PLoS ONE: Prostata Cancer cellelinier under Hypoxi Exhibit Større Stem-Ligesom Properties

Abstrakt

Hypoxi er en vigtig miljøændringer i mange kræftformer. Hypoksiske nicher kan besættes af cancer spindel /progenitor-lignende celler, som er associeret med tumorudvikling og resistens mod strålebehandling og kemoterapi. Men det har ikke fuldstændig klarlagt, hvordan hypoxi påvirker stamceller-lignende egenskaber af prostatacancerceller. I denne rapport, undersøgte vi effekten af ​​hypoxi på humane prostatakræft-cellelinier, PC-3 og DU 145. I forhold til normoxi (20% O

2), 7% O

2 inducerede højere udtryk for HIF-1α og HIF-2α, der var forbundet med opregulering af Oct3 /4 og Nanog; 1% O

2 inducerede endnu større niveauer af disse faktorer. Den opreguleres

NANOG

mRNA-ekspression i hypoxi blev bekræftet at være overvejende retrogene

NANOGP8

. Lignende vækstrater blev observeret for celler dyrket under hypoxiske og normoxiske forhold for 48 timer; imidlertid kolonidannelse assayet viste, at 48 timer efter hypoxisk forbehandling resulterede i dannelsen af ​​flere kolonier. Behandling med 1% O

2 også udvidet G

0 /G

1 fase, hvilket resulterer i flere side population celler, og inducerede CD44 og ABCG2 udtryk. Hypoxi også øget antallet af celler positive for ABCG2 udtryk, der overvejende viste sig at være CD44

lyse celler. Tilsvarende sorteres CD44

lyse celler udtrykte højere niveauer af ABCG2, Oct3 /4, og Nanog end CD44

dim celler, og hypoxisk forbehandling øgede udtryk for disse faktorer betydeligt. CD44

lyse celler under normoxi dannet signifikant flere kolonier og kugler sammenlignet med CD44

dim celler og hypoxisk forbehandling selv øget denne effekt. Vore data viser, at prostatacancerceller under hypoxi besidder større stamceller-lignende egenskaber

Henvisning:. Ma Y, Liang D, Liu J, Axcrona K, Kvalheim G, Stokke T, et al. (2011) Prostata Cancer Cell Lines under Hypoxi udvise større Stem-lignende egenskaber. PLoS ONE 6 (12): e29170. doi: 10,1371 /journal.pone.0029170

Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: August 1, 2011; Accepteret: November 22, 2011; Udgivet: December 28, 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Det norske Radium Hospital Grundforskningsfond med tilskud nummer 333.005 til Zs. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Somatiske tumorer, herunder prostatakræft, indeholder en lille delmængde af stamceller-lignende celler, der kaldes cancer stamceller, med kapacitet til selv-fornyelse, differentiering, og initiering af nye tumorer. Det er blevet påvist, at cancer stamceller kan undslippe fra strålebehandling og kemoterapi, og er i stand til at danne metastatiske tumorer i andre organer [1], [2]. Kræft stamceller fortrinsvis bor i bestemte hypoxiske microenvironment-nicher, ofte eksisterende inde tumorer [3], [4]

De hypoxi inducerbare faktorer (HIFs) er centrale regulatorer fundet i pattedyrceller under lavere ilt spænding.; de er involveret med flere funktioner, såsom celleoverlevelse, angiogenese, og stamcelle vedligeholdelse, og spiller vigtige roller i cellulære og systemiske homeostase som respons på hypoxi [5]. HIFs er heterodimerer;

HIF1A

(HIF-1α) og

EPAS1

(HIF-2α) er de to store isoformer af α-underenheden, og deler en høj grad af sekvenshomologi. Oct3 /4 (også kaldet POU5F1) og Nanog er embryonale stamcellelinjer markører, der er vigtige for transskription og i at opretholde selv-fornyelse af embryonale stamceller og primordiale kønsceller. De er også blevet identificeret i forskellige somatiske tumorer, herunder hoved og hals, lunge, tyk-, æggestokkene, og prostatakræft [6] – [11]. Forholdsvis, udtrykkene for disse gener er nedreguleret i alle differentierede somatiske celletyper,

in vitro

samt

in vivo

[12], [13].

NANOG

, også kaldet

NANOG1

, har flere pseudogener, og blandt dem

har NANOGP8

senere blevet bekræftet at være en retrogene. Begge

NANOG1

NANOGP8

udtryk er blevet identificeret i forskellige cancer celletyper [14], [15], herunder prostata kræftceller [16].

En række overflademarkører er blevet anvendt til at isolere formodede cancer stamceller /progenitorceller. I prostatacancer, er de tidlige progenitorceller forbundet med flere specifikke overflademarkører, såsom CD44, CD133, og CXCR4 [17] – [19]. Side population teknologi er også blevet anvendt til at isolere cancer stamceller med evnen til at pumpe ud Hoechst 33342 [20]. Efflux af farvestoffet tilskrives medlemmer af ATP-bindende kassette familie, såsom ABCG2 (brystkræft resistens protein, BCRP). Opregulering af ABCG2 er også ansvarlig for kemoterapeutisk resistens i visse cancerceller [21]. I brystkræft og prostatakræft, har tidligere undersøgelser identificeret CD44

+ eller CD117

+ /ABCG2

+ celler med stamceller-lignende egenskaber, såsom øget klonogene /tumorgene egenskaber, højere udtryk for stemness gener og stærkere evne til at danne tumorer i dyremodeller [19], [22], [23].

Hypoxi hjælper embryonale stamceller til at opretholde stemness og højere oxygenspændinger drive celler i proliferation og differentiering, som er mere modtagelige for konventionelle behandlingsmodaliteter [24], [25]. Lignende resultater er blevet observeret i voksne celler, ligesom adipocytter, fibroblaster, og flere typer af cancerceller [26] – [28]. Virkningerne af hypoksi på prostatacancerceller er ikke blevet fuldstændigt belyst. Derfor i denne undersøgelse undersøgte vi prostata cancercellelinier PC-3 og DU 145 ved forskellige oxygenspændinger for bedre at forstå virkningen af ​​hypoxi på stænglen-lignende egenskaber af cellerne. Stemness faktorer, Oct3 /4 og Nanog, blev udtrykt ved højere niveauer i cellerne under hypoxiske dyrkning, og disse celler udviste forhøjet kolonidannelse potentiale i forhold til cellerne under normoxisk tilstand. Desuden opreguleret

NANOG

mRNA ekspression under hypoxi blev bekræftet hovedsageligt stammer fra retrogene

NANOGP8

. I disse prostatakræft-cellelinier, hypoxi også øget den del af siden population celler, udvidet G

0 /G

1 fase og resulterede i højere niveauer ABCG2 og CD44 udtryk. Yderligere forsøg viste, at CD44

lyse celler udviste signifikant større stemness, som verificeret af kolonidannelse assay, sfære vækst assay, og stemness faktor udtryk analyser.

Materialer og metoder

Cell kultur

human prostatacancer-cellelinier, PC-3 og DU 145, blev købt fra ATCC (American Type Culture Collection, USA) og holdt i vores laboratorium til denne undersøgelse. Til konventionel cellekultur blev celler podet i dyrkningskolber med RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin. Kulturer blev opretholdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator i en atmosfære af 20% O

2, 5% CO

2, og 75% N

2.

Xvivo Closed Incubation System (Xvivo systemet 300 C, BioSpherix, New York, USA) blev anvendt i denne undersøgelse for nøjagtigt opretholde forskellige oxygenspændinger i forskellige kamre. Efter 24 timers dyrkning i konventionel cellekultur (tillader celler at vedhæfte på kolberne) blev cellerne overført til forskellige kamre med 1% O

2, 5% CO

2, og 94% N

2; 7% O

2, 5% CO

2, og 88% N

2; eller 20% O

2, 5% CO

2 og 75% N

2 for variable perioder, før de høstes for yderligere analyse.

Semikvantitativ revers transkription-PCR (RT PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af RNeasy Kit (Qiagen, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. For at eliminere enhver DNA, blev DNase I anvendes i RNA-isolering procedure. RNA-prøve-koncentrationer blev kvantificeret ved anvendelse af et spektrofotometer (NanoDrop ND-1000, USA) ved OD260 /280.

Komplementær DNA (cDNA) blev efterfølgende syntetiseret fra 5 ug totalt RNA ved anvendelse af Multiscribe revers transkriptase (Applied Biosystems, Foster city, CA). Betingelserne for revers transkription var: 25 ° C i 10 minutter, 37 ° C i 12 minutter, 85 ° C i 5 minutter, efterfulgt af henstand ved 4 ° C. cDNA blev lagret ved -70 ° C til senere PCR-analyser

PCR-amplifikation af cDNA blev udført under anvendelse af et PCR-system (DOPPIO VWR, UK) og følgende program:. indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter; efterfulgt af 30 cykler (28 cykler for GAPDH) af annealing ved 60 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sekunder; efterfulgt af terminering med en 10 minutters forlængelse ved 72 ° C. De anvendte primere til RT-PCR, var: for Nanog, F 5′-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘og R 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3′, amplifikation af en 66 bp fragment; for Oct3 /4, F 5’-ACATGTGTAAGCTGCGGCC-3 ‘og R 5′-GTTGTGCATAGTCGCTGCTTG-3′, amplificering af et 297-bp fragment; for HIF-1α, F 5’-AGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAA-3 ‘og R 5′-CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTATCA-3′, amplificering af et 113-bp fragment; for HIF-2α, F 5’-GACCAGCAGATGGACAACTTGTAC-3 ‘og R 5′-CAGAAAGATCATGTCGCCATCTT-3′, amplifikation af en 84 bp fragment; og for GAPDH, F 5’-CCTCAAGATCATCAGCAATGC-3 ‘og R 5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3’, amplificering af et 101-bp produkt. Forsøgene blev gentaget mindst tre gange

De amplificerede PCR-produkter blev separeret ved 7,5% polyacrylamidgelelektroforese, farvet med GelRed (Molecular Probes, Invitrogen), og visualiseret med et Syngenet billedstabilisatorsystemet (G:. BOX Syngene , USA).

mRNA udtryk for

NANOG1

NANOGP8

blev målt ved kvantitativ PCR ved hjælp af en Taqman ABI 7900 Sequence Detector System (Applied Biosystems). De offentliggjorte specifikke primere og prober [29] blev anvendt i denne undersøgelse. For

NANOG1

: forward primer var 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT -3 “, reverse primer var 5′-AGAAGCCGTCTCTGGCTATAGATAA -3”, og sonden var CTGCTAAGGACAACATTGAT; for

NANOGP8

: forward primer var 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT-3 ‘, reverse primer var 5′-ACGAGTTTGGATATCTTTAGGGTTTAGAATC-3’, og sonden var CCTTGGCTGCCGTCTCTG. Alle primere og prober mærket med FAM-MGB blev opnået fra Applied Biosystems. Den GAPDH blev anvendt som en intern kontrol, og Ct-værdier på 20% O

2 blev anvendt som kalibratorer til evaluering

NANOG1

og

NANOGP8

ekspressionsniveauerne i respons på hypoxi. Forsøgene blev udført to gange. Ekspressionsniveauerne for

NANOG1

og

NANOGP8

blev analyseret gennem ΔΔCt metoden [29].

Immunoblotting

Cellerne blev hurtigt skyllet med is- koldt phosphatbufret saltvand (PBS) og skrabet over i RIPA-buffer (25 mM Tris-HCI pH 7,6, 100 mM NaCl, 1% NP40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS; Thermo Scientific Pierce, Tyskland), med proteaseinhibitorer (0,1 pM aprotinin, 1,0 mM PMSF, 1 uM leupeptin, 1 uM pepstatin) umiddelbart inden brug. Prøverne blev centrifugeret ved 15.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C og supernatanterne blev overført til nye rør. Protein- koncentrationer blev målt med et Bio-Rad protein assay ifølge producentens anvisninger. Prøverne blev opvarmet med en benchtop varmelegeme (Model 111.002, Boekel Scientific, USA) ved 100 ° C i 5 minutter i SDS-ladningsbuffer (500 mM Tris-HCI pH 6,8; 10% glycerol, 2% SDS, 0,6 M DTT, 0,05% bromphenol blå), og derefter en lige mængde protein (50 ug) per prøve blev underkastet 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid transfer-membran (Bio-Rad, USA). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i TBS-Tween i 60 minutter ved stuetemperatur og derefter inkuberet med de primære antistoffer ved optimal fortynding i TBST /5% mælk natten over ved 4 ° C. De optimerede antistoffer anvendt i denne undersøgelse omfattede: HIF-1α (1 ug /ml MAB1536, R katalognummer: NB100-150, Novus), HIF-2α (kanin, 1:100; katalognummer: NB100-122, Novus), Oct3 /4, (ged, 10 ug /ml; katalognummer: AF1759, R katalognummer: AF1997, R Sigma) blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 5 ug /ml, og blandingen blev inkuberet med intermitterende rystning i 90 minutter ved 37 ° C, i nærvær eller fravær af verapamil (50 uM; Sigma). Derefter blev cellerne vasket med iskold HBSS med 2% FBS, centrifugeret ved 4 ° C og resuspenderes i iskold HBSS indeholdende 2% FBS. Propidiumiodid blev tilsat til de suspenderede celler til en slutkoncentration på 2 ug /ml, med henblik på at afsløre levedygtige celler. Før analyse blev cellerne filtreret gennem en 70-um cellefilter til opnåelse af en enkelt cellesuspension. De celleaggregater blev kasseret fra analysen ved dublet diskrimination og enkeltceller blev analyseret på en LSRII flowcytometer (BD Biosciences). Hoechst 33342 farvestof var ophidset ved 350 nm, og side-population celler blev visualiseret ved brug af rød (rød, 660/10 nm) vs. blå (blå, 424/44 nm) detektion.

ABCG2 /CD44 fænotype og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)

Efter 48 timers inkubation ved oxygenspændinger henholdsvis 1% og 20%, PC-3 og DU145-celler blev trypsiniseret, talt, vasket med kold FACS-buffer ( PBS + BSA 0,03%), og resuspenderet til en slutkoncentration på 10

6 celler /ml. Cellerne blev præ-blokeret med 5% BSA i 30 minutter på is, før de blev farvet med primære antistoffer (anti-CD44 monoklonalt antistof direkte konjugeret med APC (allophycoyanin) og anti-ABCG2 monoklonalt antistof direkte konjugeret med FE (phycoerythin); BD Pharmingen Company) på is i mørke i 30 minutter. Cellesuspensioner blev vasket to gange, resuspenderet i 400 pi FACS buffer og filtreret gennem et 70 um nylonnet. Prøver blev analyseret på et flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) til påvisning af ABCG2 og CD44, og en FACS DiVa cellesorteringsapparat blev anvendt til cellesortering. Efter dyrkning ved 1% eller 20% O

2 i 48 timer blev de PC-3 og DU145 celler sorteres baseret på CD44-ekspression. For CD44 positive celler, blev kun de øverste 10% udtrykkende celler valgt (kaldet CD44

lyst); for CD44 negative celler, blev de nederste 10% udtrykkende celler isoleret (kaldet CD44

dim). For hver prøve blev levedygtige og enkelte celler gated; APC Mouse IgG2b (BD Pharmingen, USA) og FE Mouse IgG2b (BD Pharmingen, USA) isotypekontroller blev anvendt som negative kontroller.

Sphere formation assay

anvendte assay var baseret på tidligere beskrevet metoder [30]. Efter CD44

lyse celler blev sorteret med fremgangsmåden som beskrevet ovenfor, enkelt CD44

lyse og CD44

dim celler blev udpladet med en tæthed på 300 celler per brønd, i ultralav vedhæftede seks-brønds plader (Ultra lave cluster plader, Biovidenskab). Disse celler blev dyrket i serumfrit DMEM /F12-medium (Invitrogen) suppleret med 20 ng /ml EGF og 20 ng /ml bFGF i ti dage under normoxi betingelser, før kuglerne blev evalueret under inverse miscopy og talt (mere end 30 celler i en sfære blev anset for at være en fuld kugle). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg

Statistiske analyser

I hvert eksperiment data er vist som middelværdi ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg.; SPSS software (version 16.0) blev anvendt til dataanalyse. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af envejs ANOVA test og Students

t

-test (

P

0,05 blev betragtet statistisk signifikans).

Resultater

hypoxi inducerer ekspressionen af ​​HIF-1α, HIF-2α, Oct3 /4 og Nanog

HIF-1α og HIF-2α, de store transkriptionelle faktorer reagerer på hypoxi, blev undersøgt i humane prostata kræftceller PC- 3 og DU145, der blev udsat for forskellige oxygenspændinger for variable perioder. Ved 20% O

2 spændinger, HIF-1α og HIF-2α blev svagt udtrykt på både mRNA og protein niveauer; relativt højere niveauer af HIF-1α og HIF-2α udtryk blev observeret ved 7% O

2 spændinger, og de højeste niveauer blev set ved 1% O

2 spænding (figur 1A). Ved reduceret ilt spændingsniveauer, blev disse to faktorer, der allerede opreguleret efter 6 timers dyrkning. Deres udtryk nåede det højeste niveau i 12 timers dyrkning på 7% O

2 spændinger, men nåede højeste niveau på kun 6 timers dyrkning ved 1% O

2. Proteinekspression efter 48 timers dyrkning ved forskellige oxygenspændinger blev også undersøgt ved immuncytokemi (figur 1B). De udtryk for HIF-1α og HIF-2α var konsekvent højere i hypoxi-behandlede celler, i overensstemmelse med de resultater, der er opnået ved RT-PCR og immunblotting.

(A) I forhold til cellerne dyrket ved 20 % O

2, cellerne dyrket på 7% O viser

2 højere niveauer af HIF-1α og HIF-2α, og cellerne dyrkes ved 1% O

2 viser de højeste niveauer af HIF-1α og HIF-2α af både RT-PCR og immunblotting. (B) Immuncytokemi afslører højere niveauer af HIF-1a og HIF-2α udtryk i cellerne dyrket under 7% O

2 og de højeste niveauer af HIF-1a og HIF-2α udtryk i cellerne dyrket under 1% O

2 for begge cellelinier. De bryst carcinoma sektioner blev anvendt som positive kontroller for både HIF-1α og HIF-2α. Alle billeder blev oprindeligt taget ved 200 × og alle mellemværker blev taget ved 400 ×.

Oct3 /4 og Nanog bruges ofte som markører for de udifferentierede celler og spiller en afgørende rolle for bevarelsen kapacitet selvfornyelse i voksne stamceller [31], [32]. Udtrykkene i disse transkriptionsfaktorer blev også undersøgt i PC-3 og DU145 celler, der blev dyrket ved forskellige ilt spændinger. Ved begge de mRNA og protein niveauer (figur 2A), svage udtryk for Oct3 /4 og Nanog blev afsløret i disse to cellelinjer dyrkes ved 20% O

2 spændinger, mens deres udtryk blev opreguleret i celler dyrket under 7% og 1% O

2 betingelser. I begge cellelinjer, udtrykkene for disse to faktorer var højere ved 1% O

2 end på 7% O

2. Som det også ses i immunoblotting analyser (figur 2A), Oct3 /4 og Nanog begyndte at øge så tidligt som 6 timer efter cellerne blev overført til 1% O

2, og nåede grænseværdier på 12 timer for både celle linjer. Når cellerne blev anbragt i 7% O

2, udtrykkene for disse to faktorer blev også væsentligt forhøjet efter 6 timer, og nåede det højeste niveau i 12 timer dyrkning; men disse ekspressionsniveauerne var svagere end dem, der observeres i celler udsat for 1% O

2. Lignende resultater blev også opnået ved immuncytokemi (figur 2B). Efter udsættelse for hypoxisk tilstand, forstærket Oct3 /4 og NANOG udtryk blev set i både PC-3 og DU145 celler.

(A) I forhold til cellerne dyrket til 20% O

2, cellerne dyrket på 7% O

2 viser højere niveauer af Oct3 /4 og NANOG udtryk, og cellerne dyrkes ved 1% O

2 viser de højeste niveauer af Oct3 /4 og NANOG udtryk i PC-3 og DU 145 celle linjer ved både RT-PCR og immunblotting. (B) Immuncytokemi afslører tilsvarende højere niveauer af Oct3 /4 og NANOG udtryk på 7% O

2 og de højeste niveauer af Oct3 /4 og NANOG udtryk på 1% O

2, i forhold til cellerne dyrket på 20% O

2 for begge cellelinier. Humane seminom vævssnit blev anvendt som positive kontroller for disse to antistoffer. Alle billeder blev oprindeligt taget ved 200 × og alle mellemværker blev taget ved 400 ×.

For at afgøre, om de forhøjede

NANOG

udtryk stammer fra

NANOG1

eller

NANOGP8

, kvantitativ RT-PCR-analyser blev yderligere udført, med de tilsvarende celler dyrket under normoxi som kalibratorer. Det blev gentagne gange bekræftet, at den

NANOG1

i cellerne under normoxi var på meget lavt niveau, med gennemsnitlig Ct værdier 37,24 og 37,37 for PC-3 celle- og DU145 celler. Men den

NANOGP8

i cellerne under normoxi var relativt høj, med gennemsnitlig Ct værdier 33,56 og 33,51 for PC-3 celle- og DU145 celler. Selvom højere niveauer

NANOG1

NANOGP8

udtryk kunne observeres i begge cellelinier under hypoxi, den forhøjede

NANOG

udtryk blev bekræftet overvejende

NANOGP8

, med op til 6 gange og 10 gange stigning i udtryk i PC-3 og DU145 celler under 1% O

2, henholdsvis (figur 3). Da den

NANOG1

i cellerne under normoxi var ekstremt lav, 2,6 gange og 3,1 gange stigning i ekspressionen af ​​dette gen i PC-3 og DU145 celler under 1% O

2 repræsenteret stadig ret lavt udtryk niveau.

i forhold til cellerne under normoxi, der er forhøjede

NANOG1

NONOGP8

udtryk i cellerne under 7% O

2 for både cellelinjer, med op til 1,8 gange forøgelse

NANOG1

udtryk og op til 2,5 gange

NONOGP8

stigning i begge cellelinier; cellerne under 1% O

2 udtrykker endnu højere niveauer af

NANOG1

NONOGP8

, med 2,6 gange og 3,1 gange stigning i

NANOG1

udtryk i PC-3 og DU145 cellelinjer henholdsvis og med 6 gange og 10 gange stigning i

NONOGP8

udtryk i PC-3 og DU145 cellelinjer, hhv.

hypoxi øger kolonidannelse kapacitet og strækker G

0 /G

1 fase

Siden hypoksi forøgede ekspression af stemness faktorer, Derefter undersøgte vi, om hypoksi påvirket proliferationen af ​​disse celler. De PC-3 og DU145 celler blev dyrket under normoxi (20% O

2) eller hypoxi forhold (1% O

2 og 7% O

2) i 48 timer for spredning analysen. Som vist i figur 4A, for hver cellelinie var der ingen statistisk signifikante forskelle i proliferation af cellerne dyrket ved forskellige oxygenspændinger (

P

0,05), selv om cellerne voksede noget langsommere under hypoksi end normoxi. Dernæst spurgte vi, om hypoxi-forbehandling kan påvirke clonogenicty i disse celler. Cellerne blev indledningsvis udsat for forskellige oxygenspændinger i 48 timer, efterfulgt af overførsel til et normoxisk kammer (20% O

2) i 14 dage for kolonidannelse assayet. Sammenlignet med de celler, som blev støt dyrket ved 20% O

2 blev flere kolonier observeret i de celler, der var forbehandlet med 7% O

2, og endnu flere kolonier blev set i cellerne forbehandlet med 1% O

2 (figur 4B). Sammenlignet med cellerne altid dyrkes under normoxi, statistisk signifikant højere kolonidannelse effektivitet blev identificeret i de hypoksi-forbehandlet PC-3 og DU145 alen (figur 4C). Cellecyklus analyser påvist en udvidet G

0 /G

1 fase i de celler, der blev udsat for 1% O

2 i 48 timer i sammenligning med cellerne dyrket ved 20% O

2 som kontroller (

P

0,05). (Figur 4D og E), hvilket indikerer flere celler i en hvilende status i henhold hypoxi

(a) Cell spredning kurver viser ingen statistisk forskel for cellevækst under forskellige ilt spændinger (

P 0,05

). (B) Colony formation assay for begge cellelinier viser flere kolonier i cellerne forbehandles ved 7% O

2 i 48 timer og endnu flere kolonier i cellerne forbehandlet under 1% O

2 (C ) histogrammer for kolonidannelse effektivitet viser statistisk højere effektivitet i cellerne forbehandlede under hypoksi (7% eller 1% O

2) for begge cellelinier (

P

0,0001). (D) Flowcytometri shows udvidet G

0 /G

1 fase for begge cellelinier, der er blevet dyrket under 1% O

2 i 48 timer, i forhold til cellerne altid holdes under normoxi. (E) statistiske analyser afslører markant udvidet G

0 /G

1 fase i cellerne dyrket under hypoxi for begge cellelinier (

P

0,05).

Hypoxi forøger fraktionen af ​​celler med stamceller-lignende fænotype

Side population celler, antages at indeholde formodede prostatakræft stamceller, er kendt for at pumpe ud farvestoffet Hoechst 33342 [20], [33]. Celler udviser denne aktivitet blev yderligere vurderet under dyrkning på forskellige ilt spændinger. Højere fraktioner af disse side population celler blev observeret i kulturer holdt ved 1% O

2 spændinger i 48 timer i sammenligning med de celler, der dyrkes ved 20% O

2 (figur 5A og B).

PC-3 og DU145-celler blev dyrket i 1% O

2 og 20% ​​O

2 coditions i 48 timer til at analysere stilk-lignende fænotype gennem flowcytometriassayet. (A) De repræsentative billeder viser, at side population celler blev induceret i begge cellelinier efter hypoxiske behandling. (B) Statistik analyser viser signifikant forskel i side befolkning. (C) Flowcytometri analyser viser højere niveauer af ABCG2 udtryk intensitet i begge cellelinier under hypoxi. (D) Histogram viser statistisk signifikant forskel i ABCG2 ekspression. (E) Flowcytometri analyser viser højere CD44 udtryk intensitet i begge cellelinier under hypoxi. (F) Histogram viser statistisk signifikant forskel i CD44-ekspression.

ABCG2 og CD44 er blevet beskrevet som prostatakræft stamceller-lignende markører baseret på kliniske undersøgelser og studier i prostatakræft-cellelinjer [19], [ ,,,0],33]. Derfor ABCG2 og CD44 udtryk i PC-3 og DU145 celler, der blev inkuberet ved 1% eller 20% O

2 spændinger i 48 timer blev undersøgt med flowcytometri. Som vist i figur 5C og D, kastede var 1,20 gange og 1,42 gange stigning i ABCG2 udtryk i PC-3 og DU145 celler under 1% O

2, henholdsvis i forhold til cellerne altid dyrket under normoxi. Ligeledes var der 1,50-fold og 1,45-fold stigning i CD44-ekspression i PC-3 og DU145 celler under 1% O

2, henholdsvis i forhold til cellerne altid dyrket under normoxi (figur 5E og F).

Da hypoxi kunne fremkalde både ABCG2 og CD44-ekspression i begge cellelinier, vi yderligere undersøgt forholdet mellem CD44 og ABCG2. Dobbelt farvning af disse to overflademarkører afslørede, at hypoxi-induceret ABCG2

+ celler var primært CD44

lyse celler, og CD44

dim celler under den samme kultur tilstand var for det meste negative for ABCG2 udtryk (figur 6A ).

(A) Dobbelt farvning af CD44 og ABCG2 overflademarkører med flowcytometriassayet viser højere niveauer udtryk for disse faktorer i begge cellelinier under hypoxi i 48 timer.