PLoS ONE: Mouse modeller af anæmi of Cancer

Abstrakt

Anæmi for kræft (AC) kan bidrage til kræft-relaterede træthed og forringe livskvaliteten. Forbedret forståelse af patogenesen af ​​AC kunne lette bedre behandling, men dyremodeller til at studere AC mangler. Vi karakteriseret fire syngene C57BL /6 mus kræftformer, der forårsager AC. Mus med to forskellige hastigt voksende metastatiske lungekræft udviklet de karakteristiske fund af anæmi af inflammation (AI), med dramatisk forskellige grader af anæmi. Mus med hastigt voksende metastatisk melanom også udviklet en svær anæmi med 14 dage, med hæmatologisk og inflammatoriske parametre ligner AI. Mus med en langsomt voksende peritoneal ovariecancer udviklet en jernmangelanæmi, sandsynligvis sekundær til kronisk svækket ernæring og blødning i bughulen. Af de fire modeller blev hepcidin mRNA-niveauer steg kun i mildere lungecancer model. I modsætning til i vores model af systemisk inflammation fremkaldt af varme-dræbt

Brucella abortus

, ablation af hepcidin i kræft i æggestokkene og de mildere lungekræft musemodeller påvirkede ikke sværhedsgraden af ​​anæmi. Hepcidin-uafhængige mekanismer spiller en vigtig rolle i disse murine modeller af AC

Henvisning:. Kim A, Rivera S, Shprung D, Limbrick D, Gabayan V, Nemeth E, et al. (2014) Mouse modeller af anæmi of Cancer. PLoS ONE 9 (3): e93283. doi: 10,1371 /journal.pone.0093283

Redaktør: Kostas Pantopoulos, Lady Davis Institute for Medical Research /McGill University, Canada

Modtaget: December 20, 2013; Accepteret: 28 Februar 2014; Udgivet: 28 Marts 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH Pulmonal Critical Care Institutional Training Grant T32 (HL072752) til AK, 09/2008 – 06/2011; og Roche Foundation for Anæmi Research til TG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. T.G. og E.N. er cofounders, aktionærer og officerer af Intrinsic LifeSciences, en virksomhed, der udvikler hepcidin diagnostik. E.N. og T.G. hold patenter vedrørende den terapeutiske anvendelse af hepcidin og dens regulatorer. Se nedenfor for de patenter ‘detaljer, herunder navne og numre: 1) Competitive forordning af hepcidin mRNA med opløselige og Cell-Associated Hemojuvelin (Ganz, Lin, Goldberg) US patent nr. 7.534.764, dato for udstedelse 19 maj 2009 2) Mini-hepcidin peptider og metoder ved at bruge deraf (Ganz, Nemeth, Preza, Ruchala) US patent nr. 8.435.941, dato for udstedelsen 7 maj 2013 3) Indtil: Erythroferrone og ERFE polypeptider og metoder til regulering Iron Metabolism (Ganz, Nemeth) PCT patentansøgning nr PCT /US2013 /67.771. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer

Introduktion

Anæmi er et bemærkelsesværdigt almindelig komplikation af kræft, der forekommer i . 30% af ubehandlede patienter [ ,,,0],1]. Forekomsten af ​​anæmi øges yderligere af cancerbehandling, herunder kemoterapi og strålebehandling. Anæmi for kræft (AC) korrelerer med dårlig WHO performance status og livskvalitet [2], [3]. Effektiv behandling af AC aftager subjektiv træthed hos cancerpatienter [4]. Ud over virkningerne på livskvalitet, kan tilstedeværelsen af ​​AC være en uafhængig negativ prognostisk faktor [5].

Ætiologien for AC er multifaktoriel og sandsynligvis varierer med oprindelsen af ​​den primære tumor, samt som kroniske karakter sygdomsprocessen. Vigtige medvirkende faktorer omfatter jernmangel sekundært til blødning eller ernæringsmæssige mangler [6], hæmolyse grund immune fænomener, aktivering af koagulation kaskader eller unormal tumor-associerede kar [7], nedsat erythropoiese sekundært til utilstrækkelig erythropoietin produktion eller deprimeret respons af erythroide marv til erythropoietin [8], og direkte invasion af marven ved tumorceller med forstyrrelser af den erythropoietisk miljø. En særlig vigtig bidragyder til AC er betændelse, som AC deler mange af kendetegnene ved anæmi af inflammation (AI). AI er en normocytær, normochromic anæmi med en forkortet erythrocyt levetid og deprimeret erythropoiese. AI er også kendetegnet ved en forstyrrelse af systemisk jern homeostase kendetegnet ved hypoferremia med intakte jerndepoter [9] og mindsket tilgængelighed af jern til erythrocyt produktion.

hepcidin, en 25-aminosyre peptidhormon, der primært produceres af hepatocytter [ ,,,0],10], er den primære regulator af jern homeostase i sundhed og under inflammation [11]. Hepcidin handlinger ved at binde til ferroportin, den eneste kendte cellulære jern eksportør, der vises på overfladen af ​​celler, der leverer jern til plasma: makrofager, hepatocytter og enterocytter. Hepcidin binding til ferroportin fører til ferroportin endocytose og nedbrydning [12], at begrænse strømmen af ​​jern i plasma og dermed reducere jern tilgængelighed for erythropoiese. Under inflammation, er hepcidin ekspression kraftigt induceret, i vid udstrækning af IL-6 [13] via JAK-STAT pathway [14] – [16], og denne hepcidin overskud menes at bidrage til udviklingen af ​​AI. Interessant, har IL-6 blevet noteret for at blive forøget i flere tumortyper, herunder lungecancer [17] og ovariecancer [18]. I hvilket omfang øget hepcidin produktion bidrager til AC ikke er blevet direkte undersøgt ved genetisk ablation af hepcidin, delvist på grund af mangel på musemodeller for AC.

Trods den høje forekomst af AC med dens negative virkninger på kvaliteten af liv og overlevelse, har nogle dyremodeller blevet udviklet til sin undersøgelse. Vi har karakteriseret fire syngene C567BL /6 musemodeller af kræft: to hastigt voksende modeller af lungekræft, en hastigt voksende model af modermærkekræft, og en langsomt voksende model af kræft i æggestokkene. Efter en omfattende undersøgelse af hæmatologiske, jern, og inflammatoriske parametre af disse modeller, undersøgte vi omfanget af hepcidin involvering i udviklingen af ​​AC i to af disse modeller ved at sammenligne C57BL /6-mus til hepcidin knockout-mus på samme stamme baggrunden.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alt dyr arbejde og pleje blev udført i henhold til retningslinjerne fra University of California, Los Angeles (UCLA) kansler Forskningsudvalget Animal (ARC) . Specifik godkendelse musen forsøgene blev opnået med protokollen # 2008-129-12 titlen “rolle IL-6 og hepcidin i anæmi af kræft.” Blev gjort alle rimelige bestræbelser på at forbedre lidelse, herunder anæstesi for smertefulde procedurer.

Animal modeller af anæmi af kræft

Alle dyreforsøg blev godkendt af Udvalget for Animal Research ved University of California, Los Angeles (UCLA). 6 uger gamle C57BL /6J-mus blev opnået fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA) eller The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). For de tre hurtigtvoksende kræftmodeller, han og hun vildtype (WT) mus blev anbragt på en jern-tilstrækkelig kost (20 ppm jern, Harlan Teklad, Indianapolis, IN) i 2 uger før injektion af tumorceller eller saltvand. Den samme kost blev anvendt gennem resten af ​​eksperimentet. Denne kosten conditioning blev anvendt, da det høje jernindhold af standard chow (ca. 7-8 gange det daglige behov) dramatisk øger hepcidin ekspression og gør den ikke reagerer på inflammatoriske stimuli [19]. Derudover kosten jern absorption i mus udgør så meget som 50% af de daglige jern fluxe i mus fodret standard chow, men kun ~5-10% hos mennesker [20]. Denne øgede kosten jern absorption i mus kan formindske det relative bidrag af jern genbrug af makrofager [21] og fører til progressiv jern belastning. Således blev reduktionen af ​​kosten jernindhold i musefoder designet til at modellere jern fluxe af human homeostase. For langsomt voksende model af kræft i æggestokkene, blev hunmus opretholdt på en jern-tilstrækkelig kost enten 20 ppm jern eller 50 ppm jern.

For at generere en metastatisk lungekræft model blev dyr injiceret intraperitonealt (IP ) med 0,1 × 10

6-0,5 × 10

6 murine TC-1 eller Lewis lungekræft (LLC) celler (ATCC, Manassas, VA). Fordi disse er metastatiske tumorceller, og vi undersøger det systemiske respons på disse kræftformer, vi har valgt at udføre intraperitoneale injektioner i stedet inkubere tumorcellerne i deres primære organ. De LLC-celler blev dyrket som adhærente celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin G-streptomycin, og TC-1-celler var dyrkes som adhærente celler i RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin G-streptomycin. På dagen for behandling blev tumorceller resuspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS), talt med en hematocytometer og injiceret i et volumen på 500 pi PBS. Kontrolmus blev injiceret IP med 500 pi PBS. Mus blev aflivet på 13-15 dage, og blod, lever og milt blev opsamlet ved obduktion.

I musemodellen af ​​metastatisk melanom blev dyr injiceret IP med 0,1 × 10

6-0,3 × 10

6 B16-F10-celler (ATCC, Manassas, VA). B16-F10-celler blev dyrket som adhærente celler i DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin G-streptomycin. På dagen for behandling blev tumorceller resuspenderet i PBS, talt med en hematocytometer og injiceret i et volumen på 500 pi PBS. Kontrolmus blev injiceret IP med 500 pi PBS. Mus blev aflivet efter 14 dage, og blod og lever blev opsamlet ved obduktion.

I peritonealt dissemineret ovariecancer blev dyrene injiceret IP med 1 × 10

6 ID8 celler, som var generøst leveret af Dr. Oliver Dorigo. Den metastatiske ID8 cellelinje blev afledt fra spontane malign transformation af C57BL /6 mus æggestokkene overflade epitel celler

in vitro

[22]. Cellerne blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin G-streptomycin. På dagen for behandling blev tumorceller resuspenderet i PBS, talt med en hematocytometer og injiceret i et volumen på 500 pi PBS. Kontrolmus blev injiceret IP med 500 pi PBS. Mus blev aflivet på 18,5 uger.

For at undersøge betydningen af ​​hepcidin i anæmi af kræft, brugte vi mandlige og kvindelige hepcidin-1 knockout (HKO) mus i TC-1 model, og kvindelige HKO mus i den ID8 model. HKO mus blev oprindeligt billede til vores laboratorium af Dr. Sophie Vaulont [23] og blev tilbagekrydset på C57BL /6 baggrund som tidligere beskrevet [24]. Til denne del af undersøgelsen, HKO mus undergik kosten conditioning for at forhindre udviklingen af ​​jernophobning og opretholde jernniveauer sammenlignes med WT-mus. Ved fravænning blev HKO mus startede reduceret jern diæter (4 ppm eller 20 ppm) og omkring 2 uger for at forhindre den massive jern lastning karakteristisk for denne knockout mus. Fra tidspunktet for injektion blev musene holdt på en 20 ppm jern kost for resten af ​​undersøgelsen. På TC-1 model blev HKO mus injiceret og aflives som beskrevet ovenfor for WT mus. For ID8 model blev HKO mus aflivet på 16,5 uger.

Måling af jern parametre og erythropoietin

Serum jern og lever ikke-hæm jern koncentrationer blev målt ved en kolorimetrisk assay for jern (Sekisui Diagnostics, Lexington, MA) som tidligere beskrevet [20]

Hæmatologiske undersøgelser

Komplet blodtal blev opnået med en HemaVet blod analysator (Drew Scientific;. Waterbury, CT). For at vurdere jern-begrænsede erythropoiese blev zink protoporphyrin (ZPP) målt under anvendelse af et hematofluorometer (AVIV, Lakewood, NJ). Reticulocytter blev talt ved flowcytometri. Blod (5 pi) blev tilsat til 1 ml af thiazol orange i PBS med 0,1% natriumazid (PBS-azid, BD Bioscience, San Jose, CA) og inkuberet ved stuetemperatur i 1-3 timer. Som en ufarvet kontrol blev blod tilsat til PBS-azid uden thiazol orange. Procentdelen af ​​røde-fluorescerende reticulocytter (Retic%), blev målt ved flowcytometri på UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) og Center for AIDS Research flowcytometri Core Facility, der understøttes af National Institutes of Health Awards CA-16042 og AI -28.697, og af JCCC, UCLA aIDS Institute, og David Geffen School of Medicine på UCLA. Ufarvede kontroller blev anvendt til at etablere en port til at udelukke baggrundsfluorescens. Resultaterne er udtrykt som reticulocyt produkt indeks:. RPI = Retic% × Hgb /baseline Hgb

RNA isolering og real-time kvantitativ PCR

Total RNA blev isoleret fra leveren og analyseret af real -tid RT-PCR som beskrevet tidligere [25].

Murin β-actin blev anvendt som en husholdning mRNA kontrol. Primere er listet i tabel S1

Histocytopathology

Perifere blodudstrygninger blev udført ved anvendelse af 10 pi helblod på tidspunktet for obduktion og parat med Wright-Giemsa farve. (Fisher, Hampton, NH) .

Statistik

SigmaStat blev brugt til alle statistiske analyser (Systat Software; punkt Richmond, CA). For melanom, lungekræft, og hepcidin KO-modeller, blev normalfordelte data sammenlignet hjælp Student

t

-test. Målinger, der ikke var normalfordelte blev sammenlignet ved den ikke-parametriske Mann-Whitney rank sum test. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. ID8 vildtype mus data blev oprindeligt analyseret ved hjælp af to Way ANOVA, med ID8 /saltvand injektion og kost jern som de to variabler, der påvirker resultatet. Denne statistiske analyse viste ingen signifikant interaktion effekt mellem de to variabler. Den ID8 vildtype data præsenteres efter Student

t

-test for parametriske data og Mann-Whitney rank sum test for parametriske data. Sammenligningstabeller målinger blev opnået ved Pearson Correlation.

Både han- og hun WT og HKO mus blev anvendt for de tre hurtigtvoksende cancer musemodeller. Analyse af de vigtigste hæmatologiske parametre, herunder hæmoglobin og serum jern, viste, at der var ingen signifikant forskel mellem han- og hunmus. Således præsenterer vi kombineret mandlige og kvindelige data.

Resultater

Mus med metastatisk lungekræft udvikler anæmi med reticulocytose og jern begrænsning

Vi genererede to modeller af metastatisk lungekræft ved at injicere syngene cancercellelinjer, TC-1 og LLC, ind i peritonea af mus. Kontrolmus modtog PBS. Før eutanasi på 14 d efter injektion, alle tumor mus viste tegn i overensstemmelse med systemisk sygdom sekundært til tumor belastning, herunder sløvhed, dårlig grooming, og ascites. Obduktion afslørede intraperitoneal masser i de fleste af musene. Hæmoglobin var lavere i tumoren mus sammenlignet med kontroller (figur 1A). (LLC 7,8 g /dl vs. PBS 15,6 g /dl, P 0,001; TC-1 14,2 g /dl vs. PBS 15,6 g /dl, P = 0,029). De anæmiske tumor mus var steget reticulocytose sammenlignet med kontrollerne (Fig 1B.) (RPI i LLC 10.7 vs. PBS 2.4, P 0,001; TC-1 6,1 vs. PBS 2.4, P 0,001). Notatet de LLC mus havde lavere hæmoglobinniveau end TC-1 mus (P 0,001). Og større reticulocytose (P = 0,006)

C57BL /6 mus blev injiceret intraperitonealt med 0,1 × 10

6 -0.5 × 10

6 murine TC-1 eller Lewis lungecarcinom (LLC) -celler og eutaniseret efter 14 dage. Sammenlignet med kontroller, de tumorbærende mus har: (A) nedsat hæmoglobin; (B) steg reticulocytose. N = 8-19 mus per behandling og kontrolgruppen. * P 0,05, ** P 0,001; P af Mann-Whitney rank sum test. Barer og fejl barer er median ± 75

th /25

percentil.

Når utilstrækkelig jern er til rådighed for erythropoiese, forhøjede niveauer af zink er indarbejdet i protoporfhyrinerne ringen. Derfor, zink-protoporphyrin (ZPP) niveauer er en god indikator for jern-begrænsede erythropoiese [26]. ZPP niveauer i tumor-bærende mus blev øget i forhold til kontroller, hvilket indikerer jern-begrænset røde blodlegemer (figur 2A.) (LLC 160 vs. PBS 84, P 0,001; TC-1 136 vs. PBS 84, P 0,001). LLC-mus havde en tendens til højere ZPP niveauer end de mindre anæmiske TC-1-mus (P = 0,129). Tumorbærende mus havde hypoferremia som angivet ved et serum jern assay (Fig 2B.) (LLC 11,5 pmol /l vs. PBS 39,8 pmol /L, P = 0,004; TC-1 20,8 pmol /l vs. PBS 39,8 pmol /L , P = 0,031). For at afgøre, om dette skyldtes jern binding, som ville ses i anæmi af inflammation, snarere end jernmangelanæmi sekundært til fejlernæring eller blødning, blev de samlede krop jerndepoter estimeres ved hjælp af lever og milt væv jern målinger. Begge lunge tumormodeller havde højere liver nonheme jernindhold end kontroller (figur 2C). (LLC 8,9 pmol Fe /g vs. PBS 1,5 pmol Fe /g, P 0,001; TC-1 3.9 pmol Fe /g vs. PBS 1,5 pmol Fe /g, P = 0,002). LLC mus havde også højere milt nonheme jernindhold end kontroller, og TC-1 mus havde sammenlignelig milt jernindhold (fig. 2D) (LLC 15,9 pmol Fe /g vs PBS 10,4 pmol Fe /g, P = 0,039).

C57BL /6-mus blev injiceret intraperitonealt med TC-1 eller LLC-celler og aflivet efter 14 dage. Begge tumor-bærende mus modeller viser: (A) forhøjede ZPP niveau sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer jern-begrænset hæm syntese; (B) hypoferremia; (C) steg leveren jern. (D) De LLC-bærende mus har forøget milt jern, og TC-1-bærende mus har en tendens til øget milt jern, TC-1 vs PBS, P = 0,381. N = 8-19 mus per behandling og kontrolgruppen. * P 0,05, ** P 0,001; P af Mann-Whitney rank sum test. Barer og fejl barer er median ± 75

th /25

percentil.

Mus med metastatisk lungekræft åbenbart betændelse, men hepcidin øges kun i mindre alvorlige model

for at vurdere bidraget af inflammation og hepcidin aktivitet til udviklingen af ​​anæmi i vore kræftmodeller målte vi de hepatiske mRNA koncentrationer af SAA-1 og hepcidin. SAA-1 er en hepatisk akut fase reaktant, der er kendt for at blive forøget som respons på inflammation og visse cytokiner, især IL-6 [27]. Som IL-6 menes at være en vigtig årsag til anæmi af inflammation ved at inducere hepcidin ekspression [19], anvendte vi SAA-1 målinger som indikator for IL-6-aktivitet. På dag 14 havde både TC-1 og LLC-mus forhøjede leverenzymer SAA-1-mRNA-niveauer sammenlignet med kontroller (Fig. 3A). LLC-mus havde en 75-fold forøgelse i forhold til PBS-mus (P = 0,001), og TC-1 mus havde a 340 gange forøgelse (P = 0,002). På dag 14 havde den mildt anæmiske TC-1-mus mildt forhøjede hepcidin mRNA-niveauer sammenlignet med kontroller ( 2 ×, P = 0,012) (figur 3B), medens de mere alvorligt anæmisk LLC mus havde lavere hepcidin niveauer (P = 0,022), måske på grund af counterregulatory virkning på hepcidin af moderat anæmi, og de resulterende erytropoietiske stimulus [28]. For at vurdere indflydelsen af ​​inflammation på hepcidin mRNA-ekspression, vi evaluerede korrelationen mellem niveauerne af SAA-1-mRNA og tilsvarende hepcidin mRNA-niveauer i individuelle mus, men korrelationen var svag [data ikke vist]. Trods meget højere SAA-1-niveauer i tumor-bærende mus end i kontrol, tegn på tumor-induceret inflammation, blev hepcidin mRNA-koncentrationer ikke steget proportionalt i TC-1-bærende mus og blev endog faldet i LLC-bærende mus. Disse data tyder på, at andre faktorer kan modvirke effekten af ​​inflammation på hepcidin syntese, og disse kunne omfatte anæmi og øget erythropoiese.

Efter dag 14 (A) begge tumormodeller har øget niveauer af lever SAA-1 mRNA ; (B) TC-1-bærende mus har øget lever hepcidin mRNA-niveauer i forhold til kontroller, og LLC-bærende mus er faldet hepcidin. N = 8-19 mus per behandling og kontrolgruppen. * P 0,05; P af Mann-Whitney rank sum test. Barer og fejl barer er median ± 75

th /25

percentil.

hepcidin mRNA niveauer blev også målt i tumorerne at afgøre, om tumor hepcidin udtryk kan bidrage til udviklingen af anæmi af cancer. Hverken TC-1 eller LLC tumorer havde påviselig hepcidin udtryk, illustrerer, at disse tumorer ikke direkte bidrager til systemiske hepcidin niveauer.

Mus med melanom udvikle anæmi med jern-begrænset erythropoiese og inflammation

Vi næste genererede en musemodel af metastatisk melanom ved at indsprøjte en melanom-cellelinie, B16-F10, i peritonea af mus. Kontrolmus modtog PBS. Før eutanasi 14 d efter injektion, tumor mus viste tegn i overensstemmelse med systemisk sygdom og tumor byrde, herunder sløvhed og ascites. Komplet blodtælling analyse afslørede en markant anæmi i melanom-mus sammenlignet med kontroller (figur 4A.) (B16-F10 Hgb 8,2 g /dl vs. PBS Hgb 15.6 g /dl, P 0,001). Tumoren mus udviklede også en robust reticulocytose 4 ×, at deres kontrol modstykker (figur 4B.). Melanom-mus viste signifikant jern-begrænsede erythropoiese med a . 2-fold stigning i ZPP niveauer sammenlignet med kontroller (. Fig 4C)

C57BL /6-mus blev injiceret intraperitonealt med 0,1 x 10

6 -0.3 × 10

6 B16-F10-celler, og aflivet efter 14 dage. De melanom-bærende mus udvikler: (A) en signifikant anæmi; (B) steg reticulocytose sammenlignet med kontroller; (C) forhøjet zink protoporphyrin (ZPP) niveauer sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer jern-begrænset hæm syntese; (D) forøgede niveauer af lever-SAA-1-mRNA, en markør for inflammation og IL-6-aktivitet; (E) lavere niveauer af hepcidin mRNA. N = 8-11 mus per behandling og kontrolgruppen. * P 0,05, ** P 0,001; P af Mann-Whitney rank sum test. Barer og fejl barer er median ± 75

th /25

percentil

På dag 14, de melanom mus havde en dramatisk stigning ( 600 gange). I SAA- 1 mRNA sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer robust inflammation (fig. 4D). Hepcidin mRNA niveauer blev undertrykt i tumoren mus sammenlignet med kontroller (Fig. 4E). Fordi denne tumor fremkaldte en anæmi med meget tilsvarende karakteristika som der er forårsaget af metastatisk LLC lungekræft, blev dens virkning på jern homeostase ikke karakteriseret yderligere.

Mus med kræft i æggestokkene udvikle jernmangelanæmi

vi analyserede også udviklingen af ​​anæmi hos mus med et langsomt voksende ovariecancer ved injektion af syngene ovariecancer cellelinie ID8 i peritonea af mus. De ID8-injicerede og PBS-injicerede kontrol musene aflivet 18,5 uger efter injektionen. På dette tidspunkt, alle tumorbærende mus viste tegn i overensstemmelse med systemisk sygdom, herunder sløvhed, dårlig grooming, og ascites. Obduktion afslørede synlige intraperitoneale masserne i størstedelen af ​​musene med blodige ascites i mange. Hæmoglobin var lavere i tumorbærende mus sammenlignet med kontroller (Fig. 5A) (ID8 10,4 g /dl vs. PBS 11,25 g /dl, P = 0,040). PBS mus selv havde moderat nedsat hæmoglobin, sandsynligvis som følge af at have været fodret med en reduceret jern kost i 18 uger. De tumorbærende mus havde forhøjede ZPP niveauer sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer jern-begrænsede erythropoiese (fig. 5B) (ID8 162 vs. PBS 129, P = 0,008). Total krop jerndepoter blev evalueret ved hjælp af lever og milt væv jern målinger. De ID8-bærende mus havde lavere lever og milt jernindhold end kontroller (Fig 5C, D.) (ID8 liver jern 8,1 pmol Fe /g vs PBS lever jern 14,9 pmol Fe /g, P = 0,041; ID8 milt jern 63,1 pmol Fe /g vs. PBS milt jern 138,5 pmol Fe /g, P = 0,011). denne ovarietumor model udvikler således anæmi med frank jernmangel, sandsynligvis delvist sekundært til blødning i bughulen og nedsat ernæring.

C57BL /6-mus blev injiceret intraperitonealt med 1 x 10

6 ID8 celler og eutaniseret efter 18,5 uger. Sammenlignet med kontroller, ID8-bærende mus: (A) er mere anæmiske; (B) har forhøjede ZPP niveauer; (C, D) har lavere lever og milt jern niveauer. N = 10-16 mus per behandling og kontrolgruppen. * P 0,05, ** P 0,001; P af Mann-Whitney rank-sum test (A, B) eller studerende

t

-test (C, D). Barer og fejl barer er median ± median ± 75

th /25

percentil (A, B) eller middel ± SD (C, D).

Mus med kræft i æggestokkene har undertrykt hepcidin niveauer reagerer på lever jerndepoter

på 18,5 uger, havde ID8 mus deprimeret lever hepcidin mRNA-niveauer i forhold til kontroller (fig. 6A) (ID8 0,20 vs. PBS 14,08, P = 0,013), samt som tilsvarende SAA-1-niveauer til kontroller (fig. S1) (P = 0,361), hvilket indikerer, inflammation og hepcidin ikke spiller en stor rolle i udviklingen af ​​denne anæmi. Desuden regne 6B viser en signifikant positiv sammenhæng mellem hepcidin og lever jern niveauer, hvilket indikerer passende hepcidin undertrykkelse med udviklingen af ​​jernmangelanæmi i denne æggestokkene tumor model (ID8 hepcidin vs. lever jern, R

2 = 0,64 ., P = 0,017)

på 18,5 uger, ID8-bærende mus sammenlignet med kontroller har (A) undertrykt hepcidin mRNA; (B) signifikant positiv korrelation mellem lever jerndepoter og hepcidin mRNA-ekspression. N = 11-16 mus per behandling og kontrolgruppen. * P 0,05; P Mann-Whitney rank sum test i (A), og af Pearson Correlation i (B). Barer og fejl barer er median ± 75

th /25

percentil.

Udviklingen af ​​anæmi i mus tumormodeller er ikke sekundær til mikroangiopatisk hæmolyse

listen over potentielle årsager til anæmi hos cancerpatienter modeller indbefatter mikroangiopatisk hæmolyse eller forskydning af erythrocytter, hvilket også kan ses i inflammatoriske anæmier [6]. De perifere blodudstrygninger af tumorbærende mus viste ingen schistocytes eller erythrocyt-fragmenter. Figur 7B viser en næsten normal blodudstrygninger af TC-1 model, med minimal membran uregelmæssigheder. Figur 7C og 7D viser, at mere anæmiske LLC og ID8 modeller har mere alvorlige erythrocyt abnormiteter, herunder dråbeformet celler og central bleghed, men igen uden et betydeligt antal schistocytes, der indikerer et bidrag på mikroangiopatisk hæmolyse til anæmi. [29]

(A) PBS-kontrol (B) TC-1 (C) LLC (D) ID8.

Anæmi er ikke svækket i hepcidin-poleres TC-1- eller ID8-bærende mus

for at teste, om hepcidin bidrager til udviklingen af ​​anæmi hos tumorbærende mus injicerede vi to af tumorcellelinjer i hepcidin knockout-mus. På dag 14 efter TC-1 injektion, var der ingen signifikant forskel mellem hæmoglobin fald på henholdsvis vildtype og hepcidin knockout-mus (fig. 8A) (WT TC-1 -1,08 g /dl vs. HKO TC-1 -0,99 g /dl, P = 0,908). Selvom TC-1 mus havde mildt forhøjede niveauer af hepcidin, hepcidin er tydeligvis ikke afgørende for udviklingen af ​​denne anæmi. Taget sammen med stigningen i SAA-1 niveauer, disse data peger på en hepcidin-uafhængig inflammatorisk mekanisme for anæmi.

(A) Ved dag 14, er der ingen signifikant forskel mellem hæmoglobin ændringer i TC-1 -fyldt vildtype og hepcidin knockout-mus (P = 0,908). (B) absolutte hæmoglobinniveauer af mus vist i A. (C) med 18,5 uger, er der ingen signifikant forskel mellem hæmoglobin ændringer i ID8-bærende vildtype og hepcidin knockout-mus (P = 0,739). (D) absolutte hæmoglobinniveauer af mus vist i C. N = 4-19 mus pr behandling og kontrolgruppen. P af t-test. Barer og fejllinjer er gennemsnit ± SD.

For at undersøge, om hepcidin udtryk er nødvendig for udviklingen af ​​jernmangel i en mere kronisk model, vi sammenlignet udviklingen af ​​anæmi i WT og hepcidin knockout-mus, der bærer ID8 æggestokkræft. Ved 18,5 uger, var der ingen signifikant forskel mellem hæmoglobin fald på henholdsvis vildtype og hepcidin knockout mus behandlet med ID8 (fig. 8C) (WT ID8 -5,26 g /dl vs. HKO ID8 -4,50 g /dl, P = 0,739 ). Disse data bekræfter vores resultater, at ID8-bærende mus udvikler anæmi som reaktion på blødning og ernæringsmæssige jernmangel, snarere end en hepcidin-medieret inflammatorisk mekanisme.

Discussion

Anæmi af cancer (AC) er en ofte overset, men vigtig manifestation af en malignitet. Selv mild anæmi har vist sig at påvirke patient-rapporteret livskvalitet (QOL) parametre [30]. Selv om en nedsat hæmoglobin er kun én faktor i udviklingen af ​​deprimerede QOL målinger i kræftpatienter, har forbedringen af ​​anæmi vist sig at have en betydelig og direkte sammenhæng med den samlede livskvalitet [31]. Forbedringen i QOL med anæmi behandling varede uanset delvis eller fuldstændig respons på enhver kemoterapi. Derudover AC har vist sig at være en uafhængig negativ prognostisk faktor for overlevelsestiden for kræftpatienter [32].

På trods af de negative virkninger af AC, er det utilstrækkeligt anerkendt og underbehandlet af læger [33] , delvis på grund af manglen af ​​sikre og effektive terapier. Blandt potentielle behandlinger, er røde blodlegemer transfusioner forbundet med immunosuppressive virkninger, infektion transmission og transfusion reaktioner [34]. Erytropoiese-stimulerende midler, såsom rekombinant humant erythropoietin, har været forbundet med højere dødelighed hos patienter med hoved- og halscancer, brystcancer og ikke-småcellet lungekræft [35]. Prækliniske modeller skal fremme udviklingen af ​​mere sikre og mere effektive behandlinger.

I den sparsomme litteratur om rolle hepcidin i AC, der er nogle beviser for, at betændelse og øget hepcidin koncentrationer kunne bidrage til AC. Butterfield et al. viste, at serum hepcidin niveauer markant var forhøjet i humane patienter med hæmatologiske eller nonhematologic kræftformer, herunder melanom og lungekræft [36]. En anden undersøgelse af anæmiske kræftpatienter ved Ukarma et al. [37] påvist et omvendt forhold mellem hepcidin niveauer og en hæmoglobin respons på epoetin terapi. Dette forhold mellem epoetin modstand og øget hepcidin indikerer en potentiel rolle hepcidin i mekanismen for AC udvikling. Sasu et al. yderligere stratificeret anæmiske kræftpatienter i dem med inflammatoriske, blandede, og jern-mangel anæmier, hjælp hæmatologiske parametre og C-reaktivt protein [38]. Denne lagdeling viste, at de betændte patienter havde de højeste niveauer af serum hepcidin, efterfulgt af patienter med blandet anæmi. Der var også en direkte korrelation mellem de inflammatoriske markører (ferritin og CRP) og hepcidin I AC patienter, hvilket antyder en rolle inflammationsinduceret hepcidin stigning i patogenesen af ​​AC i en undergruppe af cancerpatienter med fremtrædende inflammation.

Vi har for nylig offentliggjort en detaljeret karakterisering af en musemodel, der bidrog til at definere bidrag hepcidin i anæmi af inflammation (AI) [39].