PLoS ONE: Polycomb Group Protein Bmi1 kræves for vækst af RAF Driven Ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Vi har tidligere beskrevet en RAF onkogen drevet transgen musemodel for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Her undersøger vi, om tumor initiering og vækst kræver stamcelle selvfornyelse faktor Bmi1.

vigtigste resultater

For at vurdere Bmi1 funktion i NSCLC to grundlægger linjer, der adskiller sig i forekomsten og latenstid af tumordannelse blev sammenlignet. Ablation af Bmi1 udtryk i begge linier havde en dramatisk reduceret tumorvækst. Da linjen med kortere latens matchede levetid Bmi1 knock out-mus, blev disse mus udvalgt til yderligere undersøgelse. Fraværet af Bmi1 ikke reducere antallet af tumorinitiering i disse mus som kun størrelsen og ikke antallet af tumorer faldt. Reduktion i tumorvækst skyldtes en stigning i celledød og fald i cellecyklusprogression der svarede med opregulering af p16

INK4a og P19

ARF.

Betydningen

dataene identificerer Bmi1 som en vigtig faktor for ekspansion, men ikke initiering af RAF drevet NSCLC

Henvisning:. Becker M, Korn C, Sienerth AR, Voswinckel R, Luetkenhaus K, Ceteci F, et al. (2009) Polycomb Group Protein Bmi1 kræves for vækst af RAF Driven Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 4 (1): E4230. doi: 10,1371 /journal.pone.0004230

Redaktør: Mauricio Rojas, Emory University, USA

Modtaget: August 5, 2008; Accepteret: December 5, 2008; Udgivet: 19 januar 2009

Copyright: © 2009 Becker et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. MB og CK blev støttet af SFB TR 17 af DFG, ARS og KL blev støttet af DFG kandidat kollegium 1141 Wuerzburg-Nice. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald i den vestlige verden. Baseret på histologi to forskellige typer af lungekræft, er ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC) defineret. Samlet 50% af alle adenocarcinomer, den mest udbredte form for NSCLC, harbour mutationer i bestanddele af den mitogene signalering kaskade dvs. EGFR, K-Ras og B-RAF [1]. Mutationer af C-RAF findes også i NSCLC, dog på et lavere frekvens.

Flere systemer, model lungekræft i mus er blevet rapporteret. De strategier til at etablere disse modeller har stort set fulgt to forskellige veje. 1) Induktion af onkogen ekspression og sletning af tumorsuppressorgener via adenovirus rettet ekspression af Cre-rekombinase [2] – [5]. Denne tilgang efterligner forekomst af somatiske mutationer i voksent væv. 2) Konstitutiv onkogen ekspression i målceller ved anvendelse af celletypespecifikke promotorer [6], [7]. De sidstnævnte modeller kan være mere passende for gestationally erhvervede mutationer. Mens de viralt inducerede modeller viser en noget udefineret målcelle spektrum den transgene fremgangsmåde har potentiale til at målrette alle transformation sensitive celler, der viser ekspression fra en særlig celletype specifik promotor.

Vi har tidligere beskrevet frembringelsen af ​​transgene linier udtrykke en oncogenically aktiveret version af C-raf-kinase (C-RAF BXB) under kontrol af den humane alveolære typen to (AT2) cellespecifik overfladeaktivt protein C (SP-C) promotor [7]. To grundlægger linjer, videre benævnt BXB11 og BXB23, viser lunge målrettet adenom udvikling med høj penetrans, høj forekomst og kort ventetid. Tumorer er fænotypisk temmelig stabile som noget nukleart atypi eller metastase blev set på en C57BI /6 baggrund. En kubisk celletype overvejende danner adenomer. Ingen bronchieepithelceller hyperplasi kontinuert med cuboide tumorer som beskrevet for onkogene K-Ras modeller [4] er blevet observeret. Den BXB23 grundlægger linje er blevet udbredt i genetiske undersøgelser for at analysere tumor progression påvirke faktorer [7] – [12]. Selvom transgen ekspression i primære mål alle AT2 celler kun en delmængde af dem reagerede på ekspression af C-RAF BXB med dannelsen af ​​tumorer [7]. En forklaring på dette fund er, at en lunge stamcelle rum reagerer på mitogen kaskade signalering med ekspansion. Alternativt lukkes af transgenekspression i størstedelen af ​​AT2 celler kan forekomme. Vi foretrækker den første mulighed, og antage, at dette stamfader rum er Bmi1 positiv og afhænger af mitogen kaskade signalering for selvfornyelse da behandling med en MEK-inhibitor medførte præferencenedsættelsen i den del af Bmi1 positive tumorceller og et dramatisk fald i tumor masse [ ,,,0],12]. I overensstemmelse med disse resultater celler fra primitive endoderm, der vil give anledning til lunge progenitorceller viser afhængigheden af ​​mitogene signalering til selvfornyelse stedet differentiering [13]. Det er tidligere blevet vist, at Polycomb gruppe protein Bmi1 er en afgørende faktor for selvfornyelse i voksne stamceller /tumor stamceller gennem hæmning af INK4a /ARF locus kodning p16

INK4a /P19

ARF ([ ,,,0],14], revideret i [15]). Bmi1 har også for nylig blevet identificeret som en prognostisk markør for NSCLC [16], [17] og tilhører en gruppe af faktorer, der er blevet identificeret som en død-fra-cancer signatur i humane maligniteter [18].

i denne undersøgelse, vi satte os for at evaluere Bmi1 funktion i RAF induceret adenom formation. På grund af den begrænsede levetid Bmi1 gen ablateret mus [19] tog vi fordel af højere forekomst og kortere ventetid for BXB11 grundlægger linje at undersøge Bmi1 afhængighed af adenom vækst i fremskreden sygdom.

Bmi1 ablation via krydser Bmi1 – /- baggrund i BXB23 og BXB11 grundlægger linje afslørede, at Bmi1 ikke er nødvendig for tumor initiering men for udvidelse af igangsatte celler

Materialer og metoder

Etik erklæring

.

Alle dyreforsøg blev godkendt af de bayerske myndigheder til dyreforsøg.

dyr

BXB23 og BXB11 mus blev rutinemæssigt avlet i C57BL /6 baggrund. Til generering af Bmi1 – /- BXB23 og Bmi1 – /- BXB11 mus SP-C C-RAF BXB mus blev krydset med Bmi1 +/- mus, der var blevet opformeret på en FVB /N baggrund. De resulterende Bmi1 heterozygote sammensatte mus blev tilbagekrydset med FVB /N /Bmi1 +/- mus til at generere Bmi1 – /-. SP-C C-RAF BXB sammensatte mus

Reagenser og antistoffer

Antistoffer anvendt til immunhistokemi /immunofluorescens: Pro SP-C polyklonalt kaninantistof (Chemicon International), CC10 gede polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), pan-cytokeratin kanin polyklonalt antistof (DAKO), Ki-67-monoklonalt museantistof (Novocastra), C-RAF muse-monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), Bmi1 monoklonalt muse-antistof (Upstate), p19

ARF kanin polyklonale antistof (Abcam), c-MYC kanin-polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), p16

INK4a kanin-polyklonalt antistof ( Santa Cruz Biotechnology), kanin monoklonalt phospho-p44 /p42 MAPK Thr 202 /Tyr204 (phospho-ERK) antistof (Cell Signaling).

mikroskopi

Fluorescens mikroskopi blev udført ved hjælp af et Openlab software ( Improvision, Coventry, UK) kontrolleret DMIRBE mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) med en 40 × Leica nedsænkning olie mål. Alle billeder blev taget til fange og gemt som Openlab LIF-filer. Billeder blev efterfølgende behandlet ved hjælp power point og Adobe Illustrator-software.

Histopatologi og Immunhistokemi /Immunfluorescensfarvning

Dyr blev ofret og lunger blev fastsat under 25 cm vandtryk med 4% PBS buffer formalin. Histologi blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede lunge eksemplar. 6 um-cut sektioner blev deparaffineret, rehydreret i graduerede alkoholer og hæmatoxylin-eosin (H GCTGGTGAAAAGGACCTCT; P19

ARF: GCGCTCTGGCTTTCGTGAAC; CGTGTCCAGGAAGCCTTCCC; p16

INK4a: CGTGAGGGCACTGCTGGAAG; ACCAGCGTGTCCAGGAAGCC; p15

INK4b: CCAGGAAGCCTTCCCGAGCT; GGGGGCAAGTGGAGACGGTG; Cbx7: CGGCCCATTGGTCAGGTCTG; GACCCTCGCCTTGTCATGGC.

Resultater

Udvikling af NSCLC i BXB23 og BXB11 mus

Lunge adenom dannelse blev sammenlignet mellem BXB23 og BXB11 RAF transgene grundlægger linjer. Som bedømt ud fra H 0,05) er vist. C) Kaplan-Meier plot for overlevelse BXB11 og BXB23 mus. P-værdi blev beregnet ved anvendelse Logrank test.

Bmi1 fremmer tumorvækst, men ikke tumor initiering i både BXB11 og BXB23 mus

Baseret på den iagttagelse, at Bmi1 udtrykkes i BXB11 induceret tumorer og den tidligere beskrevne rolle Bmi1 i tumor stamceller selvfornyelse [14], [22], [23] besluttede vi at yderligere at undersøge den rolle, Bmi1 for udviklingen af ​​C-RAF BXB adenomer (figur 2A). Vi genererede sammensatte mus der udtrykker SP-C C-RAF BXB transgen på Bmi1 knock out baggrund. Som den genomiske sletning af Bmi1 havde ingen effekt på lunge udvikling og struktur af den voksne lunge (figur S2) eventuelle ændringer i tumorvækst kan tilskrives Bmi1. Analysen af ​​Bmi1 – /- SP-C C-RAF BXB mus hæmmes af den korte levetid for disse mus, der er forårsaget af sletning af Bmi1 [24] og sjældent tilladt monitorering af tumor udvikling i mere end tre måneder.

A) paraffinindlejret lungesnit fra BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 lunger blev farvet for Bmi1 (grøn) og DAPI (blå). Punkterede hvide linjer afgrænse tumorer. Scale bar = 30 um. B) H & E farvning af lunge sektioner fra BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus i en alder af to uger og tre måneder viser reduceret tumor burdon i Bmi1 – /- BXB11 lunger. Scale bar = 200 um. C og D) Analyse af tumor forekomst og vækst inden lunger BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus. Data præsenteret som Box-og-Whiskers plots, for oplysninger om datapræsentation se figur legende i figur 1 (n≥4 dyr pr genotype og alder, for detaljer se eksperimentelle materialer). Bemærk at tumorincidensen øges med en faktor to sammenlignet med figur 1A) på grund af FVB /N genetisk baggrund indføres gennem parring med Bmi1 – /- mus. n.d. = Ikke bestemt fordi tumorer blev konfluente. p-værdier blev beregnet ved hjælp af t-test kun p-værdier angiver signifikans, er vist.

Vi har derfor først analyseret effekten af ​​Bmi1 ablation på lunge tumor initiering i BXB11 baggrund som levetid disse mus matchede den af ​​Bmi1 knock out mus. I modsætning til BXB23, viste BXB11 lunger ekstremt store områder af lungen besat af tumorvæv til tre måneder gamle. Tumorvækst blev kraftigt reduceret inden lungerne hos Bmi1 – /- BXB11 mus (figur 2B) på to måder, først var der en ca. to gange formindskelse af tumor numre mellem to uger og tre måneder (Figur 2C) og anden volumenet af overlevende tumorer faldt (figur 2D). Lignende data blev opnået for Bmi1 – /- BXB23 sammensatte mus (Figur S3). Selvom reduceret i størrelse tumorerne i Bmi1 – /- BXB11 lunger viste funktioner i SP-C C-RAFBXB inducerede adenomer som bedømt ved analyse af cellemorfologi og farvning med to tumormarkører (pan-cytokeratin og pro SP-C, figur S4) . Også nedlukning af transgen udtryk som en konsekvens af Bmi1 ablation kan udelukkes som årsag til reduceret vækst tumor siden Bmi1 – /- BXB11 tumorer farvet positivt med en C-RAF-antistof (figur S4). Konsekvent niveauet for nuklear phospho-ERK blev opretholdt i BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 fra to uger til tre måneder viser, at ophør af væksten er ikke forårsaget af en reduktion i signalering gennem mitogen kaskade (figur S5)

sammenfattende ablation af Bmi1 i BXB11 mus fører til stærkt reduceret tumorvækst. Det oprindelige antal tumorer i BXB11 versus Bmi1 – /- BXB11 dog ikke viser en signifikant reduktion i Bmi1 – /-. BXB11 lunger, hvilket indikerer, at specifikationen af ​​tumorfremkaldende celler ikke afhænger af Bmi1

Øget celledød og reduceret fraktion af celler i cyklus i Bmi1 – /- BXB11 dyr Salg

stærkt reduceret tumorvækst og tabet af tumorer over tid i begge stiftende linjer med ophævet Bmi1 udtryk er enten en konsekvens af en blokeret cellecyklusprogression eller øget celledød eller en kombination af begge. Bmi1 har tidligere været impliceret i at fremme tumorcelleoverlevelse og cellecyklusprogression i en vævskultur modelsystem [25], [26]. TUNEL-farvning viste en betydelig stigning i den apoptotiske celle-forhold i adenomer på tre måneder gamle Bmi1 – /- BXB11 mus (figur 3A og 3C). Dette indikerer, at apoptose er en sen begivenhed i Bmi1 – /- BXB11 adenomer. Næste vi undersøgte vækstrate. Vi udførte Ki-67 /pro SP-C co-farvning på lunger fremstillet af to uger og tre måneder gammel Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 dyr. Fraktionen af ​​celler i cyklus er stærkt reduceret ved Bmi1 ablation. Desuden så tydeligt fra BXB11 kontrol i en alder af tre måneder væksten af ​​disse tumorer er også faldet tyder enten en begrænset replikativ levetid for BXB11 transformerede AT2 celler eller andre niveauer af vækst-kontrol (figur 3B og 3D).

A) TUNEL farvning af paraffin indlejret lunge sektioner fra Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 mus. DNase I-behandlet lungesnit blev anvendt som positiv kontrol. Sektioner blev behandlet uden terminal deoxynucleotidyltransferase tjente som negativ kontrol. Punkterede hvide linjer afgrænse tumorer. Genotyper og aldre som angivet. Pile viser apoptotiske (grønne) celler. Scale bar = 30 um. B) Ki67 (rød) /pro SP-C (grøn) co- immunfluorescensfarvning af lunge sektioner fra BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus. Pile angiver cykling tumorceller. “*” Angiver farvning artefakt. Scale bar = 30 um. C) Kvantificering af TUNEL positive celler i lunge tumorer i to uger og tre måneder gammel BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus (n = 4 dyr pr genotype), for detaljer se materialer og metoder. Data præsenteret som Box-og-Whiskers plot for oplysninger om datapræsentation se figur legende i figur 1. D) Kvantificering af Ki-67 /pro SP-C dobbelt positive celler. Mindst fem tumorer fra fem forskellige dyr blev analyseret. p-værdier blev beregnet ved hjælp af t-test, er det kun p-værdier angiver signifikans vist.

Som konklusion både tumorcelleoverlevelse og celledeling påvirkes i BXB11 mus med Bmi1 sletning og kan redegøre for den observerede reducerede tumorvækst.

Bmi1 afhængig udtryk for p16

INK4a og P19

ARF

Bmi1 er impliceret i cdki regulering. Mest fremtrædende P16

INK4a, p19

ARF har vist sig at være negativt reguleret af Bmi1 [27]. Derfor ændrede p16

INK4a /P19

ARF ekspressionsniveauer kunne forklare den reducerede antallet af overlevende og cykling celler i Bmi1 – /- BXB11 tumorer. Vi analyserede først ekspression af mRNA-niveauer af p16

INK4a ved semikvantitativ RTPCR i lungerne på to uger gamle BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus (figur 4A). Expression niveauer af p16

INK4a blev markant forøget i Bmi1 – /- BXB11 lunger. Western blot-analyse af hele lunge lysater bekræftede dette resultat på proteinniveauet (Fig S6A).

A-D) Semi-kvantitativ realtids-PCR-analyse af totalt RNA fra hele lunger på to uger gamle mus, genotyper som angivet. BXB11 niveauer blev sat til én. Data er repræsentative for to uafhængige sæt af analyse. Data viser standardafvigelser fra tredobbelte værdier. p-værdier blev beregnet under anvendelse af Students t-test, er det kun p-værdier angiver signifikans vist. A) Kvantificering af p16

INK4a ekspressionsniveauer B) Kvantificering af p19

ARF RNA ekspressionsniveauer. C) Kvantificering af p15

INK4b ekspressionsniveauer. D) Kvantificering af Cbx7 ekspressionsniveauerne.

Næste vi analyserede mRNA ekspressionsniveauerne af p19

ARF. Som i tilfældet med p16

INK4a, p19

ARF og p15

INK4b ekspressionsniveauer blev opreguleret i lungerne hos Bmi1 – /- BXB11 sammenlignet med BXB11 (figur 4B og 4C). I modsætning til p16

INK4a, der ikke blev ændret mellem vildtype og BXB11 mus, fandt vi forhøjede niveauer af p19

ARF RNA-ekspression også i BXB11 lunger (data ikke vist). En anden epigenetisk regulator af INK4a locus, blev Cbx7 ikke signifikant ændret i udtryk på Bmi1 ablation i BXB11 mus (figur 4D). Immunofluorescens farvning af Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 lunger viste, at p19

ARF udtrykkes i lunge tumorer i dyr af begge genotyper. Forskelle i subnuclear fordeling af p19

ARF er imidlertid indlysende, når Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 tumorer sammenlignes. Mens ablation af Bmi1 er forbundet med en multi fokal farvning mønster af p19 nukleare

ARF i næsten alle tumorceller det meste begrænset til et enkelt locus i kernerne i tumorer i nærvær af Bmi1 (fig S7).

som konklusion finder vi reduceret spredning i sent stadium p19

ARF positive BXB11 tumorer, som kan fortolkes som en del af en ældning fænotype. En potentiel forklaring på denne milde effekt kan være c-myc udtryk, vi finder i BXB11 tumorceller (figur S6B) og det er for nylig blevet beskrevet at vende tilbage en sensescence fænotype i B-RAF transformerede melanomer [28]. I mangel af Bmi1 imidlertid ekspression af INK4a /ARF var mere udtalt, selv om c-myc ekspression blev opretholdt (figur S6B) sidste ende fører til ophør af proliferation. Således under disse betingelser en c-myc redning kan ikke længere fungere.

Ingen evidens for bronchio-alveolær-stamceller (BASCs) i lungetumorer uafhængig af Bmi1

Vi næste rettet bidrag Basc celler til SP-C C-RAF BXB tumordannelse. Til dette formål har vi udført pro SP-C /CC10 dobbelt farvning og analyseret BXB11 tumorer for tilstedeværelse af dobbelte positive celler. Til denne analyse billede blev indstillinger erhvervelse valgt som tillod identifikation af BASCs på BADJs. Som illustreret i figur 5, kunne ingen dobbelt positive celler observeres i tumorer.

paraffinindlejret lungesnit fra BXB11 mus blev farvet for pro SP-C (rød) og for CC10 (grøn) til påvisning af dobbelt positive bronchio alveolære stamceller (BASCs). Et repræsentativt BASC celle, der er placeret i en bronchio alveolær kanal motorvej (BADJ) er angivet med hvid pil. Scale bar = 30 um.

Sammenfattende disse data viser, at puljen af ​​Bmi1 uafhængige tumorceller, der formentlig repræsenterer tumorfremkaldende celler ikke repræsenterer BASCs.

Diskussion

i den aktuelle undersøgelse anvendte vi to transgene stiftende linjer med lunge målrettet ekspression af C-RAF BXB for afhængighed af adenom initiering og vækst på stamceller selvfornyelse faktor Bmi1. Vi viser, at BXB11 har en fire gange højere forekomst og kortere ventetid for adenomer tillader undersøgelse af fremskreden sygdom i fravær af Bmi1. Udtømning af Bmi1 i både BXB23 og BXB11 baggrund førte til en markant nedgang i tumorvækst sats og en stigning i celledød inden for adenomer. I modsætning kunne observeres nogen væsentlig reduktion i tumor initierende hændelser i begge grundlægger linjer, argumenterer for Bmi1 være en vigtig faktor for tumor ekspansion snarere derefter indvielse.

Baseret på den observation, at Bmi1 udtrykkes i C- RAF BXB indledt lungeadenomer og at Bmi1 er et mål for RAF signalering [19] besluttede vi at undersøge adenom dannelse i fravær af Bmi1. Ophævelsen af ​​Bmi1 ekspression i BXB23 og BXB11 baggrund gav ikke en signifikant reduktion i tumor initieringsbegivenheder som defineret ved antallet af tumorer, der blev dannet i de forskellige genetiske kombinationer af to uger. Analyse af lunge adenom celler i fravær eller nærvær af Bmi1 afslørede ikke forskelle på den morfologiske og ved cellemarkør ekspressionsniveau. Derfor fravær af Bmi1 påvirkede ikke processen med tumor initiering. Disse resultater er i overensstemmelse med en tidligere publiceret rapport, der viser Bmi1 uafhængig gliom initiering omend i mangel af INK4a [29]. Fraværet af Bmi1 påvirkede ikke identiteten af ​​de resulterende tumorceller med hensyn til morfologi og ekspression af et begrænset sæt af markører. Disse resultater indikerer også, at Bmi1 ikke er nødvendig for specifikation af en tumor initiering celle i lungen. Phospho-ERK-niveauer kan kompensere Bmi1 tab for kort sigt, men ikke langsigtede self fornyelse divisioner af igangsatte celler som vi observerede en markant vækst tumor i Bmi1 – /- BXB11 viser højere nuklear phospho-ERK efterfulgt af ophør af celledeling ved sene tidspunkter ( tre måneder), når nukleare fosfor-ERK stadig var til stede. I løbet af vores undersøgelser også vi ikke observere ændringer i lungerne morfologi i Bmi1 – /- mus indikerer, at Bmi1 er ikke en afgørende faktor for korrekt lunge udvikling. Vi fandt en stærk opregulering af p19

ARF, p16

INK4a og p15

INK4b i hele lunge RNA præparater af Bmi1 – /- dyr i forhold til vildtype kuld. Udtrykket af p19

ARF kan ikke udelukkende tilskrives lunge infiltrerende celler i det hæmatopoietiske system, da vi kan se udtalt p19

ARF udtryk i AT2 celler og celler foring bronkierne i Bmi1 – /- dyr (data ikke vist ). Indlysende, at ekspression af cdkis ikke forringe normal lunge cellefunktion. Dette fund er af interesse vedrørende off target effekter i mulige fremtidige terapeutiske strategier rettet mod Bmi1 i lungekræft

Cdkis kodet på INK4a locus er impliceret i hæmning af cellecyklusprogression og kontrol af celle overlevelse [30] -. [ ,,,0],32]. I tråd med dette ser vi reduceret tumor cellecyklus progression i Bmi1 – /- BXB11 tumorer og en stigning i celler undergår apoptose end med en vis forsinkelse. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater offentliggjort af Liu og kolleger [25] viser

in vitro

en specifik virkning af Bmi1 på tumorcelleoverlevelse.

Efter aftale med tidligere rapporter, der viser p19

ARF opregulering reaktion på onkogene hyperproliferative signaler [33] – [35], udtryk for p19

ARF var ikke begrænset til Bmi1 – /- baggrund, men kunne også observeres i mindre grad i BXB11 adenomer. Vi bemærkede, at p19

ARF lokaliseret til kun én til to forskellige nukleare foci indenfor BXB11 adenomer.