PLoS ONE: ribonukleotidreduktase stor underenhed M1 forudser Dårlig Overlevelse Pga Modulation af proliferativ og invasiv evne Gastric Cancer

Abstrakt

Målsætninger

Vi havde til formål at undersøge den prognostiske værdi af RRM1 i GC patienter.

Metoder

i alt vurderbare 389 GC patienter med klinisk-patologisk og overlevelse oplysninger blev indskrevet fra City of Hope (COH, n = 67) og Zhejiang University (ZJU, n = 322) . RRM1-proteinekspression blev bestemt ved immunohistokemi på FFPE vævsprøver. Kaplan-Meier og Cox analyser blev anvendt til at måle overlevelse. Ras /Raf aktivitet og invasion assays blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​RRM1 i GC cellelinier.

Resultater Salg

In vitro Salg forsøg viste RRM1 aktiveret Ras /Raf /MAPK signaltransduktion og fremmes GC celleproliferation. I mellemtiden blev RRM1 udtryk signifikant associeret med lymfeknude involvering, tumorstørrelse, Ki67 udtryk, histologisk undertype og histologisk klasse i GC vævsprøver de (

s

0,05). Kaplan-Meier analyse viste, at høj RRM1 udtryk forudsagde dårlig overlevelse i GC patienter i COH og ZJU kohorter (log-rank

s

0,01). I multivariat Cox-analyse, var hazard ratio for RRM1 for total overlevelse var 2,55 (95% CI 1,27-5,15) og 1,51 (95% CI 1,07-2,13) ​​i COH og ZJU sætter hhv. Især RRM1 specifikt forudsagde resultatet af avancerede GCS med dårlig differentiering og høj proliferativ evne. Desuden hæmning af RRM1 af siRNA reducerede signifikant dNTP pool, Ras /Raf og MMP-9 aktiviteter og niveauerne af p-MEK, p-ERK og NF-KB, hvilket resulterer i vækst retardering og nedsat invasion i AGS og NCI-N87 celler.

konklusioner

RRM1 overekspression forudser dårlig overlevelse i GC patienter med fremskreden TNM stadie. RRM1 potentielt kunne tjene som prognostisk biomarkør og terapeutisk mål for GC’er

Henvisning:. Wang Q, Liu X, Zhou J, Huang Y, Zhang S, Shen J, et al. (2013) ribonukleotidreduktase store underenhed M1 forudser Dårlig Survival Pga Modulation af proliferativ og invasiv evne Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (7): e70191. doi: 10,1371 /journal.pone.0070191

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: April 9, 2013; Accepteret: 15 Juni 2013; Udgivet: 29 juli 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (R01, CA127541), National Nature Science Foundation of China (NSFC) 81.101.659 /H1609, Nature Science Foundation i Zhejiang-provinsen, Kina (NSFZ) Y2110073. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

gastrisk adenocarcinom (mavekræft, GC) er den anden hyppigste årsag til kræft-associerede dødelighed på verdensplan, især i de asiatiske lande og udviklingslande, hvor cirka en million tilfælde diagnosticeres årligt [1] – [2]. Den højeste dødelighed (28,1 per 100.000 mænd, 13,0 per 100.000 kvinder) fra GC er blevet rapporteret i Østasien, som omfatter Kina, Japan og Korea [2]. Konventionelle behandlingsmodaliteter, herunder kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, har vist en overlevelse fordel for GC patienter [3] – [6]. Men den 5-års overlevelse er stadig skuffende, og de fleste GC patienter dør af sygdom komplikationer og tilbagefald [3], [7] – [8]. Adskillige biomarkører bliver undersøgt med det formål at forudsige overlevelse og forbedre udfald hos patienter med GC [9]. Hidtil er få af biomarkører er meget udbredt klinisk til GC.

Ribonukleotidreduktase (RNR) betragtes som en terapeutisk mål for kræftbehandling. RNR er en tidsbegrænset enzym, der katalyserer omdannelsen af ​​ribonukleosid diphosphater at deoxyribonucleosid diphosphater gennem

de novo

metabolisme af endogene nukleotider [10]. RNR hæmmere, såsom hydroxyurinstof, er ofte blevet brugt til behandling af leukæmi og faste tumorer [11] – [13]. Imidlertid har anvendelsen af ​​RNR inhibitorer været begrænset på grund af lav effekt, lægemiddelresistens og bivirkninger [14]. De fleste af begrænsningerne ved RNR inhibitorer er forårsaget af ikke-specifik målretning. Human RNR består af tre underenheder, den store underenhed M1 (RRM1) og to små underenheder M2 og M2b. Hver lille underenhed kan kompleks med RRM1 til dannelse af et aktivt holoenzym [10]. M2 niveau forudsiger dårlig prognose i flere cancertyper, herunder lungecancer, pancreascancer og GC [15] – [18]. M2b synes at spille en rolle i at undertrykke malignitet og er forbundet med bedre overlevelse i kolorektale cancere ifølge vores tidligere forskning [19] – [20]. Imidlertid er de biologiske roller RRM1 ikke er identiske blandt disse kræftformer. Vi har undersøgt mRNA-niveauerne af RRM1 i cancer og tilsvarende normale vævssnit ved hjælp af ONCOMINE database (www.oncomine.com). Under udvalgte forhold (

s

0,05, fold forandring 2, gen rang = top 10%, alle datatyper), den RRM1 mRNA blev opreguleret i 39 unikke analyser og nedreguleret i 11 unikke analyser. RRM1 meste steg i afsnittene fra blære, livmoderhals-, tyktarms-, hoved og hals, lever og lungekræft, samt melanom og sarkom. I mellemtiden RRM1 blev nedreguleret i brystcancer, leukæmi og lymfom. Pattedyrs RNR subunit R1 (svarende til RRM1 i menneske) spiller en rolle i malignitet suppression ved inaktivering af Ras /Raf /MAPK signalvejen i Ras-transformerede 3T3-celler (mus) [21] – [22]. Yderligere outcome undersøgelser har vist, at høj RRM1 udtryk (sammen med ERCC1 eller PTEN opregulering) er en afgørende faktor for optimal overlevelse i den tidlige fase ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [23] – [26]; dog har andre undersøgelser vist tilsyneladende modstridende resultater [27] – [29]. RRM1 overekspression er relateret til resistens mod gemcitabin i NSCLC og kræft i bugspytkirtlen, hvilket resulterer i et dårligt resultat [30]. Disse studier indikerer, at den rolle RRM1 i cancer forbliver kontroversiel, selv i den samme cancertype på forskellige stadier eller under forskellige terapier [31] – [32]. RRM1 er blevet foreslået at have andre biologiske roller udover dannelse RNR holoenzymes at konvertere NDP til dNDP, som delvis kan forklare den lave effektivitet af RNR inhibitorer i kræftbehandlingen. Derfor ekstensivt undersøge roller RRM1 ville være nyttigt i at udvikle nye RnR-hæmmere til behandling af kræft specifikt. GC er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden, men RNR inhibitorer, såsom hydroxyurinstof og gemcitabin, er ikke blevet anvendt almindeligt på grund af lav effektivitet. På den anden side, har effekten af ​​RRM1 på GC udfald aldrig blevet undersøgt. Derfor ville det være værdifuldt at udforske den biologiske rolle RRM1 i GC-celler og evaluere den kliniske betydning RRM1 overekspression i GC patienter.

I denne undersøgelse roller RRM1 i regulering af celleproliferation og invasion gennem Ras /Raf signalvejen i GC cellelinier blev undersøgt. I mellemtiden blev RRM1 proteinekspression og resultatet af 67 GC patienter fra City of Hope National Medical Center (COH) også bestemt. Resultaterne blev yderligere valideret i 322 GC patienter fra Tilknyttede Sir Run Run Shaw Hospital i Zhejiang University (ZJU). Vores resultater tyder på, at RRM1 forudser dårlig overlevelse i GC’ers og kan potentielt tjene som en prognostisk biomarkør og terapeutisk mål i GC patienter.

Materialer og metoder

Etik Statement

Protokollen med denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af den institutionelle review board (IRB) i City of Hope National Medical center og Zhejiang University, hhv. Skriftligt informeret samtykke blev opnået ved alle de deltagende patienter i denne undersøgelse. De støtteberettigede GC prøver blev indsamlet fra City of Hope National Medical Center (COH sæt) og Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University (ZJU sæt), hhv.

Patienter

Inklusionskriterierne for deltagerne omfattede følgende: (i) gastrisk adenocarcinom med en patologisk diagnose; (Ii) informeret samtykke eller afkald på samtykke fra patienten; og (iii) opfølgende oplysninger. Vi ekskluderede GC patienter med (i) manglende informeret samtykke; (Ii) ikke-adenocarcinom eller multiple cancere; (Iii) ingen vævsprøve opnået; (Iv) tab af kontakt efter operation; eller (v) stadie IV GC uden palliativ kirurgi. Den COH sættet indeholdt en serie af 67 støtteberettigede GC patienter, som fik kirurgi med R0 (58 tilfælde), R1 (8 tilfælde) eller R2 (1 tilfælde) resektion i City of Hope National Medical Center fra januar 1989 til december 2006. Deltagerne i den COH sæt bestod af 51 hvide, 2 afrikansk-amerikanere og 14 asiater. I ZJU sæt blev støtteberettigede 322 GC patienter (242 sager med R0 resektion, 67 tilfælde med R1 resektion og 13 sager med R2 resektion) indskrevet. De blev opnået deres kirurgisk operation i løbet af 1997 til 2001. Alle GC patienter i ZJU sættet var asiatisk (kinesisk). I ZJU sæt, 153 af 322 patienter havde post-kirurgi adjuverende kemoterapi. De kombinationsforløb med kemoterapi omfattede folinsyre, 5-fluorouracil og oxaliplatin (FOLFOX6; 73 Sager); epirubicin, oxaliplatin og Xeloda (EOX, 12 tilfælde); 5-fluorouracil, epidoxorubicin og mitomycin C (FEM, 9 tilfælde); etoposid, leucovorin og 5-fluorouracil (ELF, 38 tilfælde); mitomycin C og 5-fluorouracil (MF, 4 tilfælde); og andre (oral S-1 /x, docetaxel-baserede og andre protokoller, 17 tilfælde). Alle patienter blev fulgt op indtil januar 2012. Detaljerne i den demografiske og klinisk-patologisk information blev opdateret. data De TNM stadie for deltagerne blev indhentet fra de kliniske og patologiske diagnoser og bestemmes efter de NCCN retningslinjer for GC (Version 2, 2011). De humane vævsprøver undersøgt i denne undersøgelse blev opnået fra kirurgi og opbevaret ved stuetemperatur efter formalin-fikseret og paraffinization. Korrelation resultatet vist opbevaringstid påvirkede ikke RRM1 udtryk i statistisk signifikans (

s

0,05).

Study Design

Det var en retrospektiv resultat undersøgelse. Prøven størrelse blev anslået ved hjælp nQuery Advisor 6,01 (Statistisk Solutions Ltd, Saugus, MA, USA) software. Baseret på denne beregning, vil en stikprøve på 300 deltagere nå 95% studie effekt (tosidet α = 0,05). Demografiske og klinisk-patologisk information blev udvundet gennem omhyggelig diagram gennemgang. Alle patienter blev periodisk fulgt op for overlevelse data; patienter med helbredende operationer blev også fulgt til tilbagefald overlevelse. Opfølgningen perioden blev beregnet fra tidspunktet for kirurgi til datoen for sidste kontakt. Den sygdomsfri overlevelse blev defineret som tiden fra den første operation til tumortilbagefald. Metastase eller lokal tilbagefald blev anset tegn på tumor tilbagefald. Kun dødsfald fra GC blev anset endepunktet af sygdomsspecifikke overlevelse. De variabler vurderede omfattede fødselsdato, køn, dato for diagnose, dato og type operation, type kemoterapi, TNM stadie, tilbagefald /metastaser status, dato for tilbagefald /metastaser og klinisk status ved sidste opfølgning.

Immunhistokemi (IHC) blev anvendt til at bestemme RRM1 proteinekspression i formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) humane vævsprøver. For at undgå systemiske afvigelser, blev antistofferne valideret, og betingelserne for IHC blev optimeret ved hjælp af en kontrol væv bord. At normalisere reaktionsbetingelserne blev alle FFPE vævsprøver fra ZJU sættet samles i flere vævsarrays. Desuden blev en kontrol FFPE multiple vævs board inkluderet for hver IHC-farvning. For at reducere billedet læseren bias, blev et automatiseret billeddannende system anvendt til at opnå digitale billeder af de farvede sektioner for de efterfølgende kvantitative analyser. Hver prøve blev evalueret af to uafhængige efterforskere i en dobbeltblind måde.

Alle demografiske data, klinisk-patologisk information og IHC resultater blev kodet og trådte i en GC-database. Dobbelt kontrol dataindtastning og logiske blev brugt til fejl reduktion. Microsoft Office Access® blev brugt til at oprette databaser. De manglende tilfælde blev mærket med den passende “manglende” kode. JMP 8.0 Software (SAS Institute, Cary, NC, USA) og GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA) blev anvendt til statistisk analyse og overlevelse kurve plot. Multivariat logistisk regression blev anvendt til at justere for kovarianteffekter virkninger på odds ratio (OR). Kaplan-Meier analyse og en Cox proportionel risiko model blev anvendt for den samlede overlevelse (OS) og progressionsfri overlevelse (PFS) analyser. Multivariat analyser og lagdeling blev anvendt til at mindske virkningerne af forstyrrende virkninger på estimeringen af ​​hazard ratio (HRS).

Kvantitative IHC Analyser

IHC blev brugt til at undersøge RRM1 proteinekspression. Nøjagtigheden af ​​IHC blev valideret af kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) på to parallelle prøver. Kort fortalt efter afparaffinering, blev den endogene peroxidase aktivitet blokeret med 3% H

2O

2 (brintoverilte). Array Objektglassene blev senere inkuberet med normalt gedeserum i 20 minutter, og derefter primært antistof blev påført i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter 7 minutter af H

2O

2 behandling blev array-slides inkuberes med peberrodsperoxidase-mærkede tilsvarende antistoffer til 30 minutter. DAB (3,3′-diaminobenzidin, 0,05 g DAB og 100 ml 30% H

2O

2 i 100 ml PBS) blev påført i 5 minutter og igen i 10 minutter. Hvert objektglas blev derefter modfarvet med hematoxylin (DAKO). PBS blev anvendt som en negativ kontrol.

Antistoffer Salg

En kommercielt fremstillet monoklonalt muse antistof blev anvendt mod human RRM1 i denne undersøgelse. Den RRM1 antistof produktionen var baseret på vores tidligere standard-protokol [33]. Anti-hRRM1 antistof-producerende hybridomer blev primært screenet ved enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA). Kloner blev valgt på baggrund af deres aktiviteter på paraffinindlejrede humane væv. RRM1 ekspression blev kvantificeret ved visuel grading system baseret på omfanget af farvning. Både immunoreaktivitet i kernen og cytoplasmaet blev evalueret. Hvert billede blev scoret baseret på følgende kategorier: subcellulære lokalisering (fx cytoplasmaet vs. kerne), farvningsintensitet (fx integreret optisk densitet), og /eller procentdelen af ​​farvede celler (fx samlede areal eller procentdelen af ​​positive celler). Baseret på intensiteten af ​​signalet, blev RRM1 ekspression klassificeret som negativ (0), svagt positive (1), positive (2) eller stærkt positiv (3). En RRM1 score på 0 eller 1 blev udpeget RRM1-lav, og en score på 2 eller 3 blev klassificeret som RRM1-høj. Fordi vores data gav konsistente resultater mellem cytoplasmatisk RRM1 og nuklear RRM1, overvejede vi enten en høj nukleare eller en høj cytoplasmatisk score som RRM1-high i Kaplan-Meier og Cox-analyser.

Antistoffer mod p-MEK, s -ERK, NF-KB, Ras, Sp-1 og Ki67 blev opnået fra Cell Signaling Technology, Santa Cruz, Invitrogen, Millipore, Abcam og BD Bioscience, henholdsvis.

Plasmid Byggeri og transfektion

Den hRRM1 plasmid (pEBG-RRM1) blev konstrueret og rapporteret i vores tidligere undersøgelse [34]. Plasmidet blev transficeret med X-treme GENE HP DNA-transfektion Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens protokol for AGS celler. Kort fortalt 2 ug plasmid blev blandet med 6 pi X-treme GENE HP i 200 pi serumfrit medium efter inkubation ved stuetemperatur i 15 minutter. Blandingen blev sat til 2 × 10

5 pre-plated AGS-celler i en 6-brønds plade. Efter transfektion i 48 timer blev cellerne høstet.

Celledyrkning og RNA Interference

Den humane GC cellelinier AGS og NCI-N87 blev opnået fra American Type Culture Collection og dyrket i F- 12K medium (AGS) eller RPMI-1640 medium (NCI-N87) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) og 1% penicillin og streptomycin i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C.

RRM1 siRNA (sc-37640) og scramble siRNA (sc-44233) blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology Inc. transfektionerne blev udført med Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger.

In vitro

proliferationsassav

En

in vitro

spredning assay blev udført i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [15]. Kort fortalt 0,5 × 10

4 AGS og 2,0 × 10

4 NCI-N87 celler blev præ-belagte i brønde i en 16-brønd enhed er kompatible med en W200 realtid celle elektronisk sensing (RT-CES) analysator og 16 × station (ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA). Den “celle-indeks” (normaliseret impedans) blev beregnet periodisk (typisk hver 30 minutter) i henhold til cellevækst i hver brønd. Medmindre andet er angivet, blev fire replikater for hver siRNA behandlingsgruppe. RRM1 inhibering blev målt ved Western blotting.

In vitro

Invasion Assay

Matrigel invasion kamre blev indkøbt fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA). Først blev en 8-mm-porøsitet polycarbonatmembran dækket med 1 ml serumfrit medium indeholdende 1 x 10

5 celler pr. Pladerne blev derefter inkuberet med en kemo-tiltrækningsstof (20% FBS-medium) i 24 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Mediet blev derefter fjernet, og ikke-invaderende celler blev forsigtigt skrabet af med en celleskraber. Filteret blev derefter vasket to gange med PBS og farvet med 0,5% methylenblåt i 4 timer. De celler, der passerede gennem filteret og klæbet til den nedre overflade blev talt under anvendelse optisk mikroskopi.

gelatinezymografi

En gelatinezymografi assay blev udført for at undersøge indflydelsen af ​​RRM1 på sekretionen af ​​aktiv MMP-9. Kort fortalt blev celler dyrket til 70% konfluens, vasket to gange med 1 × PBS og inkuberet i serumfrit medium. Efter 24 timer blev konditioneret medium opsamlet og koncentreret med en centrifugal filter (Millipore, MA, USA) under 6000 g i 15 minutter. Koncentrerede prøver blev fremstillet i ikke-reducerende prøvebuffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Proteiner (20 pl /bane) blev adskilt under anvendelse af SDS-PAGE i geler indeholdende 1 mg /ml gelatine (Novex 10% Gelatine Gel, Invitrogen). Gelerne blev renatureret i 1 time ved stuetemperatur i 1 × renaturering buffer (Invitrogen). Derefter blev gelerne inkuberet natten over ved 37 ° C i 1 × udviklingslande buffer (Invitrogen). Gelen blev farvet med Coomassie blue. Lysstyrken af ​​de klare bånd, hvor MMP9 blev placeret og gelatinen blev nedbrudt, blev analyseret ved hjælp af densitometri.

Ras Activity Assay

Ras aktivitet blev målt ved hjælp af et Ras Activity Assay kit (Millipore, MA, USA). Først blev aktiv Ras (GTP-bundet Ras) bundet til Raf-1-Ras-bindingsdomænet (RBD) konjugeret til agarose beads ved inkubering cellelysater ved 4 ° C i 45 minutter. Så det aktiverede Ras blev frigivet i SDS-PAGE-prøvebuffer efter omfattende vask af agaroseperler (tre gange) med vaskebuffer (25 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl

2, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 1 mM Na

3VO

4, 10% glycerol, 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /ml aprotinin og 25 mM NaF). Mængden af ​​Ras blev påvist med monoklonalt pan-Ras-antistof.

Måling af dNTP Pool

Dette assay blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden for Sherman og Fyfe [35]. Den samlede reaktionstid var 50 pi. Reaktionsblandingen indeholdt 10 mM MgCl

2, 0,25 pM skabelon /primer, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM DTT, 1,25 pM [

3H] dATP (for dCTP, dGTP og dTTP assay) eller [

3H] dTTP (for dATP assay) og 0,2 enheder af Sequenase (2,0). Reaktionsblandingen blev inkuberet ved stuetemperatur i 20 minutter, og derefter blev reaktionen standset på is. Efter reaktionen blev 40-pi prøver fjernet og plettet på cirkulær (diameter 2,4 cm) Whatman DE81 ionbytning papirer. Papirerne blev tørret, vasket (3 x 10 minutter) med 5% Na

2HPO

4, og skyllet en gang med destilleret vand og en gang mere med 95% ethanol. Hver papir blev tørret og deponeret i et lille reagensglas; 7 ml Ecolume blev derefter tilsat til hvert rør. En væskescintillationstæller (Beckman Coulter Brea, CA, USA) blev anvendt til at tælle tritiummærket dNTP’er. Standard prøver var 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 pmol.

Resultater

Validering af specificiteten af ​​RRM1 Antistoffer i gastrisk adenocarcinom Prøver

specificitet RRM1 antistoffer blev valideret af et peptid blokering assay. Antistofferne blev fortyndet (1:1000), præinkuberet med rekombinant RRM1 peptid (1 pg /ml) ved 4 ° C natten over, og derefter visualiseret ved western-analyse. I fig. 1

En

, en dominerende signal af en støtteberettiget RRM1 antistof kunne ses ved western blot og blev reduceret med RRM1 knockdown i AGS celler. I mellemtiden blev signalet specifikt blokeret af rekombinant RRM1 peptid, hvilket indikerer specificiteten af ​​de RRM1 antistoffer.

A

. Peptid blokering assay blev udført på RRM1 antistoffer for IHC-farvning, alle antistoffer var i 1:1000 fortynding og inkuberet med rekombinant RRM1 peptid (1 pg /ml) ved 4 ° natten over. Antibody # 2 viste mere specifik og stærkere signal end andre antistoffer (data ikke vist), derfor vi brugte det som antistoffet for IHC farvning.

B

. Nuklear fraktionering blev ansat på AGS celler. AGS-celler blev udsultet i 96 timer og igen suppleret med normalt vækstmedium i 12 timer. Derefter blev cellerne opsamlet og fraktioneret for kerneprotein. Western blot blev anvendt til at afsløre sub-cellulære lokalisering af RRM1, GAPDH og Sp-1 blev anvendt som cytoplasmatiske og nukleare markører.

C

. Translokation af RRM1 fra cytoplasma til kernen blev observeret af Immuno-fluorescens cytokemi. AGS-celler blev udsultet i 48 timer og igen suppleret med normalt vækstmedium i 12 timer. Derefter blev cellerne fikseret og inkuberet med primære og sekundære antistoffer. Translokation af RRM1 blev observeret under fluorescensmikroskopi.

D

. RRM1 blev heterogent udtryk blandt tilstødende normale væv og histologiske undertyper (JGCA klassifikation V.2011), herunder papillær, rørformet, mucinøs og signetring celle og udifferentierede adenocarcinom.

Fordi forskellige ekspressionsmønstre af RRM1 er blevet rapporteret , lokaliseringen af ​​RRM1 blev yderligere undersøgt. I normale celler blev RRM1 overvejende udtrykt i cytoplasmaet (fig. 1

B

). En fluorescensmærkning assay bekræftede også, at RRM1 protein akkumuleret i cytoplasmaet efter 48 timers serum sult. Imidlertid RRM1 translokeres til kernen i afhængighed af serum re-tilskud i 12 timer (fig. 1

C

). Derfor tog vi begge cytoplasma og nuklear farvning af RRM1 i betragtning ved fortolkningen af ​​IHC farvning.

RRM1 blev heterogent udtryk blandt undertyper af GC væv (fig. 1

C

). RRM1 blev fortrinsvis udtrykkes i cancervævet (47,0% RRM1-høj) over de tilstødende normale væv i GC-prøver (25,4% RRM1-høj). Ifølge JGCA klassifikationen [36], blev gastrisk adenocarcinom inddeles i fem histologiske undertyper. RRM1 blev højt udtrykt i papillære (61,9%), rørformet (59,6%) og udifferentierede adenocarcinomer (55,4%), men relativt lavere i mucinøs (34,4%) og signetring celle adenocarcinom undertyper (14,3%).

RRM1 Fremmer cellevækst via Ras /Raf /MAPK signalvejen i GC

pattedyr RNR store subunit R1 (R1) undertrykker malignitet i Ras transformerede mus 3T3-celler [21]. p-ERK er et vigtigt nedstrøms komponent reguleret af Ras /Raf signaltransduktion. Derfor, for at undersøge forholdet mellem RRM1 og GC aggressivitet, målte vi p-ERK i 32 GC patienternes paraffin prøver. Den IHC farvning viste, at RRM1 udtryk samstemmende var forbundet med p-ERK niveau i GC prøver (figur 2

En

,

venstre panel

). Korrelationen var statistisk signifikant (figur 2

En

,

højre panel

). Desuden gen overførsel eksperiment angivet, at højere RRM1 udtryk øget p-ERK udtryk i AGS celler (Fig 2

B

,

øverste panel

) og fremmes cellevækst

in vitro

(fig 2

B

,

nederste panel

). For at bestemme om RRM1 regulerer Ras /Raf /MAPK signalering, vi nedreguleret RRM1 udtryk ved siRNA i AGS og NCI-N87 celler. Scramble siRNA blev anvendt som en negativ kontrol. Western blot-analyse viste, at RRM1 specifikt blev reduceret med den tilsvarende siRNA (fig. 2

C

). Sammen med en reduktion af RRM1 blev signalerne for p-MEK, p-ERK og NF-KB faldt betydeligt; Ras /Raf aktivitet også faldet markant i både AGS og NCI-N87 celler. Ovenstående observationer illustrerer, at RRM1 kan fremme GC celledeling ved at aktivere Ras /Raf /MAPK signalering.

En

, RRM1 overekspression viste sig at være ledsaget med høj ekspression af p-ERK i GC patienter (

s

0,01, n = 32), vinduer 1-4 viser repræsentative billeder af p-ERK og corresponsive RRM1 farvning i 2 ondartede væv fra to repræsentative patienter (Pic 1-2: GC No1; pic 3-4: GC No2).

B

, Overekspression af RRM1 (både ektopisk og endogen RRM1) gennem transfektion af pRRM1 (pEBG-RRM1) fremmer AGS cellevækst; p-ERK var også opreguleret senere.

C

, RRM1 blev nedreguleret med siRNA i to GC cellelinjer, AGS og NCI-N87. Cellerne blev opsamlet og analyseret med Western blot og Ras aktivitet kit (Millipore, MA). Ras-Raf-aktivitet blev alvorligt reduceret, og så var de nedstrøms proteiner p-MEK, p-ERK og c-NFKB.

RRM1 Expression er associeret med mavekræft Aggressivitet

Til yderligere at undersøge de ovenstående konklusioner blev RRM1 proteinekspression måles i GC prøverne. Baseret på IHC-farvning, 22 af 67 GCS i COH sættet og 156 af 322 GCS i ZJU sættet var enten cytoplasmatisk eller nukleær RRM1-høj (tabel 1). I COH og ZJU sæt, RRM1-høj var hyppigere hos mænd end kvinder og mere tilbøjelige til statistisk signifikans i ZJU sættet (

s

0,01). Der var mere proximale GC (44,8%) i COH sæt, men mere distal GC (52,5%) i ZJU sættet. RRM1 udtryk var signifikant højere i de proksimale GCS (

s

0,05) i COH sæt, og en lignende tendens blev observeret i ZJU sættet (

s

= 0,31). I mellemtiden blev RRM1 forbundet med antallet af lymfeknuder, der er involveret, tumor størrelse, Ki67 udtryk, histologisk undertype og histologisk kvalitet i ZJU sættet (

s

0,05 for hver). På grund af den lille prøvestørrelse, blev der ikke statistisk signifikans for de ovennævnte faktorer observeret i COH sæt, men lignende tendenser kunne naturligvis ses.

For yderligere at undersøge, om RRM1 var forbundet med GC aggressivitet, en ikke-betinget multivariat logistisk analyse blev udført. Her blev TNM fase betragtes som output (trin III IV vs. trin I II), og odds ratio (OR) for RRM1 (RRM1-høj vs. RRM1-lav) blev indstillet til co-faktorer, herunder alder, køn, tumor placering og histologisk bedømmelse. Den justerede OR for RRM1 var 1,78 (95% CI 1,09-2,94) i ZJU sættet. Disse resultater viser, at høj RRM1 ekspression blev forbundet med fremskreden TNM stadie i GC.

RRM1 Overekspression er forbundet med dårlig Overlevelse i GC Patienter Salg

Fordi RRM1 er forbundet med fremskreden TNM fase af GC, Kaplan -Meier analyse og en Cox proportionel risiko model blev anvendt til at fastslå virkningen af ​​RRM1 på resultatet af GC. I COH sæt, den længste opfølgningstid var 228 måneder; 53 af 67 GC patienter døde fra GC-relaterede lidelser, og 34 patienter havde en gentagelse. I ZJU sæt, den længste opfølgningstid var 179 måneder; alt 175 af 322 GC patienter døde fra GC, og 87 patienter havde en gentagelse. Resultater er i overensstemmelse med dem, der blev set for cytoplasmatisk RRM1 (HR = 1,62; 95% CI 1,20-2,20) og nuklear RRM1 (HR = 1,61; 95% CI 1,19-2,18). Derfor enten høj cytoplasmatisk eller høj RRM1 udtryk nukleare blev behandlet i den følgende analyse.

Kaplan-Meier analyser viste, at RRM1-høj var signifikant relateret til dårlig OS og PFS i COH og ZJU sæt (log rank

s

0,01 eller

s

= 0,03) (figur 3

A

–

D

).. Den mediane overlevelsestid for RRM1-lav delmængde var 28 måneder i COH sæt og 42 måneder i ZJU sættet. For RRM1 høje delmængde blev den mediane overlevelse væsentligt reduceret til 12,5 og 23 måneder i COH og ZJU sætter hhv. Lignende resultater blev opnået i PFS analyse. RRM1-høj signifikant øget risiko for GC tilbagefald i begge sæt (log rank

s

0,01 i COH sættet og

s

= 0,03 i ZJU sæt)

A

. Kaplan-Meier analyse til OS blev vist som RRM1-høj

vs.

RRM1-lav til at forbedre undersøgelsen magten i COH sæt.

B

, Kaplan-Meier analyse til OS blev gennemført i ZJU sæt. Kaplan-Meier analyse for PFS blev udført på

C Hotel (COH sæt) og

D

(ZJU sæt). Den flerdimensionale Cox-analyser til OS af GC blev vist på

E

F

for COH og ZJU sat henholdsvis. Den hazard ratio (HR) for RRM1 var baseret på RRM1-høj

vs

RRM1-lav.; Tumor placering var proksimale

vs

. krop

vs

. distal Hel; Ki67 var positiv

vs

. negativ; Tumor etape var Stage I II

vs

. III IV; Tumor klasse var lav

vs

. moderat

vs

. høj; Køn var mandlige

vs

. kvinde; Alder var baseret på pr ændringer enhed. Den “*” blev brugt til at indikere statistisk signifikans (

s

0,05)

For at undgå confounder effekter blev en multivariat Cox-analyse udført ved hjælp af COH og ZJU sætter (. fig. 3

E og 3F

). I COH sæt, de faktorer, TNM stadie, tumor placering, tumor klasse, Ki67 niveau, køn og alder blev anvendt til at justere HR. Som illustreret i fig. 3

E og 3F

, RRM1 og TNM stadie var signifikant forbundet med dårlig OS af GC patienter i COH og ZJU sæt. HRS for RRM1 var 2,55 (95% CI 1,27-5,15) og 1,51 (95% CI 1,07-2,13) ​​i COH og ZJU sætter hhv. Ki67 har været meget anvendt som en celledeling biomarkør for kræft, men det mislykkedes at forudsige resultatet af GC i COH og ZJU sætter.

den prognostiske Udførelse af RRM1 i Avancerede GC’ers

Til yderligere at evaluere den prognostiske ydeevne RRM1 i undergrupper af GC, blev gennemført en lagdeling analyse. Her har vi ikke indberette lagdeling resultater fra COH sæt på grund af den lille stikprøvestørrelse (i alt 67 tilfælde).