 % af CD133 + /EpCAM + celler i både den oprindelige patientprøve og xenotransplantattumorer (fig. 1B og data ikke vist henholdsvis). Tumor sfæroide celler blev kontinuerligt dyrket
in vitro
løbet af de sidste 2,5 år uden at vise en betydelig ændring i CD133 /EpCAM ekspressionsniveauerne eller tegn på ældning. CSC egenskaber af tumorceller sfæroide celler blev demonstreret i forsøgene beskrevet nedenfor. Tumor sfæroide celler derved henvises til i teksten som CSCS.
Relativt Hvilestrøm, Udifferentieret State of CSCS
For at inducere differentiering af CSCS blev tumor sfæroide celler dissocieret til enkelte celler og dyrket i serum-holdige medier som beskrevet i Materialer og Metoder. Adhærerende celler med epitelial morfologi optrådte indenfor 1-2 dage (fig. 1A) og fortsatte med at udbrede sig hurtigt i 2-3 måneder indtil proliferation standset. I overensstemmelse med vores tidligere fund i CSC befolkning direkte afledt af en patientprøve [23], blev der observeret en reduktion af CD133 + /EpCAM + cellefraktion i Tilhænger, differentierede celler (11,2%, fig. 2B).
Det er blevet impliceret som CSCS bevare en hvilende tilstand. Vi vurderede celleproliferation priser ved hjælp af et BrdU flowcytometri kit. Resultaterne viste, at den berigede CSC population indeholdt ~38.5% BrdU-positive celler i sammenligning med ~51.6% i de differentierede celler. Reduceret BrdU-inkorporering i CSC populationen indikerer, at disse celler var relativt hvilende sammenlignet med differentierede celler (fig. 2C). Ligeledes den del af cytokeratin-udtrykkende celler i CSCS var mindre (~17.8%) sammenlignet med den i den differentierede celle population (~44.7%;. Figur 2C). Som cytokeratin er en generel markør for epitheldifferentiering, lavere niveauer af cytokeratin udtryk i CSCS er tegn på deres relativt udifferentierede tilstand.
Drug Resistance af CSCS
In vitro
celle levedygtighed assays viste, at sammenlignet med differentierede celler, CSCS udviste betydelig modstand mod oxaliplatin (figur 2D;. forskel i lineær regression hældning; P 0,01). Vores konklusion er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser stoffet resistente natur CSCS [24] – [26]., Hvilket tyder på, at disse celler kan være ansvarlig for den kliniske tilbagefald hos kræftpatienter efter kemoterapi
Tumorigenicitet og Tumor Udvikling af CSCS
in vivo
Varierende mængder (dvs. 10
3, 10
4, 10
5 og 10
6 celler /dyr) af dissocierede CSCS og differentierede celler blev inokuleret subkutant i fem SCID-bg-mus. Tumoren tage rater mellem de to grupper var den samme (figur 3B.); Det gennemsnitlige tumorvolumener var dramatisk større i de mus der fik implanteret 1 x 10
5 eller 1 × 10
6 CSCS end i grupperne injiceret med det samme antal af differentierede celler (Fig 3A;. forskel i lineær regressionshældning, P 0,01). Disse resultater tyder på, at CSCS er mere tumorgene i forhold til deres differentierede celle afkom.
A
. Tumorvolumener i
in vivo
begrænsende fortynding assay for CSCS og deres differentierede afkom i SCID-bg mus som beskrevet i Materialer og metoder (middelværdi ± SEM; n = 5). Forskelle i vækstraterne blev fundet mellem CSC og differentierede cellegrupper podet med højere celletal (1 × 10
6 og 1 × 10
5; hældning forskel i afstamning regression; P 0,01).
B
. Tumor tage satser efter 63 dage efter implantation for CSCS og differentieret afkom.
C
. H . figur 2B). Trods de højere procentdele af CD133 + /EpCAM + -celler i den dyrkede CSC befolkning, procentdelen af CD133 + /EpCAM + -celler i xenotransplantattumorer faldt til 4-6%, hvilket er i overensstemmelse med den procentdel af CD133 + /EpCAM + celler observeret i den oprindelige patient tumor (fig. 1BC og fig. 4A). I modsætning hertil blev der ca. 2% CD133 + /EpCAM + celler observeret i den differentierede celle xenograft tumor (fig. 4A). Disse resultater tyder på, at dyrkede CSCS differentiere på implantation.
A
. Flowcytometrisk analyse af CD133 + /EpCAM + fraktionen i xenotransplantattumorer genereret af CSCS og differentieret afkom. Data er vist som CSC frekvens, der repræsenterer procentdelen af CD133 + /EpCAM + celler i tumorer af to forskellige oprindelser (gennemsnit ± SEM, n = 3; uparret, to-halet student t-test, P 0,05).
B
. Re-implantation af tumor fragmenter opnået fra CSCS eller differentierede celleafledte xenotransplantattumorer i sekundære SCID-bg-mus. Tumorvolumener er vist som middelværdien ± SEM (n = 5). Forskellen i vækstkurverne mellem de to grupper er statistisk signifikant (forskel i hældningen af lineær regression; P 0,05).
C
. Celleproliferation af de primære celler isoleret fra enten CSCS eller differentierede celleafledte xenotransplantattumorer i stamme-cellekultur tilstand. Levedygtige celler blev udpladet med 20.000 celler per brønd og dyrket i 17 dage. Celleantal blev manuelt talt, og de samlede celletællinger er vist som middelværdien ± SEM (n = 6; uparret, to-halet student t-test, P 0,01).
D
. Sfæroid CSC kulturer genetableret under stamcelle forhold fra xenotransplantattumorer genereret af den serielle implantation af CSC-afledte xenotransplantattumorer. P
2, CSCS dyrket fra xenotransplantattumorer afledt fra de oprindelige CSCS. P
3, CSCS dyrket fra xenotransplantattumorer afledt af P
2 CSCS.
E
. Delvis MALDI-TOF massespektrum viser H1047R mutation i
PIK3CA
. De røde stiplede linjer angiver, fra venstre mod højre, den uudstrakt primer peak, de 3 mulige toppe for de mutante G eller T alleler og vildtype A-allelen. Den høje top i midten af figuren er en T allel af
PDGFRA
i samme MALDI-TOF massespektrum.
Self-fornyelse Kapacitet CSCS
evnen til at forny sig selv, en vigtig egenskab ved CSCS, blev vurderet ved seriel transplantation af xenotransplantattumorer, som beskrevet i Materialer og Metoder. Kort fortalt blev xenotransplantattumorer afledt af CSCS eller differentierede celler fjernes fra tumorbærende mus. Tumor fragmenter (2-4 mm
3) blev implanteret subkutant i sekundære SCID-bg-mus. Xenotransplantattumorer (udpeget som P
2 xenotransplantattumorer) med oprindelse fra differentierede celle tumor fragmenter voksede langsomt i forhold til tumorer afledt af CSC tumor fragmenter (fig. 4B). Resultaterne af den ovennævnte serielle implantation eksperiment tyder på, at CSC oprindelse tumorer vokser mere aggressivt i forbindelse med en større procentdel af CSCS i cellen /fragmentet implantat. Følgelig
in vitro
dyrkning af primære tumorceller afledt af xenograft tumor stammer fra CSCS udviste en højere proliferativ kapacitet under stamceller betingelser i forhold til dem isoleret fra tumorer med oprindelse fra differentierede celler (fig. 4C). Disse resultater indikerer, at primære celler fra CSC-afledte tumorer kan have en vækstfordel
in vitro
mest sandsynligt på grund af deres højere indhold af CSCS.
Sfæroide CSCS (betegnet S
2 ) blev successivt etableret fra P
2 xenotransplantattumorer (fig. 4D). Når implanteret i mus, S
2 CSCS konsekvent dannede hurtigt voksende P
3 xenotransplantattumorer (data ikke vist). S
3 CSCS blev også genoprettet fra primære celler genereret fra P
3 tumorer (Fig. 4D). Både S
2 og S
3 CSCS indeholdt CD133 + /EpCAM + celler på et niveau, der kan sammenlignes med forældrenes CSCS (30-40%; data ikke vist). Ovenstående resultater tyder på, at
in vitro
dyrkede kolorektale CSCS er i stand til selv-fornyelse.
Analyse af fælles oncogen mutationer i CSCS og Biomarkør Discovery
For at identificere prædiktive biomarkører, der kan potentielt lede målrettet terapi, gennemførte vi genetisk analyse med OncoCarta ™ panelet ved hjælp DNA isoleret fra dyrkede CSCS og differentierede celler. Mutationsanalyse af 19 fælles onkogener, herunder
ABL1, Akt1, AKT2, BRAF, CDK, EGFR, ERBB2, FGFR1, FGFR3, FLT3, JAK2, KIT, MET, HRAS, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, PDGFRα, PIK3CA,
og
RET
, blev gennemført. Interessant nok blev det kun
PIK3CA (H1047R)
mutation er identificeret i begge celletyper (Fig. 4E).
Gennemgribende antiproliferativ aktivitet af PF-04.691.502 i Mutant CSCS
Vi bestemmes derefter på
in vitro
antiproliferativ aktivitet af PF-04691502, en potent dobbelt hæmmer af alle PI3K isoformer og mTOR (TORC1 og TORC2). Faktisk PF-04691502 udviste en signifikant inhiberende virkning på celleproliferation af CSCS (fig. 5A).
B
. Som vist i fig.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.