PLoS ONE: Den stamcellemarkør CD133 Associates med Enhanced Colony Dannelse og Cell motilitet i kolorektal cancer

Abstrakt

CD133 er en membran molekyle, der har været, kontroversielt, rapporteret som en CSC markør i kolorektal cancer (CRC). I denne undersøgelse, vi søgte at afklare udtryk og rolle CD133 i CRC. Oprindeligt størrelsen af ​​CD133-udtrykkende (CD133 +) population i otte velbeskrevne CRC cellelinjer blev målt ved flowcytometri og viste sig at ligge i området fra 0% til 95%. Cellelinien HT29 har en CD133 + population af 95% og blev udvalgt til funktionel evaluering af CD133 efter gen knockdown af RNA-interferens. En tidsforløb assay viste, at CD133 inhibering havde ingen signifikant virkning på celleproliferation eller apoptose. Men CD133 knockdown resultere i større modtagelighed for staurosporin-induceret apoptose (p = 0,01) og reduktion i cellemotilitet (p 0,04). Da gen knockdown kan forårsage “off-target” virkninger, blev cellelinien SW480 (som har en CD133 + befolkning på 40%) sorteret i rene CD133 + og CD133- befolkninger til at tillade funktionel sammenligning af isogene befolkninger kun adskilt af CD133-ekspression. I overensstemmelse med de i Knockdown eksperimenter, et tidsforløb assay viste ingen signifikante proliferative forskelle mellem CD133 + /CD133- befolkninger. Også større modstand mod staurosporin-induceret apoptose (p = 0,008), større cellemotilitet (p = 0,03) og større kolonidannende effektivitet blev set i CD133 + -populationen end CD133- befolkning i både 2D og 3D kultur (p 0,0001 og p Accepteret: April 27, 2010; Udgivet: May 19, 2010

Copyright: © 2010 Elsaba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af University of Nottingham og CR-UK. Tarek Elsaba er en modtager af et ph.d.-stipendium, der er leveret af den egyptiske regering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de seneste år har set fremkomsten af ​​”kræft stamcelle hypotese”, som postulerer, at et mindretal population af celler i en tumor består af cancer stamceller (CSC) [1], [2]. Denne population er angiveligt ansvarlig for generering størstedelen af ​​tumoren, der består af celler i forskellige grader af differentiering. Hierarkiet af en tumor er således tænkt at være magen til det væv, hvorfra de tumor stammer og CSCS anses neoplastiske modstykker til stamceller i det normale væv. I denne forbindelse ville forventes CSCS at have en stamcelle-lignende fænotype (generelt omtalt som “stemness”). Dette er karakteriseret ved funktioner såsom ubegrænsede replikativ evne, multipotency og modstandsdygtighed over for apoptose [3]. Den stamcelle-fænotype kan også omfatte cyto-beskyttende strategier såsom evnen til aktivt at ekstrudere farlige stoffer fra celle-en funktion, som kan være grundlaget for resistens over for kemoterapeutiske stoffer [3], [4].

I parallelt med fremkomsten af ​​kræft stamceller hypotese, har der været en stigende interesse i isolation og studiet af CSCS. En række undersøgelser hævder at have isolerede CSCS fra flere forskellige tumortyper, såsom hjernen [5], [6], bryst [7], colon [8], [9], hepatocellulært carcinom [10] og pancreascancer [11] . Disse undersøgelser har anvendt formodede CSC markører til at adskille stamceller fra differentierende celler i en tumor. En almindelig metode til adskillelse er farvestoffet eliminationsmetode (dvs. side population [12]), selv om identifikation af en række celleoverflademarkører (såsom CD24, CD44, CD166, og integriner) har tilladt anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) at isolere CSCS [13]. En markør konsekvent rapporteret som en stamcelle markør i tumorer af forskellig oprindelse er CD133 (også kendt som Prominin 1).

CD133-genet (

PROM1

) kort til kromosom 4p15 og koder en 120 kD transmembrant glycoprotein (ENSG00000007062). Den CD133 protein er pentaspan celleoverfladereceptor selv om hverken dens ligand eller dens sekundære budbringere er kendt. Det blev først anerkendt som en overflade markør for hæmatopoietiske stamceller [14], [15]. Senere blev det brugt til at genkende cancer stamceller i mange faste tumorer, der opstår i for eksempel bryst- [13], pancreas [16] og lever [17].

To nylige studier identificeret CD133 som markør for stamceller i kolorektale cancere (CRC) [8], [9]. I disse undersøgelser CD133 ekspression (CD133 +) celler blev isoleret fra primære CRCs og viste sig at have evnen til at danne tumorer som xenografter i nøgne mus; i modsætning CD133- celler fra de samme tumorer viste sig at have meget begrænset evne til at danne xenotransplantater og selv, blev tilskrevet forurening med CD133 + celler. Analyse af xenotransplantater, der blev dannet, viste, at størrelsen af ​​CD133 + populationen var magen til den, der ses i den primære tumor, og desuden blev evnen til kontinuerligt udbrede xenotransplantater stramt forbundet med CD133 ekspression. Efterfølgende undersøgelser har imidlertid ikke valideret disse observationer [18] og i en undersøgelse er det blevet rapporteret, at i virkeligheden, den CD133- befolkning har større kolonidannende evne [19]. Vores undersøgelse forsøgt at præcisere udtrykket og den rolle, CD133 i CRC. blev anvendt to fremgangsmåder: (i) CD133 ekspression blev funktionelt evalueret i HT29 efter gen knockdown og (ii) SW480 undergik cellesortering til en CD133 + befolkning og et CD133- population efterfulgt af sammenlignende funktionel analyse af de to populationer

Materialer og Metoder

Tissue kultur, flowcytometri og fluorescens cellesortering

Otte humane kolorektale cancer cellelinjer (Caco2, DLD1, HT29, Lovo, LS1034, SW480, SW620, SW837) var opretholdt som tidligere beskrevet [20]. Identitet af alle cellelinjer blev bekræftet af fingeraftryk for mutationer i

KRAS, BRAF, PI3KCA, CDC4, TP53

og afprøvning mikrosatellit ustabilitet.

Evaluering af størrelsen af ​​CD133 udtrykke (CD133 +) befolkning i hver cellelinie blev foretaget ved flowcytometri under anvendelse af et phycoerythrin (PE) mærket antistof – CD133 /1 (klon AC133 /1, Miltenyi Biotec, UK). Celler blev frigjort under anvendelse af ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning (Sigma) og ca. 5 × 10

5-celler blev inkuberet med antistof (fortyndet 1:100 i FACS vask (0,5% bovint serumalbumin, 2 mM NaN

3; 5 mM EDTA)) i 15 minutter ved 4 ° C. En isotype og koncentration matchet PE-mærket kontrol antistof (Miltenyi Biotec, UK) blev anvendt, og prøver mærket med dette antistof blev anvendt til at indstille gating niveauer. Efter tre 5 minutters vaske med FACS vask blev cellerne resuspenderet og fikseret i opløsning indeholdende FACS vask med 1% formaldehyd. Bestemmelse af procentdelen af ​​CD133 + -celler og sortering af cellelinier i CD133 + /CD133- populationer blev udført på et Epics Altra flowcytometri maskine (Beckman Coulter). Resultaterne blev analyseret ved anvendelse WinMDi 2.9 computersoftware.

I fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) af SW480 blev cellerne mærket under anvendelse af den samme protokol, men uden den endelige fiksering trin. For at vurdere plasticitet CD133 ekspressionen blev sorterede celler opretholdt i kultur i 3 uger før undergår re-evaluering. For alle andre forsøg blev CD133 + /CD133- populationer testes umiddelbart efter sortering.

RNA-ekstraktion, påvisning af splejsningsvarianter og mRNA kvantificering

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Prøver af normal colon mucosa blev indsamlet med fuld godkendelse af den lokale etiske komité (Oxford Research Ethics udvalg B, REC henvisning C02.310). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, hvis prøver blev testet for CD133 ekspression og splejsningsvarianter. RNA blev ekstraheret og komplementært DNA (cDNA) blev syntetiseret som tidligere beskrevet [20].

To vigtige splejsningsvarianter er blevet beskrevet for CD133. Den større variant AC133-1 (NM_006017) blev identificeret først og indeholder alle exons [15]. Den anden variant, AC133-2, muffer ud exon 4, som er 27 basepar lang og koder for et 9 aminosyresekvens i det første ekstracellulære domæne af CD133. Ekspression af splejsningsvarianter blev testet ved RT-PCR under anvendelse af en opstrøms primer i exon 3 og en nedstrøms primer i exon 5 (primersekvenser tilgængelige fra forfatterne). Dette ville producere et produkt af 199 basepar fra AC133-1 og 172 bp fra AC133-2. Slutpunkt PCR analyse blev udført ved at se PCR-produkter på agarosegeler. Men da fortrinsret forstærkning af den mindre produktet kan producere data artefakter, blev undersøgelsen gentaget ved hjælp af real-time PCR (med Sybr grøn som reporter farvestof) på MX3005P termiske cycler (Stratagene, UK). Specificitet af PCR blev valideret af tovejs direkte sekventering. Tilstedeværelsen af ​​splejsningsvarianter blev testet i cDNA opnået fra CRC cellelinier, de sorterede CD133 + og CD133- populationer af SW480 samt 10 prøver af normal colon mucosa

Sorted CD133 +/- populationer undergik analyse af mRNA-niveauer ved kvantitativ RT-PCR-analyse under anvendelse af standardkurven metode. Analyse blev udført tre gange for hver prøve og

CD133

værdier blev normaliseret til husholdning gen

HPRT

. Hver reaktion blev udført i et slutvolumen på 25 pi i en MX3005P termisk cykliseringsapparat (Stratagene, UK). Dataene for Q-PCR blev analyseret ved anvendelse af MxPro-QPCR software.

Gene Knockdown

Gene knockdown blev opnået ved transfektion af HT29-celler (vist at have høj CD133 ekspression) med CD133-specifikke små interfererende RNA (siRNAs). Ca. 2 × 10

5-celler blev podet i 2 ml DMEM-medium med 10% FBS i 6-brønds plader (Corning) 24 timer før transfektion. Celler blev transficeret med CD133-specifik stealth siRNA-duplexer (sekvens: 5′-GAGUCGGAAACUGGCAGAUAGCAAU-3 ‘, Invitrogen) ved en slutkoncentration på 33 nm ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Disse er nu kommenteret som HT29

CD133-. Kontroller bestod af celler transficeret med scrambled kontrol siRNA (sekvens: 5′-GAGGGAACAGUCGGAUAGACCUAAU-3 ‘). Og derfor fra nu betegnet som HT29

SSC (scrambled siRNA control)

Western blotting

til Western-blotting, blev lysater fremstillet og kvantificeret som beskrevet tidligere [20]. Prøver (30 ug) blev underkastet natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse af en 10% løse polyacrylamidgel og overført til en Hybond-P PVDF-membran (Amersham Bioscience). Efter blokering med 5% bovint serumalbumin (BSA) /0.1% TPBS (Tween 20 i PBS-opløsning) i 60 minutter, membranen blev derefter inkuberet natten over ved stuetemperatur med CD133 (C24B9) Kanin mAB (Cell Signaling) i en koncentration på 1:1000. Membranen blev vasket med 0,1% TPBS 3 gange i 5 minutter hver derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med en peberrodsperoxidase-bundet sekundært antistof (Sigma-Aldrich) (1:10000, anti-kanin IgG) fortyndet med 5% BSA /PBS indeholdende 0,1% Tween20. Efter yderligere 3 vaske blev membranen visualiseret forøget kemiluminescens reagenser (Thermo Scientific) For et loading kontrol blev det monoklonale anti-β-actin-antistof (Sigma Aldrich) i en fortynding på 1:2000 mod β-actin anvendte protein.

Proliferationsassay

En tidsforløb assay for proliferation blev udført efter gen knockdown og efter celle sortering. For HT29, blev hver brønd i en 24 brønds plade podet med 10

4-celler 24 timer efter transfektion med enten CD133 specifik eller krypteret kontrol siRNA. Celleantal blev vurderet på dag 1, 3 og 5. For SW480 de sorterede CD133 + og CD133- populationer blev podet ved 10

4 celler per brønd og celletal vurderet på dag 1, 3, 5, 7 og 9. I det mindste to uafhængige forsøg, som hver i tre eksemplarer, blev udført. En methylenblåt assay [21], [22] blev anvendt til at kvantificere antallet af adhærente levedygtige celler.

Stauropsorine induceret apoptose

Staurosporin blev anvendt til at evaluere modstandsdygtigheden tillagt ved CD133 for eksogene apoptotiske spændinger . For HT29, blev hver brønd af en 96 brønds plade (Costar) podes med enten HT29

CD133- eller HT29

SSC celler 72 timer efter transfektion. Ca. 5 x 10

4-celler blev podet per brønd og inkuberet med staurosporin (Sigma) i en endelig koncentration på 8 uM i 24 timer. Efter denne periode blev levedygtige og apoptotiske celler måles. For SW480 blev hver brønd af en 96 brønds plade podet med 10

5 celler af de sorterede celler og staurosporin blev tilsat 24 timer senere ved en koncentration på 8 uM. Efter yderligere 24 timer blev antallet af levedygtige celler /apoptotiske legemer vurderes. Analysen blev udført i tre eksemplarer og gentages i mindst to uafhængige forsøg.

2 dimensional (2D) og 3 (3D) dimensional kolonidannende assay

evne isolerede enkelt CD133 + og CD133- celler til at danne kolonier blev testet i både 2 dimensional (2D) kultur og 3 dimensional (3D) kultur. For 2D kultur blev 300 frisk sorterede celler podet i individuelle brønde i en 6 brønds plade og dyrket i 14 dage. Cellerne blev derefter farvet med methylenblåt og kolonier indeholdende mere end 20 celler blev talt. Forsøgene blev udført in triplo og ved to lejligheder.

3D kultur blev udført for at vurdere colonogenic evne de sorterede populationer i ikke adhærente betingelser. Celler (2500 fra hver population CD133 + og CD133-celler) blev talt og resuspenderet som enkeltceller i 0,7% DNA kvalitet agarose (Sigma-Aldrich) .Dette blev overlejret på en base af 1% DNA kvalitet agar (Sigma Aldrich) og både top og basislag blev blandet med 2X DMEM. Eksperimenter blev sat op i tre eksemplarer og medium skiftes to gange om ugen. Efter to uger blev antallet af kolonier, der er udviklet inden hver brønd tælles og visualiseres under et mikroskop efter farvning med 0,05% krystalviolet i 1 time og repræsentative felter blev fotograferet. For både 3D og 2D kultur, blev procent kolonidannende effektivitet (CFE) beregnet som følger,% CFE = (Antal opnåede kolonier /antal dyrkede celler) x 100 [23]. Log transformerede værdier blev derefter anvendt til statistisk analyse.

In vitro

migration assay

Transwell cellemigration assays blev udført ved anvendelse af en Boyden kammer indeholdende et polycarbonat filter med en 8 um porestørrelse (Costar). Dyrkningsmedium (600 pi) suppleret med 20% FBS blev tilsat til det nederste kammer og 2,5 × 10

5 celler af de sorterede populationer blev tilsat til det øvre kammer (i 100 pi kulturmedium suppleret med 10% FBS). Antallet af celler, der migrerer gennem membranen blev manuelt talt efter 24 timer. Analyser blev udført tre gange og to separate lejligheder. Celle migration blev også målt under anvendelse af en celle sårede assay udført i 6 brønd plader (Costar). Cellerne blev dyrket til sammenflydning og derefter sultet i 24 timer i serumfrit medium. En steril 200 pi pipettespids blev brugt til at skabe tre separate parallelle sår og migration af celler i hele såret linje blev vurderet efter 24 timer. Fotografier blev taget med en ladningskoblet enhed (CCD) kamera (Canon, Japan) er fastgjort til den omvendte fase-kontrast mikroskop ved en effekt på X40. Afstanden mellem kanterne blev målt 6 ligeligt fordelte punkter ved hjælp ImageJ software [33] og derefter analyseret ved anvendelse af en to-halet t-test. Forsøgene blev gentaget to separate lejligheder.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev foretaget ved hjælp af SPSS 13.0 Software. Alle evalueringer blev udført ved anvendelse af uparret tosidet t-test. For undersøgelser med celle- og kolonitælling, blev analyseret celleantal. For undersøgelser med en numerisk fluorescens output, blev de rå fluorescens-værdier anvendes.

Resultater

CD133 udtrykke befolkninger i cellelinjer

Størrelsen af ​​CD133 + populationen blev testet i 8 CRC cellelinier ved flowcytometri og i hvert tilfælde ca. 500 000 celler blev analyseret. I to cellelinjer (DLD1 og SW837), CD133 + celler var ikke påvises. Størrelsen af ​​CD133 + populationen viste sig at være 95% i to cellelinjer (Caco2 og HT29). I de resterende cellelinjer, en bimodal population var til stede med en CD133 + population i området fra 32-64% (figur 1).

Otte CRC cellelinier blev testet og viste varierende størrelse af populationen af ​​CD133 + -celler. (A) Prøve flowcytometri billeder er vist for Caco2 (venstre paneler, 95% positive celler) og SW837 (højre paneler). Analyse blev udført under anvendelse AC133 /1-antistof (øverste panel) og gating blev udført for hver cellelinje ved anvendelse af en isotypekontrol (nederste panel), PMTLin 1 er photmultiplier rør lineær 1 hvilket indikerer sidespredning) (b) viser, at i to cellelinier der var ingen CD133 + celler identificeret samtidig i to cellelinier næsten alle celler var CD133 +. De resterende cellelinjer havde varierende størrelse population af CD133 + celler.

Splice varianter af CD133 i CRC cellelinjer og normal slimhinde

Angivelse af de to vigtigste splejsningsvarianter af CD133 (AC133- 1 og AC133-2) blev testet ved RT-PCR i både cellelinier og prøver af normal slimhinde. Kun ét produkt blev set på agarose geler, som, på sekventering, blev fundet at være den kortere AC133-2 splejse variant, hvorfra exon 4 splejses ud (figur 2a og 2c). Imidlertid kortere PCR produkter underkastes præferentiel amplifikation og det er muligt, at større produkter kan blive savnet af både agarosegelelektroforese og sekventering (især hvis til stede i lave niveauer). Analysen blev forfinet ved at udføre PCR hjælp SYBR grøn som reporter farvestof. Evaluering af dissociationskurven viste tilstedeværelsen af ​​en enkelt PCR produkt (figur 2b).

cellelinjer og normale mucosale prøver blev testet for ekspression af de to vigtigste CD133 splejsningsvarianter ved RT-PCR med primere forankret på hver side af den splejsede ud exon (exon 4). Sample Data er vist som påviser kun et enkelt produkt blev identificeret ved PCR-produkter blev analyseret på både (a) agarosegel og (b) den mere følsom Q-PCR-teknik under anvendelse Sybr green som reporter. M = størrelse markør, nc = negativ kontrol, * repræsenterer DLD1. (C) Sekventering af produkterne viste, at exon 4 blev splejset ud af den kodende sekvens således kun kortere splejsningsvariant (AC133-2) blev der udtrykkes. Rækkefølgen over elektroferogrammet er AC133-1 med exon 4 vist mellem linjerne.

Knockdown af CD133

HT29 har et højt niveau af CD133-ekspression. Celler blev transficeret med enten CD133 specifik eller krypteret kontrol siRNA og blev testet 72 timer efter transfektion. Western blot viste, at proteinet var næsten ikke målbart i når CD133 specifikt siRNA blev anvendt. I modsætning hertil transfektion af kontrol siRNA har ingen effekt på protein-ekspression (figur 3).

HT29-celler blev transficeret med enten CD133 specifikt siRNA (HT29

CD133-) eller krypteret kontrol ((HT29

SSC). Western blotting bekræftede tabet af CD133 ekspressionen af ​​gen knockdown. p-actin viser lige protein belastning.

Foreningen af ​​CD133 udtryk med celledeling

Vi sammenlignede spredning sats mellem celler med høje og lave CD133 niveauer ved hjælp af to eksperimentelle tilgange. i HT29 den CD133 protein blev slået ned og celletal overvåget i 5 dage (figur 4a), mens SW480 blev sorteret i CD133 + /CD133- befolkninger og celletal blev overvåget over 9 dage (Figur 4b). Begge forsøg viste de samme resultater dvs. der var ingen signifikant forskel mellem celler med høj eller lav CD133 ekspression. Tilsvarende tællinger af flydende apoptotiske legemer i denne periode viste ingen forskel (data ikke vist).

Celleproliferation blev vurderet efter knockdown af CD133 i HT29 (figur 4a) og sortering af SW480 til rene CD133 + og CD133- populationer (figur 4b). En tidsforløb assay blev udført over flere dage med ingen sammenhæng ses mellem CD133 og celle numre.

Foreningen af ​​CD133 udtryk med staurosporin induceret apoptose og kolonidannelse

En funktion, der kan være forventes i stamceller er resistens over for apoptose efter exogent stress. Både eksperimentelle fremgangsmåder blev anvendt til at teste virkningen af ​​CD133-niveauer på resistens over for apoptose, når de udsættes for staurosporin i 24 timer. Overensstemmende resultater blev opnået indikerer, at høje niveauer af CD133 tillægges staurosporin modstand. Færre levedygtige HT29

CD133- celler var til stede end HT29

SSC celler (figur 5a, p = 0,01); omvendt større antal levedygtige celler var til stede i den sorterede CD133 + population end CD133- population (fig. 5b, p = 0,008). Der var dog ingen forskel mellem celler, når udsat for DMSO alene.

CD133 gav resistens over for staurosporin-induceret apoptose. Figur 5a viser, at efter udsættelse for staurosporin var der færre levedygtige celler efter transfektion med CD133 specifikt siRNA (HT29

CD133-) end med scrambled kontrol (HT29

SSC) (p = 0,01). Der var ingen forskelle mellem cellerne efter udsættelse for DMSO. Figur 5b viser, at CD133 + population af SW480 viste celler viste signifikant større modstand end CD133- population (p = 0,008). Figur 5c og 5d ​​viser CD133 + celler var signifikant mere klonogene end CD133- celler (p 0,0001 og p 0,003) i 2D og 3D kultur hhv. Tal 5e (kolonier dannet af CD133 + celler) og 5F (kolonier dannet af CD133- celler) viser, at både CD133 + og CD133- populationer af SW480 var stand til at danne kolonier fra enkelte celler (typiske kolonier vist).

Et andet træk ved “stemness” er evnen til at danne kolonier. Dette blev testet ved at dyrke enkelte celler i blød agar i to uger (3D kultur) og 2D kultur og den sorteres CD133 + og CD133 – celler blev sammenlignet. I begge tilfælde kolonier var synlige efter to uger, men antallet af kolonier var signifikant større i CD133 + celler (P 0,0001, og P 0,003). I 2D og 3D kultur (figur 5c og 5d)

Foreningen af ​​CD133 udtryk med cellemigration

Komparativ analyse af celle motilitet mellem celler med høj og lav CD133 ekspressionen blev testet af Transwell migration assays. Både eksperimentelle betingelser produceret overensstemmende resultater. Betydeligt færre HT29

CD133- celler migreret over membranen end HT29

SSC celler (figur 6a, p = 0,04). Omvendt betydeligt større antal CD133 + celler migrerede end CD133- celler (figur 6b, p = 0,03). En celle sårede assay blev også anvendt efter gen knockdown som viste, at sårkanterne var betydeligt tættere på HT29

SSC celler end i HT29

CD133- celler (p 0,001) hvilket bekræfter forholdet mellem høj CD133 udtryk og øget cellemotilitet (figur 6c).

Transwell migration blev målt efter knockdown af CD133 i HT29 og sortering af SW480 ind CD133 +/- populationer. Betydeligt færre HT29

CD133- celler migreret over membranen end HT29

SSC celler (figur 6a, p = 0,04). Omvendt større antal sorterede CD133 + celler migrerede end CD133- celler (figur 6b, p = 0,03). En såret assay blev også iværksat og gen knockdown var forbundet med markant forsinkelse i lukning af såret som var visiually mærkbar efter kun 24 timer (Figur 6C) og statistisk signifikant (p 0,001).

Plasticitet af CD133 ekspression i cellelinjer

SW480-cellelinien blev sorteret i CD133 + og CD133- populationer som er blevet opretholdt i standard vævskultur-betingelser og gennemgik regelmæssig analyse ved flowcytometri. Øjeblikkelig re-analyse viste, at CD133 + og CD133- populationer var henholdsvis 97,6% og 99,9% ren (figur 7a). Kvantitativ PCR viste transkriptionel repression af CD133 i CD133- befolkning og selvom CD133 mRNA stadig kunne påvises, var det kun 15% af niveauet i CD133 + populationen (figur 8).

SW480 blev sorteret i CD133 positive og negative populationer, som derefter blev dyrket separat. (A) gating blev indstillet således, at kun de ekstreme populationer blev opsamlet som ved øjeblikkelig efterprøvning, viste sig at være meget rene populationer. (B) Efter længere tids kultur, både af de sorterede populationer blev bifasisk. Forholdene mellem CD133 + og CD133- celler blev stabil efter tre uger og ikke ændre sig efter at (selv om de ikke var den samme som den oprindelige parental cellelinje).

Q-RT-PCR-analyse af de sorterede populationer viste, at der var transkriptionel repression af

CD133

i CD133- population (selvom lave niveauer af mRNA var stadig påviselig).

Langvarig kultur resulterede i begge populationer reverterende til en bimodal profil. Den CD133 + befolkning, efter 3 uger, bestod af 70% CD133 + celler og 30% CD133- celler, frekvenser som forblev stabil derefter i mindst 3 måneder. Resultaterne i modstrid med offentliggjorte rapporter, hvor rene populationer af CD133 + celler tilbage til normal forhold af CD133 +/- populationer [8]. De CD133- celler udviklet en population af CD133 + celler, som, efter 3 uger, nåede 17%, men steg ikke derefter (figur 7b).

Diskussion

Den CD133 + befolkning er variabel i CRC-celle linjer

Vi screenede et stort antal celler fra otte veletablerede CRC cellelinier ved flowcytometri at kvantificere størrelsen af ​​CD133 + populationen. Vi fandt, at i to cellelinjer (DLD1 og SW837) var der ingen detekterbar CD133 + celler, i to cellelinier (Caco2 og HT29) den CD133 + populationen var 95% af de totale tumorceller, mens de resterende cellelinjer havde befolkningsstørrelser i området fra 32% -64%. Vores data er i overensstemmelse med undersøgelser af letaet al. og Dalerba et al. [18], [24] som rapporterede lignende niveauer af CD133 udtryk i cellelinier HT29, LoVo og ingen ekspression i DLD1. Vore data er dog afvigende med dem af O’Brien og Ricci-Vitiani [8], [9], selv om årsagen til denne forskel er ukendt. En mulighed er, at vores undersøgelser anvendt etablerede cellelinjer, mens de øvrige undersøgelser brugte nye cellelinjer afledt i deres egne laboratorier. Det er muligt, at langvarig kultur kan forårsage opretholdes ændringer i CD133 regulering selv om dette i sig selv vil foreslå, at CD133 ekspression er ikke en meget god markør for CSCS. Forskelle i teknik kan give en anden forklaring, selvom vi brugte de samme antistoffer som O’Brien og Ricci-Vitiani og vi holdt inkubationstider med det primære antistof ned til 15 minutter. Uanset hvad, har vores data utvetydigt vist, at i 4/8 cellelinier, den CD133 + populationen er enten fraværende eller omfatter næsten hele tumorcellepopulation. Disse data sammen med andre data præsenteret nedenfor, fører os til at konkludere, at CD133 er nok ikke en specifik markør af stamceller i CRC.

Kun CD133 splejsning variant AC133-2 udtrykkes i colon væv

Selv om en lang række splejsningsvarianter er blevet beskrevet for CD133, kun én (betegnet AC133-1 og som var først skal klones) har fået tildelt en referencesekvens nummer. Dette indeholder den fulde længde kodende sekvens, mens en anden splejsningsvariant (AC133-2, den anden skal klones) synes at splejse ud exon 4. Vores analyser af 8 CRC cellelinier og 10 prøver af normal slimhinde, ved anvendelse af både endepunkt, realtid metoder, kun identificeret variant AC133-2. Dette ville være i overensstemmelse med den undersøgelse, som Yu et al. [25], hvori AC133-2 blev rapporteret som værende den splejsningsvariant som er til stede i mange stamcellelinjer rum mens AC133-1 er begrænset til føtal hjerne og skeletmuskel.

CD133 ekspression er forbundet med nogle af funktionerne i den stamcelle-fænotype

for at evaluere funktionen af ​​CD133, blev cellelinien HT29 testet efter knockdown af CD133 ved RNA-interferens. Denne fremgangsmåde kan også producere “off-target” virkninger og således en supplerende fremgangsmåde blev anvendt til at separere SW480-en cellelinie med et CD133 + population på 40% – til rene CD133 + og CD133- populationer. Begge typer af eksperimenter viste lignende resultater. For det første har niveauer af CD133 ikke at ændre celleproliferation eller apoptose. Der var dog stor forskel på de funktioner, der kan betragtes som en del af stamcelle-fænotype. Således høje niveauer af CD133 var associeret med forøget clonogenicity og modstand mod staurosporin-induceret apoptose. Sidstnævnte kan skyldes en medfødt resistens mod apoptose (eventuelt medieret af sådanne rapporterede associationer som mellem CD133 ekspression og anti-apoptotiske gener, såsom FLIP (Caspase 8 inhibitor) og Bcl-2 [26]. Alternativt kan det være på grund af forbedrede cytobeskyttende strategier såsom evnen til aktivt ekstrudere giftige stoffer fra cytoplasmaet [3].

en anden funktion vi fundet at være forbundet med CD133 ekspression blev forøget cellemotilitet. Andre undersøgelser har antydet en rolle for CD133 i celle motilitet, da det er klassisk udtryk i membran fremspring [27], [28]. i visse situationer, såsom embryogenese og sårheling, stamceller nødt til at erhverve funktioner i motilitet. i CSCS, kan funktioner i forbedret motilitet tillade invasion og metastase til ske-et begreb støttes af studiet af Rappa et al, som findes CD133 ekspressionen var forbundet med metastase i melanomaceller [29]. Vores data giver dog modsiger dem af Horst et al. [30], der ikke finder, at CD133 udtryk var forbundet med cellemotilitet i Caco2.