PLoS ONE: methylentetrahydrofolat reduktase C677T Polymorfi og Modtagelighed for livmoderhalskræft og Cervikal intraepitelialneoplasi: En Meta-Analysis

Abstrakt

Baggrund

En række undersøgelser har undersøgt sammenhængen mellem methyl enetetrahydrofolate reduktase (MTHFR) C677T polymorfi og modtagelighed for livmoderhalskræft og cervikal intraepitelialneoplasi (CIN). Imidlertid resultater forblev kontroversiel. For at løse dette hul, besluttede vi at foretage en meta-analyse af alle tilgængelige offentliggjorte undersøgelser.

Metoder

Elektroniske litteratursøgning i PubMed, Embase og Medline databaserne blev udført frem til 30. april, 2012. fast-effekter eller tilfældige effekter model blev brugt til at beregne de poolede yderste periferi for forskellige genetiske modeller.

Resultater

i alt 12 case-kontrol studier blev til sidst identificeret. Ingen statistisk korrelation blev fundet mellem C677T varianter og livmoderhalskræft for den samlede population. Men undergruppe analyser på de hvide kvinder pegede på en signifikant beskyttende virkning for enkeltpersoner heterozygote eller homozygote for T-allelen (for CT vs. CC: OR = 0,72, 95% CI 0,59-0,88; for TT vs. CC: OR = 0,69, 95% CI = 0,49-0,97, for CT + TT vs CC: OR = 0,71, 95% CI 0,59 til 0,86). C677T varianter var forbundet med hverken kombineret eller stratificeret CIN blandt den samlede befolkning.

Konklusioner

Denne meta-analyse viser, at hvide kvinder med mutant C677T genotyper kan have en lavere risiko for livmoderhalskræft, endnu mangler nok statistisk robusthed. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at få mere indsigt i den rolle, som denne polymorfi i cervikal carcinogenese

Henvisning:. Luo YL, Ye P, Zhang QH, Hu TT, Luo MH, Li MQ, et al. (2012) methylentetrahydrofolat reduktase C677T Polymorfi og Modtagelighed for livmoderhalskræft og Cervikal intraepitelialneoplasi: en meta-analyse. PLoS ONE 7 (9): e46272. doi: 10,1371 /journal.pone.0046272

Redaktør: Xiao-Ping Miao, MOE Key Laboratory for Miljø og Sundhed, Institut for Folkesundhed, Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, Kina

modtaget: 17. maj 2012; Accepteret: August 28, 2012; Udgivet: 28 september, 2012 |

Copyright: © Luo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er kun overgået brystkræft som. mest almindelige maligne sygdomme i både forekomsten og dødeligheden blandt kvinder i hele verden, der tegner sig for mere end 471 tusind nye tilfælde og 250.000 dødsfald på verdensplan hvert år [1], [2]. Cervikal intraepitelialneoplasi (CIN) skønnes at have mindst 600.000 nye tilfælde om året [3], hvilket gør (præ) neoplastisk livmoderhalskræft sygdom en stor trussel for folkesundheden og tung byrde for samfundet, især i nogle høje udbredte lande såsom Indien [4], Korea [5] og Amerika [6].

Epidemiologiske observationer har impliceret, at infektion med visse onkogene typer af humane papillomavirus (HPV) er en væsentlig årsag til livmoderhalskræft neoplasi [7]. Men der er stadig enorme inter-individuelle variationer bidrager til den cervikale neoplastisk proces blandt smittet med HPV kvinder, hvilket indikerer, at HPV-infektion alene ikke kan være helt skylden,.

Bortset fra HPV-infektion, en række socioøkonomiske faktorer, der ikke traditionelt er forbundet med seksuelt overførte sygdomme er blevet identificeret, såsom cigaretrygning [8] og mangel på mikronæringsstoffer, herunder C-vitamin [9] og folat [10]. Blandt hvilke roller folat i human carcinogenese og i behandlinger af kræft er blevet drøftet indgående. Virkningerne af røde blodlegemer folat koncentration på cervikale neoplasi har også længe været undersøgt, og en hypotese om, at kvinder med lavere røde blodlegemer folat niveau var mere muligt at være forbundet med høj-risiko typer af HPV-infektion eller cervikal carcinogenese, har generelt været etableret gennem tilfælde -foere kontrol [11] -. [13] eller tværsnit [14] designs og derved stimulere meget videnskabelige interesser i den mulige indflydelse af polymorfier i folat coenzymer på cervikale læsioner

C677T (rs1801133) er den mest fælles missense mutation lokaliseret i genet kodende methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR). Til dato har en række undersøgelser undersøgt sammenhængen mellem C677T polymorfi og modtagelighed livmoderhalskræft og CIN [15] – [26]. Kontroversielle resultater dog eksisterede blandt de berørte kvinder. Så vidt vi ved, er blevet udarbejdet nogen bekræftede konklusioner vedrørende denne genetiske association problem. For at løse dette hul, besluttede vi at foretage en meta-analyse af alle tilgængelige offentliggjorte undersøgelser.

Metoder

Studies Identifikation

Støtteberettigede artikler frem til 30. april, 2012, identificeret ved at søge de elektroniske litteraturdatabaser (PubMed, Embase og Medline). De søgeord og søgestrategier blev brugt som følger: ( “skællede intraepithelial læsion” ELLER “cervikal intraepithelial neoplasi” ELLER “livmoderhalskræft”) OG ( “methylentetrahydrofolat reduktase” ELLER MTHFR). Referencelister af anmeldelser eller originale artikler om dette emne blev også scannet for at sikre, at yderligere relevante, men tidligere udeladt artikler blev inkluderet i de udvalgte processer. Hvis overlappende data blev præsenteret i flere publikationer, blev kun det seneste, største eller fuldstændig undersøgelse omfattede. Ingen offentliggjorte sprog restriktioner blev sat i denne metaanalyse

Inklusionskriterier

Undersøgelser opfylder følgende kriterier blev inkluderet:. (1) original case-control studier; (2) udforskning af MTHFR C677T polymorfi og modtagelighed for livmoderhalskræft eller CIN; (3) alle genotype distributioner blev rapporteret i både sag og kontrolgruppe; (4) allele fordelinger i kontrolgruppen var i overensstemmelse med Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) [27]

Data udvinding

For hver undersøgelse blev data udvundet af to uafhængige forfattere:. Først forfatterens navn, udgivelsesår, land, etnicitet, type kontrolpersoner, fase af livmoderhalskræft neoplastiske læsioner, sample-størrelse sag og kontrol og fordelinger af hver genotype. Når dataudtræk var færdig, blev uafviklede tvister kræves for at løse. Hvis enighed ikke kunne nås, blev en tredje forfatter hørt, og en endelig beslutning blev taget af flertallet af stemmerne. Forskellige racer /etniciteter blev kategoriseret efter den amerikanske Office of Management og Budget (OMB) standarder for indsamling af data om race og etnicitet (revision 1997) [28].

Statistiske metoder

goodness- of-fit

χ

2

test blev anvendt til at vurdere afvigelsen fra HWE i kontrol, statistisk signifikans blev defineret som

P

0,05. De individuelle og sammenfattende skøn blev opnået ved at beregne de rå odds ratio (OR), samt deres 95% konfidensinterval (CI) og den tilsvarende

P

værdi (

P

værdi er signifikant, hvis 0,05). De samlede yderste periferi blev anslået til co-dominant model (CT vs. CC, TT vs. CC)., Dominerende model (CT + TT vs. CC) og recessive model (TT vs. CC + CT)

heterogenitet mellem studier blev vurderet ved at beregne

Q

statistik med

r

-1 (

r

er antallet af analyserede studier) frihedsgrader (

df

) [29]. Den faste effekter model (Mantel-Haenszel metode) [30] blev anvendt til at beregne de samlede yderste periferi med

P

0,10 til

Q

statistik. Ellers blev det tilfældige effekter model (DerSimonian-Laird metoden) anvendt [31].

Desuden blev den Begg s tragt plot [32] og Egger s lineær regression test [33] anvendes til at vurdere den mulige publikationsbias . Følsomhed analyser blev udført for at se, om nogen udelukkelse af undersøgelserne kunne påvirke de første resultater. Data blev importeret til STATA 10.0 (Stata Corp, College Station, Tex) gennemføre alle statistiske analyser.

Resultater

Udvælgelse af de inkluderede studier

Denne meta-analyse er styret af PRISMA erklæring (protokol S1). En række af 57 undersøgelser foreløbigt givet baseret på søgeord. Efter abstrakt-screenet og fuld-tekst vurderet af disse artikler, i alt 12 artikler mødte inklusionskriterierne for detaljeret analyse (figur 1, Tjekliste S1). Den fulde liste over 57 papirer er tilgængelig fra forfatterne, på anmodning.

Beskrivelse af undersøgelsens karakteristika

De medfølgende artikler blev alle rapporteret i engelsk med undtagelse af en i spansk [21 ]. Størstedelen af ​​de 12 undersøgelser blev udført i Europa [17], [20], [24] og asiatiske [18], [19], [22], [23], [25] populationer. Kontroller blev afledt fra hospitalsbaserede deltagere undtagen Zoodsma et al. [20] og Mostowska et al. [24], hvor forsøgspersoner blev henholdsvis rekrutteret fra en population-baserede organiseret livmoderhalskræft screeningsprogram og ubeslægtede raske kvindelige frivillige, der var fra det samme område af tilfældene. DNA kilde til genotype bestemmelse var hovedsageligt fra blodprøve bortset tre undersøgelser [15], [17], [23], hvor cervikal væv blev anvendt. De udvalgte karakteristika for alle inkluderede studier er beskrevet i tabel 1.

Med hensyn livmoderhalskræft, 10 studier var berettiget med en samlet stikprøve på 1749 tilfælde og 2451 kontroller. Med hensyn til CIN blev 7 studier samlet til analyse (1223 tilfælde og 2005 kontroller), som alle er rapporteret, at CIN histologisk blev bekræftet. De C677T genotype fordelinger i patienter med livmoderhalskræft eller CIN og kontroller er opsummeret i tabel 2, tabel 3.

Kvantitativ Synthesis

For alle inkluderede studier, den allele fordelinger af C677T i kontrolgruppen var alle i overensstemmelse med HWE på 0,05 niveau (tabel 2-3), hvilket antyder, at indlysende virkninger af naturlig selektion og migration på genetisk ligevægt var blevet undgået. De vigtigste resultater af metaanalysen er skitseret i tabel 4.

Ingen statistisk signifikans blev observeret i C677T polymorfisme og livmoderhalskræft for den samlede befolkning på alle genetiske kontraster (CT vs. CC: OR = 0,82, 95% CI 0,63-1,06; TT vs CC: OR = 0,95, 95% CI 0,76-1,19; CT + TT vs CC: OR = 0,84, 95% CI 0,64-1,11; TT vs. CT + CC: OR = 1,05, 95% CI 0,85-1,28). Værd at bemærke er dog, betydelig heterogenitet mellem de enkelte studier blev set i co-dominant model (CT vs. CC:

P

h

= 0,01) og dominerende model (CT + TT vs CC:

P

h

= 0,00), hvilket gør stratificeret analyser nødvendig.

som White og asiatiske befolkninger var involveret i de fleste undersøgelser, vi også udført undergruppeanalyser at reducere heterogenitet indført ved forskellige etnicitet grupper . Resultaterne for asiatiske befolkning blev gentaget som ikke-signifikant sammenhæng. Når vi yderligere klassificeret den asiatiske gruppe i henhold til visse lande, de koreanske og indiske resultater fortsatte med at være null forening, omend med begrænsede antal undersøgelser. Som for den hvide befolkning, co-dominerende model samt dominerende model viste sig at være af statistisk signifikans, med en OR på 0,72 (95% CI 0,59 til 0,88), 0,69 (95% CI 0,49-0,97) og 0,79 ( 95% CI 0,59-0,86) henholdsvis indikerede en reduceret livmoderhalskræft risiko for enkeltpersoner heterozygote eller homozygote for T-allelen blandt hvide kvinder.

Hvad angår CIN, de puljede RYP’erne viste ingen statistisk sammenhæng mellem C677T polymorfi og CIN risiko (CT vs. CC: OR = 1,15, 95% CI 0,98-1,35; TT vs CC: OR = 1,14, 95% CI 0,90-1,45; CT + TT vs CC: OR = 1,14, 95% CI 0,98-1,33; TT vs. CT + CC: OR = 1,04, 95% CI 0,84-1,29). Som CIN læsioner kunne opdeles i lav og høj kvalitet læsioner (CIN I og CIN II /III, henholdsvis) og de fleste af de enkelte studier har defineret disse to kategoriseringer, var til rådighed til at udføre en sub-analyse for CIN data. Sound homogenitet blev set i to undergrupper, og ukorrelerede blev ligeledes gentaget (tabel 4). De undergruppe resultater baseret på etnicitet var ikke muligt for kun begrænsede papirer forudsat de nødvendige data.

Offentliggørelse skævhed

Med hensyn livmoderhalskræft, formerne af tragten parceller afslørede ikke nogen tegn på åbenlys asymmetri . Også, har resultaterne af Egger test ikke foreslå nogen publikationsbias (CT vs. CC:

P

= 0,55; TT vs CC:

P

= 0,54; CT + TT vs. CC :

P

= 0,60; TT vs. CT + CC:

P

= 0,36). Tilsvarende blev ingen signifikant publikationsbias demonstreret vedrørende CIN (CT vs. CC:

P

= 0,11; TT vs CC:

P

= 0,71; CT + TT vs CC:

P

= 0,17; TT vs. CT + CC:.

P

= 0,97)

Følsomhedsanalyser

for hele befolkningen, var der ingen bemærkelsesværdige afgang fra de indledende yderste periferi, når de samlede estimater blev genberegnet ved at udelade en undersøgelse på et tidspunkt, og konsekvent ikke-signifikant sammenhæng blev observeret på tværs af alle genetiske sammenligninger i livmoderhalskræft og CIN studier, hvilket indikerer, at de overordnede resultater var robust nok (data ikke vist) .

for den hvide befolkning, følsomhedsanalyser spidse til en lavere risiko, da de samlede skøn dokumenteret, af de muterede genotyper, dog uden statistisk blive en beskyttelsesfaktor (til co-dominant model:

P

= 0,42 og 0,34, for dominerende model:.

P

= 0,33), når vi udelukkede den nederlandske undersøgelse [20], manifesterer, at denne forskning havde udøvet en kraftig indvirkning på de observerede resultater

diskussion

methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR), et kritisk enzym i folatafhængige metabolisme af homocystein, er involveret i omdannelsen af ​​5,10-methylentetrahydrofolat (5,10-methyleneTHF) til 5-methyltetrahydrofolate (5 -methylTHF) -den primære cirkulerende form af folat og carbon donor for remethyleringen af ​​homocystein i methionin [34]. C677T polymorfisme, den mest almindelige funktionelle enkelt-nukleotid polymorfisme lokaliseret i MTHFR, er karakteriseret ved cytosin (C) til thymin (T) overgang, der resulterer i omdannelse af en alanin (GCC) til en valin (GTC) ved kodon 225 i N terminale katalytiske domæne af proteinet. Sammenlignet med homozygot normal genotype (CC), både heterozygote (CT) og homozygote (TT) varianter er vist sig at have øget enzym termolabilitet, reduceret MTHFR enzymaktivitet, forhøjet cirkulerende homocystein [34] og lavere plasma og røde blodlegemer folat koncentrationer [ ,,,0],35]. I øjeblikket er den overbevist om, at folatmangel er forbundet med carcinogenese hovedsagelig gennem to mekanismer [36]: (1) Omdannelsen af ​​uracil til thymin, som anvendes til DNA-syntese og reparation, kræver methylgruppe tilvejebragt af 5,10-methyleneTHF, derfor begrænset folat kan forstyrre den thymidylat biosyntese og efterfølgende føre til unormal DNA-syntese, methylering og kromosom reparation; (2) Lave niveauer af 5-methylTHF årsag DNA hypometylering og potentielt fremkalde proto-onkogen udtryk som følge af udtynding for cellulær S-adenosylmethionin, som også er ansvarlig for DNA-methylering.

Der er stigende interesse i undersøgelser af sammenslutninger af den MTHFR C677T polymorfi og modtagelighed eller modstand mod udviklingen af ​​kræft. Men resultaterne er ikke entydige, som drevet forskere til at være opmærksomme på denne polymorfi på et meta-analytisk niveau. I det hele taget, de beskyttende virkninger af C677T polymorfi på kolorektal cancer [37] og barndom akut lymfatisk leukæmi [38] er blevet identificeret af to nyligt opdaterede metaanalyser henholdsvis inkluderet 61 og 21 offentliggjorte case-kontrol studier. Tværtimod har andre store prøve meta-analyser foreslås en større risiko i spiserøret og gastrisk kræft [39] samt brystkræft [40], og alligevel var der ingen dokumentation for, at C677T varianter bidraget til lungekræft [41], [42], hoved- og halscancer [42] eller prostatakræft [43] fra tiden tilgængelige udgivelser.

med henvisning til livmoderhalskræft sygdom modtagelighed, den første undersøgelse overvejer C677T polymorfi som en potentiel molekylær markør blev gennemført af Piyathilake et al. [15] i 2000, som undersøgte 64 sager og 31 kontroller og foreslog en 2,9-fold øget risiko for CIN blandt kvinder der bærer enten mutant heterozygot eller homozygot genotype. Tilsvarende resultater blev rapporteret af Goodman et al. [16] som fandt kvinder med mindst et mutant t-allel havde en to gange så stor risiko for cervikal dysplasi med en større prøve-størrelse. Lambropoulos et al. [17] først rapporteret en null association mellem MTHFR polymorfi og risikoen for livmoderhalskræft, og også blev C677T varianter ikke er relateret til risikoen for CIN. Bagefter gentagne undersøgelser fra forskellige regioner opstået. Men enten beskyttende [20], [21], [22] eller risiko effekter [18], [26] er blevet etableret, mens i et par undersøgelser blev null forening rapporteret [19], [23], [24] , [25].

Der kan være flere faktorer tilskrive disse modstridende resultater. Først og fremmest blev der et lille antal forsøgspersoner præsenteres i nogle undersøgelser [15], [19], [21], som kunne sænke den statistiske effekt af undersøgelsen ved at begrænse muligheden for at anslå mere præcis forening. For det andet, selektionsbias fra studiet arm deltagelse, både patienter og kontroller, kunne være en mulig forklaring på forskelle mellem de enkelte studier, da alle kvinder blev rekrutteret fra forskellige puljer. For det tredje kan variationer under laboratorie procedurer såsom DNA kilde (fra livmoderhalsen væv eller blodprøve), brug af kommerciel eller selvstændig design primer eller PCR-opformering tilstand har påvirket resultaterne. Desuden de genetiske modeller anvendes i de enkelte studier var stort set forskelligartede og generelt kun en eller to modeller blev anvendt, og dermed uforståelig eller modstridende konklusioner kunne drages af metodologisk forskel. Sidst men ikke mindst, kan virkningerne af genetisk heterogenitet skyldes forskellige herkomst af undersøgelsens befolkninger ikke ignoreres. De 677T allelfrekvenserne, for eksempel blevet rapporteret mere udbredt i Hispanics sammenlignet med ikke-latinamerikanere [44]. Den heterogenitet, der var iboende blandt subpopulationer kan føre til både type I og type II fejl og forvirre den virkelige sammenhæng mellem C677T polymorfi og cervikal neoplasi, hvor en positiv eller negativ fund kunne være kunstigt følgeslutning tilskrives befolkningens lagdeling.

for yderligere at klarlægge forholdet mellem C677T polymorfi og livmoderhalskræft sygdom, vi udførte denne meta-analyse. De samlede yderste periferi viste, at C677T varianter var forbundet med hverken kombineret eller stratificeret CIN blandt den samlede befolkning for alle genetiske modeller. Der var enten statistisk signifikant sammenhæng påvist i den samlede livmoderhalskræft befolkning, mens undergruppe analyser pegede på en nedsat risiko blandt hvide kvinder med mutant genotyper. Uanset, følsomhedsanalyser pegede på en lavere risiko, da det samlede resultat dokumenteret, men uden statistisk blive en beskyttende faktor, når den nederlandske undersøgelse [20], blev udelukket. De ovennævnte resultater var i overensstemmelse med de fleste af de relaterede undersøgelser som opsummeret i vores meta-analyse og også manifesteret at rollen som MTHFR C677T polymorfi i cervikal carcinogenese udvikling kan være medieret af etnicitet.

Vi antog, at etnicitet forskelle, som vi nævnte ovenfor, var den væsentligste årsag til omvendt sammenhæng drevet af den hvide befolkning. Men denne konklusion var sårbare over for den statistiske effekt i følsomhedsanalyser. Denne mangel på konsensus kan skyldes to aspekter. Ifølge de amerikanske OMB standarder blev undergruppe af hvide befolkning består af kun tre europæiske lande (Grækenland [17], Holland [20] og Polen [24]) og Mexico [21], repræsenterede Holland den største andel af den kombinerede stikprøvestørrelse (636/851 for sag og 592/940 for kontrol) og den eneste undersøgelse, der viste en signifikant beskyttende forening blandt de fire lande, og dermed var det nok, at de betydninger blev drevet af dette meget stor undersøgelse. Desuden blev kun Holland undersøgelse udført i fastsættelsen af ​​en population-baserede livmoderhalskræft screening formål at opdage cervikal neoplasi modtagelighed gener, derfor potentielle virkninger kan være indført ved forskellene i studiedesign. I lyset af særlige ved den nederlandske undersøgelse, vi overvejet den hvide befolkning skal forsigtigt tolkes.

I denne meta-analyse, identificerede vi alle undersøgelser på dette område, og henvendte estimaterne individuelle risikofaktorer samt poolede resultater under anvendelse af forskellige genetiske modeller. De akkumulerede data var væsentligt at overvinde problemet forslag Colhoun et al. [45], at modstridende resultater var primært på grund af den lille stikprøve. Og Begg-og Egger tests ikke afsløre eventuelle publikationsbias, hvilket indikerer, at vores resultater var saglig.

Men visse begrænsninger i denne undersøgelse havde, at blive anerkendt. Først og fremmest blev der observeret store inter-undersøgelse heterogenitet, hvilket betød bør foretages omhyggeligt fortolkninger af vores resultater. Den observerede heterogenitet kan skyldes forskelle såsom etnicitet variationer, specificerede type livmoderhalskræft, kriterier for sag og kontrol udvælgelse, socio-økonomiske faktorer og så videre. Og alligevel sub-analyser på alle disse variabler ikke blev gennemført som undersøgelsens deltagere fra tidligere undersøgelser varierede meget og data kunne ikke præsenteres på en ensartet standard. For det andet er en anden polymorfi i bindingsuligevægt (LD), nemlig A1298C, hvilket også forårsaget faldende MTHFR enzymaktivitet, om end i mindre omfang [46], også bør anses for at forklare virkningerne af MTHFR polymorfi på cervikal carcinogenese alene eller i kombination med C677T genotyper. Og dog vores undersøgelse var baseret på single-faktor skøn. I betragtning af kompleksiteten af ​​tumor fremskridt og de beskedne genetiske virkninger fra enkelt gen, miljømæssige faktorer og tilfældige effekter kunne ikke udelukkes. Med hensyn til cervikale sygdomme, individuelle adfærd, for eksempel, alder ved første samleje [47], flere sex partnere [48], manglende barriere prævention [49], blev såvel præsenteret som risikofaktorer, men interaktioner mellem disse faktorer og C677T varianter blev beskrevet i vores studie.

sammenfattende denne meta-analyse viser, at hvide kvinder med mutant C677T genotyper kan have en lavere risiko for livmoderhalskræft, men mangler nok statistisk robusthed. I betragtning af begrænsningen af ​​denne undersøgelse, bør der udvises forsigtighed i udarbejdelsen sikre konklusioner. Kombineret og komparative datasæt fra større målestok prospektive undersøgelser er nødvendige for at få mere indsigt i den rolle, som denne polymorfi i udviklingen af ​​livmoderhalskræft carcinogenese og identificere de fælles effekter med miljøfaktorer.

Støtte oplysninger

Protokol S1.

PRISMA 2009 Tjekliste.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046272.s001

(DOC)

Tjekliste S1.

Supplerende fil til figur 1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046272.s002

(DOC)