PLoS ONE: Karakterisering af Primo-karsystemet i bughulen af ​​lungekræft Mouse model og dens Forskelle fra lymfesystemet System

Abstrakt

Kræft vækst og udbredelse er blevet grundigt undersøgt i lang tid. Ikke desto mindre er mange nye bemærkninger om anatomi og histopatologi af kræft begivenheder stadig rapporterede såsom dannelsen af ​​en vaskulogen-lignende netværk inde aggressive tumorer. I denne forskning, nye former for mikro-ledninger, navngivet Primo-fartøjer, blev fundet inde i bughulen af ​​NCI-H460 lungecancer murine xenograftmodeller. Disse vaskulære tråde blev stort set fordelt på overfladerne af forskellige organer og ofte blev forbundet til peritoneale tumornoduler. Histologiske og immunfluorescerende undersøgelser viste, at de primo-fartøjer havde karakteristiske træk, der var markant anderledes fra de tilsvarende udseende lymfekar. De havde flere kanaler omgivet med løse collageneous matricer, hvilket er i modsætning til enkelt-kanalstruktur andre vaskulære systemer. De stavformede kerner på linie i længderetningen langs kanalerne blev antaget at være de endotelceller PRIMO-fartøjer, men Lyve-1, en specifik markør for lymfekar blev ikke udtrykt, hvilket indikerer en klar forskel fra lymfatiske endotelceller. Tilsammen disse resultater på og karakterisering af de nye trådlignende vaskulære strukturer i kræftmodeller kan have stor betydning for kræft prognose og til terapi

Henvisning:. Yoo JS, Ayati MH, Kim HB, Zhang Wb, Soh KS ( 2010) Karakterisering af Primo-karsystemet i bughulen af ​​lungekræft Mouse model og dens Forskelle fra lymfesystemet. PLoS ONE 5 (4): e9940. doi: 10,1371 /journal.pone.0009940

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Januar 27, 2010; Accepteret: 9 marts 2010; Udgivet: April 1, 2010

Copyright: © 2010 Yoo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev understøttet af en Systembiologi Infrastruktur Etablering Grant fra Gwangju Institut for Videnskab og Teknologi. Jung Sun Yoo blev støttet af Seoul Science Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Primo-skibe (Bonghan kanaler) er nye former for mikro-kanaler og antages at være den mekanistisk fundament for akupunktur meridianer i traditionel orientalsk medicin. I begyndelsen af ​​1960’erne, Bong-Han Kim Nordkoreas hævdede at have opdaget disse kanaler, opkaldt efter ham, som dannede en roman kredsløbssygdomme system i hele dyrets krop [1]. Han gjorde dog ikke afsløre hans metode til at observere systemet i detaljer, så indtil for nylig, blev der ikke nøjagtig bekræftelse af hans arbejde nogensinde udført på trods af mange forsøg i Kina, Japan og Rusland, undtagen om en delvis gengivelse af en japansk anatom , Fujiwara [2].

Observationer af primo-fartøjer i kaniner, rotter og mus blev for nylig gjort ved at anvende moderne bio-imaging teknikker [3], som ikke blot har bekræftet Kims påstande, men også nye resultater og oplysninger, så som

in vivo

farvning af primo-fartøjer med Trypan blå [4] og eksistensen af ​​primo-fartøjer inde fedtvæv [5] og på overflader af subkutane tumorvæv [6]. Desuden har nogle beviser for en fluid-ledende funktion af Primo-karsystemet er leveret af målinger af strømningshastigheden [7] og væsken viskositet [8].

I det foreliggende arbejde, vi observerede primo -beholdere på overfladerne af abdominale organer og omkring peritoneale tumorknuder i lungekræft musemodeller. For at belyse de spredningsmønstre for Primo-fartøjer i forbindelse med kræft biologi, brugte vi to sæt kræftmodeller, dvs, subkutan (sc) xenograftmodel og intraperitoneal (ip) eksperimentel metastase model med administration af NCI-H460 human lunge cancerceller [9], [10]. Trypan blåfarvning under

in vivo

situ

betingelser i [4], [11] blev anvendt til at afsløre omfanget af primo-fartøjer i tumor-bærende mus, som var mulig på grund til farvestoffet bliver fortrinsvis absorberet i den løse struktur primo-fartøjer sammenligne med andre abdominale væv.

Vi udførte også histologiske og immunfluorescerende undersøgelser for at skelne primo-skibe fra lignende udseende lymfekar. Sondringen mellem primo-fartøjer og lymfekar har været en forestående spørgsmål på grund af lighederne mellem disse morfologiske karakteristika. Selv om dette problem delvist løses ved at bruge konventionel histologi og elektronmikroskopi [12], [13], en mere overbevisende undersøgelse, såsom immunhistokemi med en pålidelig molekylær markør for lymfatiske endotelceller, Lyve-1 [14], [15], [16], ikke var blevet prøvet før denne forskning. I hvilke udførte vi immunfarvning med Lyve-1, ud over at bruge forskellige konventionelle histologiske undersøgelser, for at vise forskellen mellem primo-fartøjer og lymfekar.

Resultater

Intraoperativ Visualisering af Primo-fartøjer i fm Xenografter

For at visualisere primo-fartøjer i s.c. mus xenotransplantater, udførte vi omhyggelig abdominal kirurgi to til otte uger efter inokulation af 1 × 10

7 NCI-H460 humane lungecancerceller. Figur 1 viser anatomiske billeder af primo-karsystemet, farvet med trypanblåt (blå farve), inde abdomen subkutan tumorbærende mus.

In situ

trypanblåt sprede under levende betingelser afslørede halvgennemsigtige primo-skibe (pile) i fedtvæv (fig 1A . 1B) eller omkring gonadale organer (. Figur 1C 1D) eller på overfladerne af forskellige organer, herunder tyndtarmen, nyren og leveren (fig 1E, 1F . 1H), eller på bugvæggen (fig 1G.). Andre kendte konstruktioner, såsom lymfekar, fedtvæv, blodkar og nerver, ikke var

in vivo

farvet med trypanblåt i vores flere forsøg. Lige, tynde primo-fartøjer var ofte synlige, men nogle gange mange kløvet grene med et vejkryds (en stjerne), blev også fundet. Vi kunne løfte lange og elastiske primo-fartøjer med en pincet mens lymfekar ofte fastsættes inde væv (fig. 1B).

In situ

trypan blå spredning afsløret halvgennemsigtige primo-skibe (pile) som er fordelt på overfladerne af forskellige organer på grund af højere infiltration af farvestoffet i løs ekstracellulære struktur Primo-fartøjer sammenlignet med andre væv. Lige tynde primo-fartøjer var ofte synlige, men nogle gange mange kløvet grene med et vejkryds (en stjerne), blev også fundet. Bemærk, at Primo-fartøj løftes af pincet i modsætning til lymfekar (B). LI; tyktarmen, SI; tyndtarm, O; æggeleder, L; lever, K; nyre, AW; bugvæggen.

Intraoperativ Visualisering af Primo-fartøjer i i.p. Xenografter

En lignende intraoperativ billeddannelse blev udført med i.p. mus xenografter. Figur 2 viser Primo-karsystemet fastgjort til intraperitoneale tumornoduler. PRIMO-skibe (pile), farvet med trypanblåt, blev hovedsageligt placeret omkring tumor knuder (pilespidser), der havde dannet på 4 uger efter i.p. injektion med 1 × 10

7 NCI-H460 celler. Især viste nogle primo-fartøjer distributionsmønstre enten går inde eller omkring tumor knuder og vil sandsynligvis være nye bevoksninger af primo-fartøjer drevet af behov tumoren.

Primo-skibe (pile) farves med trypan blå hovedsageligt placeret omkring tumor knuder (pilespidser), som var synlige efter 4 ugers ip injektion med NCI-H460 celler. Især nogle primo-fartøjer viste distributionsmønstre enten gå inde eller omkringliggende tumor knuder. SI; tyndtarmen, AW; bugvæggen

Histologisk Karakterisering af Primo-fartøjer med H . E og MT Farvning

En yderligere karakterisering for at finde en karakteristisk morfologi for primo-fartøjer blev udført ved hjælp af en histopatholgic undersøgelse. Figur 3 viser typiske primo-noder og primo-fartøjer fremstillet af lungekræft implanteret. Hematoxylin og eosin (H Japan SLC, Inc., Hamamatsu, Japan) blev anvendt i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier under godkendte protokoller. To sæt kræftmodeller blev brugt. Den første model er den standard subkutane (s.c.) xenotransplantat musemodel [9]. Ti mus blev inokuleret s.c. i dorsum med 1 × 10

7 NCI-H460 humane lungecancer-celler (i et 1-ml RPMI-1640 medium) for tumordannelse under huden. Den anden tumormodel er i.p. eksperimentel metastase-model. NCI-H460 humane lungecancerceller blev injiceret i.p. som en cellesuspension i nøgne mus (1 x 10

7 celler pr dyr, n = 10) som beskrevet tidligere [9], [10]. Al forskning, der involverer dyr er blevet godkendt af Instisute af forsøgsdyr Ressourcer i Seoul National University.

intraoperativ Imaging

For at identificere primo-karsystemet inde bughule s.c. og i.p. lungekræft modeller, vi udførte mus kirurgi to til otte uger efter podning af NCI-H460-celler under generel anethesis med i.p. injektion af zoletil /Rompun. Først blev midterlinjen af ​​muse abdomen indsnit i og det intra-abdominale organer blev udsat omhyggeligt. Derefter blev en 0,1% trypan blå opløsning, der tidligere filtreret gennem 0,22 um pore-størrelse filterpapir, blev påført dråbevis på de udsatte organer [4]. Efter skylning væk farvestoffet med varmt saltvand, blev Primo-knudepunkter og Primo-fartøjer identificeret ved direkte visualisering af det kirurgiske anatomi med en kirurgisk mikroskop (SZX12, Olympus, Japan). Endelig blev billederne taget med et CCD-kamera (DP 70, Olympus, Japan).

Histologiske Analyser

Efter intraoperativ billeddannelse af primo-karsystemet,

ex vivo

undersøgelse blev udført med histologisk farvning af prøverne. Til dette formål blev Primo-knudepunkter og fartøjer fikseret i 10% neutral pufret formalin (NBF) i 12 timer ved 4 ° C, skyllet i phosphatpufret saltopløsning (PBS), dehydreret i en gradueret ethanolserie, klaret i xylen, og indlejret i Paraplast (Sigma, USA). Paraplast tværgående sektioner, 6 um i tykkelse, bliver skåret med en mikrotom blev dernæst farvet med hematoxylin og eosin (H & E) for den almene morfologisk observation, og med Masson trichrom (MT) til at visualisere collagenfibrene. Derefter blev snittene monteres med Neomount og undersøgt med et lysmikroskop (BX51, Olympus, Japan). Billeder blev erhvervet med et CCD-kamera (Axiophot, Zeiss, Tyskland).

Immunhistokemi

For at karakterisere primo-skibe mod lymfekar, vi udførte immunhistokemisk undersøgelse med IgG anti-Lyve-1 polyklonale antistof (pAb), en specifik markør for lymfekar. Primo-skibe og lymfekar på overfladen af ​​abdominal orgel i tumorbærende mus blev høstet, indlejret i OLT og snap-frosset i flydende nitrogen. Tværsnit (10 um) blev fikseret i iskold acetone i 5 min, vasket i PBS, og blokeret med CAS-Block-opløsning (Invitrogen, USA) i 2 timer ved 37 ° C. Objektglas blev inkuberet med kanin-anti-muse Lyve-1 (2,5 ug /ml, ABCAM, UK) natten over ved 4 ° C, efterfulgt af vask og detektion med ged-anti-kanin IgG konjugeret til Alexa Fluor 488 (1:500, Molecular Probes , USA). Objektglas blev behandlet med DAPI for nuklear kontrastfarve, dækglas i antifade reagens (Molecular Probes, USA). En del af den samme prøve blev behandlet med kun DAPI og langsgående hel-monteret i antifade reagens. Prøver blev visualiseret ved konfokal mikroskopi (LSM500, Zeiss, Tyskland).

Tak

Vi takker Byung-Cheon Lee og Saeyoung Ahn for nyttige diskussioner.