PLoS ONE: Raltegravir er en potent hæmmer af XMRV, en virus Involveret i prostatakræft og kronisk træthedssyndrom

abstrakt

Baggrund

xenotropisk murin leukæmi-relaterede retrovirus (XMRV) er et nyligt opdaget retrovirus, der er blevet forbundet med human prostatacancer og kronisk træthedssyndrom (CFS). Begge sygdomme rammer en stor del af verdens befolkning, med prostatakræft rammer én ud af seks mænd, og CFS påvirker en anslået 0,4-1% af befolkningen.

vigtigste resultater

Fyrre-fem forbindelser, herunder otte og tyve lægemidler er godkendt til brug i mennesker, blev evalueret mod XMRV replikation

in vitro

. Vi fandt, at den retrovirale integrase inhibitor, raltegravir, var potent og selektiv mod XMRV ved mikromolære koncentrationer, i MCF-7 og LNCaP-celler, en brystcancer og prostatacancer-cellelinie, hhv. En anden integraseinhibitor, L-000870812, og to nukleosid reverse transcriptase-hæmmere, zidovudin (ZDV), og tenofovirdisoproxilfumarat (TDF) hæmmede også XMRV replikation. Når de kombineres, disse lægemidler vises meste synergistiske virkninger mod denne virus, tyder på, at kombinationsbehandling kan forsinke eller forhindre valg af resistente virus.

Konklusioner

Hvis XMRV viser sig at være en kausal faktor i prostata kræft eller CFS, kan disse opdagelser muliggøre rationel udformning af kliniske forsøg

Henvisning:. Singh IR, Gorzynski JE, Drobysheva D, Bassit L, Schinazi RF (2010) Raltegravir er en potent hæmmer af XMRV, en virus involveret i prostatakræft og kronisk træthedssyndrom. PLoS ONE 5 (4): e9948. doi: 10,1371 /journal.pone.0009948

Redaktør: Peter Sommer, Institut Pasteur Korea, Republikken Korea

Modtaget: Februar 18, 2010; Accepteret: 11. marts 2010; Udgivet: April 1, 2010

Copyright: © 2010 Singh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af NIH tilskud 2P30-AI-50.409 (CFAR til RFS) og ved Department of Veterans Affairs (RFS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. RFS er grundlægger og storaktionær i RFS Pharma, LLC, der er ved at udvikle Amdoxovir klinisk og han modtager royalties fra salget af 3TC. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

xenotropisk murine leukæmi-relaterede retrovirus (XMRV) er et nyligt opdaget smitstof [1 ], der er blevet forbundet med human prostatacancer [2] og kronisk træthedssyndrom (CFS) [3]. Begge sygdomme rammer en stor del af verdens befolkning, med prostatakræft rammer én ud af seks mænd, og CFS påvirker en anslået 0,4-1% af befolkningen [4], [5]. XMRV nukleinsyre eller proteiner findes i 27% af prostatakræft og i 68% af kronisk træthedssyndrom patienter, og på mindre end 4-6% af normale kontroller, hvilket tyder på en forbindelse mellem virus og human sygdom [2], [3 ].

CFS, en sygdom karakteriseret ved alvorlig invaliderende træthed, har haft en usikker ætiologi siden anerkendelsen. Selv om der er foreslået en række virale midler og miljømæssige toksiner at være forbundet med CFS, har ingen klare beviser for disse nogensinde blevet fremlagt (revideret i [6]). Den nylige sammenslutning af XMRV med CFS fra Whittemore Peterson Institute i Reno, Nevada, mens langt fra bevist kausal, er den stærkeste virale forening, der skal foretages endnu. Tre nylige rapporter, der bruger plasmid DNA som positive kontroller, fandt ikke XMRV i CFS patienter i Europa [7] [8] [9]. Forekomsten af ​​XMRV i prostatakræft i Europa er usikkert, med en tysk gruppe rapporterer tilstedeværelsen af ​​XMRV i humane prostata [10], og den anden ikke afsløre nogen [11]. Men den tanke, at et retrovirus kan være involveret i både kræft og en neuro sygdom hos mennesker er ikke uden fortilfælde. Human T-celle lymfotropisk virus, type 1 (HTLV-1), en anden retrovirus, forårsager både T-celle-lymfom /leukæmi samt tropisk spastisk paraparese, en myelopati grund immundefekter som følge af virusinfektion.

Infektiøs XMRV er blevet isoleret fra sera fra CFS patienter [3]. Tilstedeværelsen af ​​cirkulerende infektiøse retroviruspartikler i blodet påberåber et scenario ikke ulig infektion med en anden retrovirus, human immundefekt virus type 1 (HIV-1). Da der ikke er nogen effektiv behandling for denne dybt invaliderende sygdom, at brugen af ​​antiretrovirale midler, der har vist sig rimeligt sikker til human brug, kan være til gavn. Opdagelsen af ​​effektive antiretrovirale midler mod XMRV ville muliggøre rationel udformning af kliniske forsøg til forebyggelse af progression af prostatacancer eller til behandling af CFS.

I denne undersøgelse rapporterer vi effekten af ​​45 forbindelser på XMRV replikation i MCF- 7 og LNCaP-celler, cellelinjer genereret fra humane brystkræft og prostatakræft, hhv. Vi studerede lægemidler anvendt til behandling af HIV-1-infektioner, såvel som forbindelser, der anvendes til behandling af andre virale infektioner i mennesker. XMRV er en gammaretrovirus, nært beslægtet med de murine leukæmi virus (MLV) [1]. På aminosyreniveauet, det deler betydelig identitet med sekvenser af Moloney murin leukæmivirus (MoMLV), en prototype MLV. Den maksimale lighed mellem XMRV og MoMLV-proteiner findes i sekvenserne for viral protease (96% identitet), og den mindste lighed er mellem de to kappeproteiner (66% identitet) [1]. Desværre er det ikke mange aktivt-anvendte antiretrovirale midler er blevet testet for aktivitet mod MLV, med undtagelse af ZDV, som effektivt undertrykker MLV [12], og blev for nylig påvist at være effektiv mod XMRV såvel [13]. Derimod mens der er en masse information om antiviral aktivitet mod væsentlige HIV-1-proteiner, der er meget lidt lighed mellem HIV-1 og XMRV proteiner med proteaser (PR) af de to vira deler 28% identitet på amino syreniveau, revers transkriptase proteiner (RT), der deler 17% og integrase (IN) proteiner deler kun 14% identitet. Denne lave sekvenslighed gør det vanskeligt at forudsige, hvilke, om nogen, af de antiretrovirale midler, der er effektive mod HIV-1 vil være effektiv mod XMRV. Vi valgte en række lægemidler fra hver større klasse af antiretrovirale stoffer: nukleosid og non-nukleosid RT (NRTI og NNRTI), IN hæmmere og PR-hæmmere (PI). Kappeproteinerne af XMRV og HIV-1 er meget forskellige i størrelse (70 kD og 160 kD henholdsvis), anvender forskellige receptorer for viral indgang og ikke deler nogen signifikant lighed. Derfor blev peptidomimetika, der virker på HIV-1-kappeproteinet at forhindre viral indtrængen ikke inkluderet i vores undersøgelse. Enkelte inhibitorer, som vides at inhibere replikation af andre end retrovira vira blev også evalueret. Et betydeligt antal af forbindelser afprøvet i vores undersøgelse, nemlig. 28 ud af i alt 45, der allerede er FDA-godkendt til behandling af infektion med HIV-1 eller andre vira. Vi rapporterer her for første gang, at integraseinhibitor, raltegravir (RAL), er yderst potent og selektiv mod XMRV, når det anvendes i lave mikromolære koncentrationer i begge cellekultursystemer. En anden IN inhibitor, L-000870812, og to NRTI’er, ZDV og tenofovirdisoproxilfumarat (TDF), også hæmme XMRV replikation, men ved højere koncentrationer. Når de kombineres, disse forbindelser vise synergistiske virkninger, hvilket tyder på kombinerede modaliteter til behandling XMRV infektion, dermed forsinke eller forhindre valg af resistente virus.

Resultater

Vi har testet i alt 45 forbindelser, der tilhører forskellige klasser af HIV-1-inhibitorer, og et par inhibitorer af andre end retrovira, for deres evne til at inhibere XMRV replikation i dyrkede celler vira. LNCaP og MCF-7-celler blev valgt for deres evne til at understøtte robust

in vitro

replikation af XMRV. MCF-7-celler, på grund af deres bedre vækstegenskaber i kultur blev oprindeligt anvendt til at teste alle 45 forbindelser (figur 1). Forbindelser med anti-XMRV aktivitet, blev efterfølgende testet i både LNCaP og MCF-7-celler (tabel S1). At afgøre, om en reduktion i viral frigivelse kan skyldes toksicitet af forbindelsen og ikke skyldes specifik antiretroviral aktivitet, blev cellulære morfologi overvåget hver 24 timer ved mikroskopisk undersøgelse, og en MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2- yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid] kolorimetrisk assay blev anvendt til måling potentielle cytotoksicitet produceret af forbindelserne. Supernatanter blev opsamlet hver 24. time og analyseret for viral frigivelse ved måling RT-aktivitet. Inhibering af RT-aktivitet (se figur 2) blev i gennemsnit over 3-6 eksperimenter, som hver blev udført in duplo, og anvendes til at beregne medianen (EF

50) og 90% effektive koncentrationer (EF

90) for hver forbindelse (Figur 1). Til sammenligningsformål blev alle forbindelser evalueret i disse studier også testet mod HIV-1

LAI i primære humane lymfocytter.

Alle forbindelser blev evalueret i to eksemplarer mindst tre gange. De viste værdier er gennemsnit replikater analyser. * (4

S

) -8-chlor-4-methyl-5- (3-methylbut-2-enyl) -3,4,5,6-tetrahydro-1H- [1], [3 ] diazep [4,5,6-cd] indol-2 (2AH) -thion.

inhibitorer af HIV-1 revers transkriptase

følgende NRTI hæmmere af HIV-1 RT blev testet i vore XMRV replikationsassays: ZDV, 3′-azido-3′-deoxyadenosin (AZA), 3′-azido-3′-deoxyguanosin (AZG), 3′-azido-3′-deoxy-5-methyl -cytidin (CS-92), lamivudin (3TC), emtricitabin [(-) – FTC], tenofovir (TNV) og dens prodrug-form TDF, 9- (β-D-1,3-dioxolan-4-yl) guanin (DXG) og dens prodrug-form, amdoxovir (DAPD, AMDX), (-) – carbovir (CBV), stavudin (D4T) og dets tilsvarende cytosin-analog (D4C), Videx (ddl), zalcitabin (ddC), og 3 ‘ fluor-3’-deoxythymidin (FLT). Vi testede også NNRTI’er efavirenz og et TIBO-derivat, der blev vist at være effektiv i en murine system [14]. Blandt disse er de mest potente XMRV inhibitorer var ZDV og TDF (figur 2, A, B). EF

50 og EF

90 i MCF-7-celler var 0,11 uM og 7,3 uM for ZDV og 0,24 pM og 15,3 pM for TDF henholdsvis (se figur 1). EF

50 og EF

90 værdier blev også bestemt i LNCaP-celler, en prostatacancer-cellelinie, og der var en væsentlig forskel på op til 5 gange mellem de to cellelinier, der kan være relateret til deres forskellige satser af nukleosid optagelse og bioomdannelse til den aktive nukleosidtriphosphat analog. EF

50 og EF

90 i LNCaP-celler var 0,14 uM og 1,1 uM for ZDV, og 0,9 pM og 4,2 pM for TDF, henholdsvis. CBV, AZA, FLT og D4T alle viste mere end 70% inhibering af XMRV replikation (se tabel S1), men ved meget højere koncentration på 100 uM. AZG, CS-92, (-) – FTC, 3TC, ddI, DAPD og DXG væsentlige var inaktiv ved 100 pM (figur 1). TFV var også ineffektive mod XMRV, sandsynligvis på grund af dets polære beskaffenhed, som ikke kan tillade tilstrækkeligt lægemiddel til at trænge ind i cellerne. Den NNRTI’er efavirenz (EFV) og TIBO derivat, viste ikke nogen større aktivitet mod XMRV.

Viral frigivelse fra XMRV-inficerede LNCaP cellerne i nærvær af stigende koncentrationer af (A) ZDV (B) TDF ( C) RAL og (D) L-000.870.812, blev bestemt ved måling RT-aktivitet i supernatanterne. Procent inhibering blev beregnet på grundlag af inficerede celler udsat for DMSO alene blive sat til 0% hæmning, og naive celler i mangel af forbindelser, der er 100% hæmning. Cellelevedygtighed blev kontrolleret ved mikroskopi, kvantificeret ved MTT-assayet, og repræsenteret af skraverede søjler. Data for hver forbindelse blev afledt fra et gennemsnit af mindst tre uafhængige forsøg, hver udført i to eksemplarer.

inhibitorer af HIV-1 integrase

I hæmmere raltegravir (RAL eller MK 0518) og L-000.870.812 [15] blev også vurderet for deres evne til at inhibere XMRV i de to cellesystemer (Figur 1, Figur 2 C og D). Af alle de testede forbindelser, RAL var den mest potente, med et EF

50 0,005 pM og en EF

90 på 3,5 uM i MCF-7 celler, og en EF

50 0,03 pM og en EF

90 på 0,46 uM i LNCaP-celler (tabel S1). L-000870812, viste aktivitet mod XMRV replikation ved betydeligt højere koncentrationer, med en EF

50 og EF

90 af 0,16 uM og 26,9 uM i MCF-7 celler, og 0,7 uM og 4,5 uM i LNCaP celler, henholdsvis .

inhibitorer af HIV-1 Protease

ni kendte HIV-1 PI blev bedømt for aktivitet mod XMRV (figur 1). Den mest effektive var nelfinavir, om end med en EF

50 af 34,3 uM. Følgende proteasehæmmere havde meget beskedne anti-XMRV aktiviteter: atazanavir (EF

50 af 64,8 uM), amprenavir (EF

50 af 68,0 uM), lopinavir (EF

50 af 72,2 uM) og ritonavir ( EF

50 af 76,4 uM). Darunavir, indinavir, saquinavir og tipranavir væsentlige var ineffektive mod XMRV

in vitro

, når testet op til 100 uM.

Hæmmere af andre vira end HIV-1

En vælg antal antivirale midler, der vides at hæmme andre end retrovira vira blev også evalueret. Disse omfattede anti-herpes lægemidler acyclovir (ACV), ganciclovir (GCV), vidarabin (ara-A), 5-iod-2′-deoxyuridin (IdUrd), penciclovir (PCV), foscarnet (PFA), VISTIDE (HPMPC) ; anti-hepatitis narkotika entecavir (ETV), telbivudin (LdT), og ribavirin (RBV). ETV blev også valgt, fordi det for nylig blev rapporteret at inhibere HIV-1 replikation, både

in vitro

i mennesker [16]. Andre forbindelser hævdes at være effektiv mod XMRV, MLV, HIV-1 og andre vira, såsom chloroquin [17], dehydroepiandrosteron (DHEA) [18], methylenblåt og aspirin blev også evalueret for anti-XMRV aktivitet

in vitro

. Methylenblåt vides at have antiherpetic aktivitet og også kan inaktivere HIV-1 [19]. Desværre er de fleste af forbindelserne anført ovenfor, bortset IdUrd var ineffektive mod XMRV, eller var effektive ved toksiske koncentrationer (figur 1). IdUrd viste en lav terapeutisk indeks (TI, forholdet mellem CC

50 /EF

50) og kan ikke betragtes som en specifik antiviral middel mod XMRV.

Kombi effekter af aktive forbindelser på XMRV replikation

Binære kombinationer af de mest potente forbindelser, nemlig. RAL, L-000870812, TDF og ZDV blev testet for aktivitet mod XMRV i LNCaP celler. Forbindelser blev testet ved stigende koncentrationer, i tre forskellige sæt, med forholdet mellem de to forbindelser holdes konstant. Dataene blev analyseret ved anvendelse af CalcuSyn metoden oprindeligt beskrevet af Chou og Talalay [20]. En sammenfatning af resultaterne for alle kombinationer evalueret i LNCaP celler er præsenteret i figur 3.

Kombination Index (CI) værdier blev bestemt for en gensidigt udelukkende interaktion ved hjælp CalcuSyn program, hvor CI 1 angiver synergisme, CI = 1 angiver additiv virkning, og CI 1 angiver antagonisme. Vægtet gennemsnit CI-værdi (CI

wt) blev tildelt som [CI

50 + 2CI

75 + 3CI

90 + 4CI

95] /10. RAL, raltegravir; TDF, tenofovirdisoproxilfumarat; . ZDV, zidovudin

For de testede kombinationer (RAL med TDF eller ZDV eller L-000.870.812; TDF med ZDV eller L-000.870.812, L-000870812 med ZDV), et tilsætningsstof eller det meste synergistisk interaktion var noteret på alle effektniveauer uden tilsyneladende cytotoksicitet ved de højeste koncentrationer, der anvendes. I den beregningsmæssige analyse for den ene af de fire stoffer (RAL, TDF, L-000.870.812, eller ZDV), den lineære korrelationskoefficient (

r

værdier) af medianen-effekt plot eller for deres konstant forhold kombinationer varierede fra 0,92 til 0,99 (data ikke vist), der matcher loven af ​​masse-handling.

in vitro

effekt af kombinationen af ​​RAL med enten TDF eller ZDV, viste en gunstig dosisreduktion på alle nøgletal. Derudover er alle kombinationsindeks (CI) værdier (se materialer og metoder) var mindre end 1, hvilket tyder på synergi, når kombinationen forhold af enten TDF eller ZDV og RAL blev analyseret (figur 3). Desuden blev to kombinationer af enten ZDV og L-000870812 eller TDF også testet. De vægtede CI (CI

wt) værdier på 0,1 til 0,5 for TDF + ZDV, angivet synergistiske virkninger på alle testede forhold (Figur 3). Desuden dobbelte kombination af L-000870812 og ZDV på forholdet 01:02 indikerede en næsten additiv virkning (CI

wt på 1,0); dog var på forholdet 1:0.4, CI-værdien var 0,3, hvilket indikerer synergisme (figur 3). Af betydning var, at alle dobbelte kombinationer indeholdende RAL, den mest potente antivirale middel mod XMRV, demonstrerede markant synergi på alle effektniveauer uden nogen tilsyneladende cytotoksicitet. Interessant, kombinationen af ​​de to i inhibitorer ikke antagonistisk eller additiv, men viste sig at være synergistisk, hvilket antyder, at disse to forbindelser kan have forskellige antivirale mekanismer (se diskussionen).

Discussion

i mangel af en klar ætiologi, har behandling af CFS været både empirisk og ukonventionelle. Terapier har indbefattet immunstimulerende terapi gennem injektioner af staphylococcus toxoid [21], intravenøs immunoglobulin terapi [22] [23], [24], og hydrocortison [25] hver med ujævne resultater. Interferon-β og TNF-α inhibitorer er blevet prøvet i meget små antal patienter. Anti-depressiva, NSAID’er, anxiolytiske lægemidler, stimulanser, anti- allergi lægemidler og anti-hypotensive lægemidler er alle blevet anvendt, men er ikke universelt gavnlig [26]. Manglen på effektiv behandling har ført til brug af planteekstrakter [27], homøopati [28], [29], hypnose [30], akupunktur [31], og hele kroppen periodiske acceleration stress [32], ingen med vedvarende fordele. De eneste retningslinjer for behandling, der har nogen dokumenterede fordele er kognitiv adfærdsterapi og gradueret træningsprogrammer, som begge synes at hjælpe ved at forbedre mestringsstrategier i stedet reducere symptomerne [33]. Hvis XMRV viser sig at have en årsagssammenhæng med human sygdom, så den viden, at visse antiretrovirale lægemidler hæmmer XMRV på end mikromolære koncentrationer

in vitro

, og har synergistiske virkninger når de kombineres, som vist i denne undersøgelse, kan føre til kliniske forsøg. Vi fandt, at RAL, L-000870812, ZDV, og TDF kraftigt inhiberer XMRV i cellekultur, med RAL er den mest potente, ved en EF

50 af 0,005 pM, og andre, såsom L-000870812 (EF

50 = 0,16 uM), ZDV (EF

50 = 0,11 uM) og TDF (EF

50 = 0,24 uM) er ganske effektiv samt. Desuden er disse forbindelser havde høje terapeutiske indekser, med værdier for ZDV = 591; TDF = 218; RAL = 18.460 og L-000.870.812 = 378, hvilket indikerer, at det bør være muligt at opnå terapeutiske antivirale niveauer med minimal toksicitet.

Flere forbindelser, vi evaluerede haft en begrænset effekt på XMRV replikation

in vitro

. Nogle af disse virkninger kan forklares ved øjeblikket forstået mekanismer. For eksempel har både 3TC og (-) – FTC brug for en funktionel YMDD- motiv i RT for at være aktiv. M184V mutation i HIV-1 RT laver virus resistent over for 3TC og (-) – FTC [34]. Disse lægemidler er ineffektive mod MoMLV, fordi i MoMLV RT, V er den naturlige rest i dette motiv i stedet for M. Tilsvarende V er også den naturlige rest ved denne placering i XMRV RT, hvilket gør 3TC og (-) – FTC ineffektiv. Hvorfor ingen af ​​de HIV-1 proteasehæmmere var effektiv mod XMRV (en konstatering af, at der er rapporteret valgt PI før [13]) forbliver uklart på dette tidspunkt, men kan være relateret til størrelsen af ​​PI lomme samt andre biokemiske og strukturelle faktorer.

der var en forskel i aktiviteter af forbindelser, når de testes i forskellige celletyper, som kan være relateret til lægemiddeloptagelse af celler, de forskellige naturlige dNTP i cellerne, samt forskellige intracellulær phosphorylering kapacitet [35]. Generelt EF

50 for de aktive forbindelser, der er anført ovenfor var lavere i MCF-7 end LNCaP-celler tyder større styrke. I forhold til HIV-1, er forbindelserne var generelt mindre potent mod XMRV end HIV-1, især på EF

90-niveau.

Brugen af ​​monoterapi til behandling af HIV-infektioner har ført til fremkomsten af ​​narkotika resistent virus [36], [37]. Konstateringen af, at RAL, L-000870812, TDF og ZDV har stærke synergistiske virkninger, når de kombineres i dobbelt kombination lover godt for kombinationsbehandling i tilfælde af XMRV infektion. Hvis XMRV infektion paralleller andre retrovirale infektioner, så brugen af ​​antiretroviral kombinationsbehandling kan opretholde XMRV undertrykkelse, forhindre fremkomsten af ​​resistens over for antiretrovirale midler og muligvis også forårsage forbedring af sygdom. For HIV-1, kombinationsterapi virker specielt godt, når de kombinerede lægemidler har forskellige virale protein-targets, eller i tilfælde af nukleosider, udnytte forskellige kinaser for deres aktivering til NTP-analoger [31]. Vi har derfor skønsmæssigt vælges lægemiddelkombinationer, der hæmmer XMRV, såsom RAL med ZDV eller TDF eller L-000.870.812. Når dataene blev analyseret under anvendelse af robust metode til Chou og Talalay, var additive eller synergistiske interaktioner fundet ved alle effektniveauer, når disse midler blev testet i LNCaP-celler. Af betydning var, at ingen antagonisme blev bemærket for nogen af ​​kombinationerne evalueret i disse celler. Til vores overraskelse, selv de to IN hæmmere viste en synergistisk effekt. Både i inhibitorer virker ved at hæmme streng transfer reaktion, men hvis deres virkningsmekanisme var at være identiske, ville de vise en additiv effekt i kombination. En synergistisk effekt tyder på, at der kan være subtile mekanistiske forskelle i handlinger disse to i inhibitorer, en konstatering af, at støttes af ikke offentliggjorte biokemiske eksperimenter (personlig kommunikation, Dr. Daria Hazuda, Merck Research Laboratories, West Point, PA). Det er vigtigt at bemærke her, at XMRV afviger fra HIV-1 i et aspekt, der er væsentlig for disse undersøgelser: XMRV isolater viser meget begrænset sekvensdiversitet sammenlignet med HIV-1 eller MLV. Af alle de sekventeret XMRV isolater, der i øjeblikket findes, både fra tilfælde med prostatakræft samt CFS, opnået fra geografisk fjerne dele af USA, de to mindste relaterede genomer adskiller sig fra hinanden i kun 27 ud af i alt på over 8100 nukleotider. Der er fundet en tilsvarende grad af begrænset genetisk diversitet for HTLV-1 [38], en anden retrovirus impliceret i både kræft og neuro sygdom. Det er blevet foreslået, at denne manglende diversitet i XMRV sekvenser betyder, at antallet af replikering cyklusser inden for en inficeret individ er begrænset [39]. Dette vil foreslå, at XMRV har et betydeligt lavere potentiale for at udvikle resistente mutationer, sammenlignet med HIV-1. Endvidere er det sandsynligt, at en kombination af blot to lægemidler kan være tilstrækkelig til at forhindre, at der opstår resistente mutant virus, selvom dette vil skulle testes, før eventuelle terapeutiske anbefalinger kan foretages. Vi har forsøgt at vælge for RAL resistente vira i kultur i flere måneder nu, og har endnu ikke haft succes på at isolere resistente virus narkotika.

Når en analyse til måling af XMRV virale belastninger bliver tilgængelige, virus i blodet kan blive en objektiv surrogatmarkør for et effektivt svar på antivirale lægemidler, ud over de kliniske resultater. Selv om det endnu ikke er klart, om nogen sygdomme er direkte forårsaget af XMRV, indikerer vores data, at XMRV infektioner kan forebygges eller behandles med specifikke antivirale midler. Ved tilstedeværelse af bevis for kausalitet af sygdom hos mennesker, bør vores resultater danne grundlag for at designe kliniske forsøg for at behandle dem.

Materialer og metoder

XMRV, Celler og Infektion med XMRV

293T-celler (ATCC, CRL-11268) blev transficeret med pXMRV1, en infektiøs klon af XMRV [2]. Virus frigivet i supernatanten blev høstet og titreret ved inokulering MCF-7 celler, en brystcancer-cellelinie (ATCC, HTB-22) ved 70% konfluens, med en serie af ti-folds fortyndinger af XMRV i serum-frit medium, efterfulgt 36-48 timer senere ved fiksering af celler i paraformaldehyd og behandling til immunfluorescens under anvendelse af et kanin-antiserum udviklet mod inaktiveret XMRV [2]. Typiske viruspræparater gav titere på ca. 2-5 × 10

6 infektiøse enheder /ml. Virus blev fortyndet i serumfrit medium og anvendt til at pode celler ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på ca. 3, i nærvær af forskellige antivirale forbindelser som beskrevet nedenfor. LNCaP, en prostatacancer-cellelinie (ATCC, CRL-1740) og MCF-7-celler blev dyrket til ca. 50% konfluens i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 ug /ml penicillin, og 100 IU /ml streptomycin. Celler blev vasket to gange med Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS, Gibco) og inkuberet med det virale inokulum i 90 min ved 37 ° C i nærvær af 95% luft og 5% CO

2 blev cellerne vasket to gange med DPBS , fritliggende med trypsin-EDTA (0,25% trypsin, Cellgro), og tælles. Et tusinde celler blev sat til hver brønd i en plade med 96 brønde, sammen med et tilsvarende volumen af ​​medium indeholdende den retrovirale inhibitor ved 2 gange den ønskede koncentration. Inhibitorer blev opløst i DMSO eller vand, afhængigt af deres opløselighed, og blev alle testet ved 0,01 til 100 pM i trin 10-fold. Hvor fandtes lægemidlet at være aktiv ved 0,01 uM, blev yderligere fortyndinger fra 1 nM til 0,01 nM testet. Hver inhibitor blev testet in duplo mindst tre separate gange i MCF-7 celler i en helt blind måde under anvendelse kodede forbindelser, og resultaterne beregnes. Aktive forbindelser blev også bedømt for antiviral aktivitet i LNCaP-celler for at bekræfte aktivitet i en sekundær cellelinie kendt for at støtte XMRV replikation. For kontrol, blev brønde, der indeholder vand eller DMSO ved passende koncentrationer anvendes.

Analyser for cytotoksicitet og XMRV replikering

Hver brønd blev omhyggeligt overvåges for tegn på cellulær toksicitet på grund af inhibitorer ved mikroskopisk undersøgelse hver 24 timer. Desuden blev cellelevedygtighed målt ved anvendelse af CellTiter 96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay ifølge producenten (Promega, Madison, Wis). Viral frigivelse fra cellerne blev analyseret ved måling RT-aktivitet i supernatanten. Til dette blev supernatanten fra hver brønd opsamlet hver 24. timer og frosset ved -20 ° C, indtil den blev analyseret ved RT-assay for viral frigivelse som tidligere [40] beskrevne. Kort fortalt, oligo (dT) · poly (RA) primer-template-assays blev udført i nærværelse af radioaktivt mærket [α-

32P] dTTP og Mn

2+. Efter inkubering af virale supernatanter med RT-reaktionsblandingen i 1 time ved 37 ° C, blev prøver spottet på DE81 DEAE cellulose (Whatman) og ikke-inkorporeret mærke skyllet væk med 2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl og 0,015 M natrium citrat). Virion-associerede RT blev analyseret ved hjælp af en Typhoon 9410 Phosphorlmager (GE Healthcare) og kvantificeret med Image J software (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Hæmning af viral frigivelse målt på dag 6 efter podning blev gennemsnit over 3-5 eksperimenter og plottet. Den antivirale EF

50 og cytotoksiske koncentrationer (CC

50,) blev bestemt ud fra koncentration-respons-kurve under anvendelse midterplan virkning metoden [20]. HIV-1 blev udført replikationsassays som tidligere beskrevet under anvendelse mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) opnået fra amerikansk Røde Kors, Atlanta, GA, der blev stimuleret med phytohæmagglutinin (PHA) i 72 timer [41].

kombination undersøgelser

for at vurdere, om de antivirale virkninger af dobbelt stof kombinationer af: RAL med TDF eller ZDV eller L-000870812; TDF med ZDV eller L-000870812; L-000870812 med ZDV var synergistiske, additive eller antagonistiske blev lægemiddelkombinationer på flere konstante forhold evalueret. RAL, L-000870812, ZDV og TDF blev først testet alene at bestemme EF

50 og EF

90 værdier, mindst tre gange, hver i to eksemplarer. For median-effekt-analyse, blev forbindelserne kombineres på flere nøgletal baseret på multipla af deres EF

50 eller EF

90 værdier. For hvert lægemiddel (alene eller i kombination), blev tre til fire uafhængige forsøg udført, og samtlige prøver blev behandlet i duplikat. Analyse blev udført ved hjælp af softwaren CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, USA) (se figur 3 for CI-værdier), der tillader automatiseret simulering af synergi og antagonisme på alle doser og effektniveauer og viser metoder til Chou og Talalay [20] , herunder median effekt plot og Cl-værdier. Fordi den høje grad virkninger er mere terapeutisk relevant end den lave grad af effekter, blev yderligere vægtede gennemsnit CI (CI

vægt) beregnet, som bruger formlen: CI

vægt = [CI

50 + 2CI

75 + 3CI

90 + 4CI

95] /10, hvor CI

50, CI

75, CI

90, CI

95 er Cl-værdier ved 50 %, 75%, 90% og 95% inhibering, hhv. [20], [42].

Støtte Information

Tabel S1.

EC50, EC90 og CC50-værdier af forbindelser er aktive mod XMRV i MCF-7-celler, som testes i XMRV-inficerede LNCaP-celler. Forbindelser, der findes at have signifikant aktivitet i MCF-7-celler blev testet i LNCaP-celler for aktivitet. Alle forbindelser blev evalueret i dublerede mindst tre gange. De viste værdier er gennemsnit replikater analyser. Tilsvarende værdier i MCF-7 celler er vist for sammenligning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0009948.s001

(0,11 MB TIF)

Tak

Vi takker Mervi Detorio og Melissa Johns for deres fremragende teknisk bistand, og Daniel Choe og Robert Schlaberg for deres hjælp med indledende forsøg.