PLoS ONE: RhoE Fremmer Metastase i Gastric Cancer gennem en mekanisme Afhængig Øget ekspression af CXCR4

Abstrakt

RhoE, et nyt medlem af Rho protein familien, er en central regulator af cytoskelettet og celle migration. Vores gruppe har tidligere vist, at RhoE som et direkte mål for HIF-1α og medierer hypoxi-induceret epitelial til mesenkymale overgang i gastriske kræftceller. Derfor antog vi, at RhoE kan spille en vigtig rolle i gastrisk cancer metastase. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt den rolle, RhoE ekspression i gastrisk cancer, celleinvasion og metastase, og indflydelsen fra RhoE om regulering af potentielle ekspression af down-stream-gener. RhoE ekspression blev forhøjet i gastrisk cancer væv sammenlignet med normale gastriske væv. Vi fandt også en tæt sammenhæng mellem den histologiske grad og diagnosticering af patienten. Opregulering af RhoE væsentligt forbedret de vandrende og invasive evner gastriske kræftceller både

in vitro

in vivo

. Desuden nedregulering af RhoE formindsket metastatiske potentiale cancerceller. PCR array og efterfølgende transwell assay viste, at reguleringen af ​​gastrisk cancer metastaser af RhoE delvist medieret af CXCR4. Denne observation tydede på, at CXCR4 kunne være en nedstrøms effektor for RhoE. Sammenfattende vores undersøgelse identificeret RhoE som en ny prognostisk biomarkør og metastatisk-fremmende gen af ​​mavekræft

Henvisning:. Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang H, Shang Y, et al. (2013) RhoE Fremmer Metastase i Gastric Cancer gennem en mekanisme Afhængig Øget ekspression af CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10,1371 /journal.pone.0081709

Redaktør: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: 11 januar, 2013; Accepteret: 24 Oktober 2013; Udgivet: November 29, 2013 |

Copyright: © 2013 Feng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Basic Research Program Kina (No: 2009CB521700), National High Technology Research and Development Program Kina (No: 2006AA02A253) og National Science and Technology støtte Program under ellevte femårsplan periode (No: 2006BAI02A14). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i verden og tumor metastase er den største hindring for en vellykket behandling og den største årsag til patientens dødelighed [1,2]. I årtier har talrige undersøgelser forsøgt at forstå de processer og mekanismer i metastaser i mavekræft. I de senere år har det vist sig, at epitelial mesenkymale overgang (EMT) er af afgørende betydning i denne proces og i høj grad bidrager til cancercelleinvasion og metastase. En mulig årsag er, at i løbet af EMT er cytoskelettet fundamentalt modulerede, der fører til spredning af tumorceller [3].

RhoE tilhører en undergruppe af Rho proteiner, som spiller en nøglerolle i cytoskeleton dannelse , cellemotilitet, cellecyklus og apoptose [4,5]. I modsætning til de typiske Rho proteiner, som cyklus mellem en aktiv GTP-bundne tilstand og en hvilende BNP-bundne tilstand, mangler RhoE iboende GTPase aktivitet og præsenterer altid som den aktive GTP-bundne form [6]. Denne unikke funktion angiver, at funktionen af ​​RhoE væsentlige er reguleret gennem sit udtryk snarere end af dets aktivitet.

For nylig flere undersøgelser vist, at unormal ekspression af RhoE var forbundet med carcinogenese og at RhoE kan virke enten som et tumorsuppressorgen eller et onkogen, afhængigt af oprindelsen af ​​cancer [7-9]. Tilsvarende har RhoE varierende påvirkninger af metastaser i forskellige cancere. I melanom, RhoE støtter migration og invasivitet af tumorceller ved at regulere actincytoskelettet [10]. Men i hepatocellulært carcinom, RhoE repræsenterer sig selv, som en suppressor protein tumormetastaser [11,12].

Tidligere vores gruppe har fundet, at RhoE blev forbedret i gastriske kræftceller ved induktion af HIF-1α udtryk under hypoxiske betingelser og fremmet EMT af gastriske cancerceller [13]. Således har vi den hypotese, at RhoE kan have et positivt bidrag i metastase af mavekræft. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi effekten af ​​RhoE på metastaser af gastrisk kræftceller og de underliggende mekanismer.

Materialer og metoder

Cell Culture

Den menneskelige gastrisk adenocarcinom cellelinier SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III og de normale gastrisk slimhinde celle-line GES blev bevaret i vores institut [14-16]. Derudover mavekræft celle- linje SGC7901-M, som har en høj metastatisk potentiale, og SGC7901-NM, som har en dårlig metastatisk evne, blev etableret og opretholdt i vores institut [17]. Alle celler blev holdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) og dyrket ved 37 ° C i en fuldt befugtet atmosfære af 5% CO2.

Tissue Array

For Immunofarvning applikationer blev to væv arrays af menneskelig mavekræft kommercielt indkøbt fra overgå Biotech Co. Ltd (Shanghai, Kina). Et væv vifte indeholdt 90 tumor væv pletter og matches tilstødende ikke-tumor væv pletter, der blev indhentet fra 90 patienter (med 5.3-6.1 års opfølgning). Fabrikanten forudsat køn, alder og klinisk-patologiske parametre for patienterne. Den anden række indeholdt 120 pladser med 40 primære tumor væv spots, 40 matchede tilstødende ikke-tumor væv pletter, og 40 matchede lymfekirtelmetastaser pletter.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført ved hjælp Histostain ™ Plus kits (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Kina) i henhold til producentens anvisninger. Den muse-anti-RhoE antistof (fortyndet 1: 100; Upstate, MA, USA) eller anti-CXCR4 antistof (fortyndet 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, USA) blev anvendt i IHC assay som første antistof. Muse-IgG blev anvendt i stedet for det første antistof som negativ kontrol i disse forsøg. Det opnåede resultat blev semikvantitativt evalueret ved at tildele scorer for intensiteten af ​​immunoreaktivitet og for den andel af celler positivt farvede som beskrevet af andre. Intensiteten af ​​immunoreaktivitet blev inddelt i fire kategorier og scorede som fraværende (-; score: 0), svag (+; score: 1), moderat (++; score: 2), eller stærk (+++; score: 3 ) ifølge den farvningsintensitet der blev observeret i de fleste af gastriske epitelceller. Andelen af ​​positive celler blev klassificeret i fire grupper: (1), 0-25% af tumorcellerne udviser immunreaktivitet; (2), 25-50% af celler; (3), 50-75 procentpoint af celler; og (4), 75-100% af cellerne. Den samlede score var produktet af to [18].

Western blot-analyse

Proteinprøver blev ekstraheret fra celler eller væv ved sonikering i en lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris -HCI (pH 8,8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin) på is, derefter centrifugeret ved 12.000 rpm i 10 min. Proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE og elektrooverført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, CA, USA). Ikke-specifik binding blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur. Membranen blev derefter separat inkuberet med anti-RhoE antistof (fortyndet 1: 400; Upstate, MA, USA), anti-CXCR4 antistof (fortyndet 1: 1000; Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-VEGFA antistof (fortyndet 1 : 500; Abcam, MA, USA), anti-CD82-antistof (fortyndet 1: 1000; Abcam, MA, USA), anti-CTSK antistof (fortyndet 1: 1000; Santa Cruz, Texas, USA) eller β-actin-antistof ( fortyndet 1: 10000; Sigma-Aldrich, MO, USA) natten over ved 4 ° C. Efter fire vaske med TBS-T puffer blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1: 2000; Santa Cruz, Texas, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Efter 4 vaske med TBS-T puffer blev båndene fremkaldt med SuperSignal Chemiluminescent Substrat (Thermo Scientific, MA, USA) for at visualisere proteinerne. Blots blev derefter analyseret ved Mængde One ® software (version 4.2. Bio-Rad, CA, USA) efter brugsanvisningen. Western blot for β-actin-ekspression blev anvendt som en intern kontrol.

ektopisk ekspression og siRNA-medieret Silencing

I ektopisk ekspression af målgener, gastriske cancerceller blev transduceret med lentivirus vektor, der udtrykker RhoE eller CXCR4 (leveret af GeneChem, Shanghai, Kina). Kort beskrevet blev celler udpladet og dyrket til 75 til 80% konfluens uden antibiotika, hvorefter de lentivirale vektorer blev tilsat til cellerne i vækstmedium indeholdende polybren (2 ug /ml) ved en MOI på 50. Derefter celler blev dyrket i en anden 72 timer og infektionen effektivitet blev kontrolleret ved fluorescensmikroskopi og Western blot analyse. Interferens af human RhoE eller CXCR4-ekspression blev opnået ved anvendelse af en RNA-interferens teknik. siRNA-duplexer blev syntetiseret af Takara Bioteknologi (Liaoning, Kina) og de målrettede sekvenser af RhoE eller CXCR4 blev defineret således:

RhoE, 5′-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ‘;

CXCR4, 5′-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 ‘.

Kontrol siRNA-duplexer var designet efter afhøre BLAST database med ikke-specifikke målretning sekvenser. Celler blev transficeret med oligonucleotidduplexer vha LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA) ifølge producentens anvisninger, hvorefter de blev udsat for yderligere analyser 48 timer efter transfektion.

sårheling Assay

For at detektere celle motilitet blev eksponentielle fase celler udsået i 6-brønds plader. Efter at cellerne nåede konfluens som et monolag af celler på pladen substrat, blev en plast pipettespids trækkes hen over midten af ​​pladen for at fremstille en ren 1 mm brede sårområdet, og mediet blev erstattet med frisk RPMI1640 indeholdende 1% føtalt bovint serum . Efter 48 timer blev cellebevægelse i såret område vurderes under anvendelse af en fasekontrastmikroskop som beskrevet tidligere [19,20].

Invasion Assay

celleinvasion assays blev udført ved anvendelse af et transwell plade (Corning, NY, USA) belagt med Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). Kort beskrevet Matrigel blev fortyndet til en koncentration på 2 mg /ml, og 50 pi af denne opløsning blev anbragt i en polycarbonat filter og lufttørres. Efter skylning med PBS blev filtrene anbragt i brøndene, og 700 pi RPMI-1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Celler blev resuspenderet i RPMI-1640 indeholdende 1% FBS og 1 × 105 celler i 0,2 ml defineret medium blev udpladet i det øverste kammer. Celler i invasionen kamre blev inkuberet i en befugtet inkubator i 12-48 timer. Efter yderligere inkubation blev celler, som trængte de membranens porer og dispergeret til den nedre overflade af filtrene farvet med 5% krystalviolet opløsning til visualisering. Dernæst blev invaderede celler i hver brønd talt under et lysmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) og kvantificeret fra visualisere fem tilfældige felter ved en forstørrelse på × 200 og gennemsnittet beregnes som beskrevet af Albini [21]. Invasionen assay blev gentaget 3 gange. Værdien af ​​søjlediagrammet repræsenterer det gennemsnitlige antal invaderede celler fra 3 separate forsøg.

halevenen Metastatisk Assay

halevenen metastatisk assay blev bestemt som tidligere beskrevet [22]. Tredive mandlige nøgne mus blev håndteret ved hjælp bedste human praksis og blev plejet i overensstemmelse med NIH Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Celler blev høstet under anvendelse af trypsin og vasket tre gange med PBS. Mus blev derefter injiceret med 1 × 106 celler i 0,1 ml PBS gennem halevenen injektion. Musene blev derefter overvåget for generelle sundhed og total kropsvægt. På den 28. dag efter injektion blev musene aflivet. Lunge- og levervæv blev observeret med det blotte øje, og antallet af synlige tumorer på lunge og lever overflade blev kvantificeret. Lunge- og levervæv blev skåret i serielle snit, farvet med hematoxylin og eosin, derefter observeret under et lysmikroskop. Eksperimentelle og kontrolgrupper hver indeholdt 6-mus. Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Experimental Animal Welfare og etiske komité, den fjerde Military Medical University. Dyreforsøg blev udført med godkendelse af Institutional udvalg for Animal Research, i overensstemmelse med de nationale retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.

Tumor Metastase PCR Array

udtryk for metastasis- associerede gener blev bestemt ved human tumormetastase PCR Array (PAH-028A, SuperArray Biosciences, Maryland, USA) ifølge producentens instruktioner. Først blev totalt RNA ekstraheret fra RhoE-lentviral inficerede SGC7901 celler og kontrolceller ved anvendelse af standard protokoller, som derefter blev omdannet til første-streng-cDNA. CDNA-skabelon blev kombineret med en 2 × SuperArray PCR Master Mix, tilsat til brøndene af en PCR Array plade (384 brønde) indeholdende genspecifikke primersæt og underkastet real-time PCR. PCR cycling var som følger: 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min og 72 ° C i 30 s. Fem husholdning gener blev brugt som interne kontroller. Fold-ændring i ekspressionen af ​​metastase-relaterede gener blev bestemt ved ΔΔCt metoden.

Statistical Analysis

Dataanalyse blev udført ved anvendelse af SPSS 17.0 statistisk analyse software (Chicago, IL, USA). Mann-Whitney U test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​forskelle i frekvensen af ​​ekspression af RhoE mellem mavekræft væv og lymfeknudemetastaser. Den Kruskal-Wallis H test for multi-grupper, og Mann-Whitney U test for to gruppe sammenligninger var ansat til at analysere forholdet mellem de to RhoE ekspressionsniveauerne og forskellige klinisk-patologiske faktorer af mavekræft prøver. Kumulativ overlevelsestid blev beregnet under anvendelse af Kaplan-Meier overlevelse fremgangsmåde og analyseret ved log-rank test. Univariate og multivariate analyser var baseret på Cox proportionel risiko regressions model. Sammenligninger af kvantitative data blev analyseret ved Students t-test mellem to grupper. Sammenhæng analyse mellem ekspressionen af ​​RhoE og CXCR4 blev estimeret ved Spearman rang korrelation metode. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når P 0,05.

Resultater

Over-ekspressionen af ​​RhoE er korreleret med differentiering kvalitet og tumor iscenesættelse i mavekræft væv og indikerer en dårlig prognose for patienter

Udtrykket af RhoE i gastrisk cancervæv, hosliggende ikke-tumorvæv og relaterede metastatisk lymfeknude væv blev undersøgt ved immunhistokemi (figur 1A). RhoE ekspression blev fundet svagt udtrykt eller endog fraværende i tilstødende ikke-tumorvæv (a), mens dets ekspression var betydeligt højere i gastrisk cancer væv og lymfeknudemetastaser (b-e). Dernæst analyserede vi forholdet mellem RhoE farvning og klinisk-patologiske parametre for mavecancerpatienter (tabel 1). Resultaterne viste, at hverken køn eller alder var korreleret med ekspressionen af ​​RhoE. Imidlertid steg RhoE ekspression blev statistisk korrelation mellem graden af ​​differentiering (P = 0,005) og tumor staging, som bestod af tumorstørrelse (T, P 0,001), lymfeknude invasion (N, P = 0,001), og fjernmetastase (M, P = 0,003). Desuden viste Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, at patienter med høje ekspressionsniveauer af RhoE, præsenteret med en kortere samlet overlevelse sammenlignet patienter med negativ udtryk for RhoE (figur 1B). Multivariate Cox proportional farer model vurderinger viste, at niveauerne af RhoE udtryk var en uafhængig og væsentlig faktor for overlevelse i mavecancerpatienter (tabel S1).

(A), immunhistokemisk analyse af RhoE i væv; (A), normal gastrisk epitel; og (b) veldifferentieret, (c) moderat differentieret eller (d) dårligt differentieret gastrisk cancer væv; (E) metastatisk site i lymfeknude. Brun farvning betegner positiv RhoE farvning. (B), Kaplan Meier postoperativ overlevelse kurve som funktion af RhoE ekspression. (C), Western blot-analyse af RhoE ekspression i forskellige gastriske cellelinier. β-actin blev anvendt som intern kontrol. De relative ekspressionsniveauer af RhoE i gastrisk cancer cellelinjer blev præsenteret som søjlediagrammer. * P. 0,05 Vejviser Expression niveau RhoE

Kategori

n –

+

++

+ ++

P value

Total9014283216Age0.421≤6041610187 6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005

aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT 0.001

aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001

bN031111073N1-N3593182513M0.003

bM08014272811M1100145Table 1. Statistisk analyse af immunhistokemisk analyse

a, Kruskal-Wallis H Test.;

b, Mann-Whitney U test CSV download CSV

Efterfølgende undersøgte vi ekspressionsniveauerne af RhoE i primære gastrisk cancer væv og deres matchede metastatisk lymfeknude væv. Ekspressionsniveauerne af RhoE var fraværende i 7 gastrisk cancer væv, svagt udtrykt i 16 patienter gastrisk cancer, moderat udtrykt i 11, og stærkt udtrykt i 6 cancervæv hhv. Derimod i lymfeknudemetastaser det tilsvarende antal var 3, 12, 14 og 11. Endvidere ekspressionen af ​​RhoE var signifikant højere i metastatiske lymfeknudeceller væv end der findes i primære cancervæv. Disse observationer indikerede, at RhoE udtryk var korreleret med metastaser i gastrisk cancer (tabel 2, P 0,05).

Expression niveau RhoE

Histologisk typen

n

–

+

++

+++

P Value

Primær kræft tissues407161160.048

* lymfeknude metastases403121411Table 2. Expression af RhoE i Primary Cancer væv og matchede lymfekirtelmetastaser .

* Wilcoxon Rank Sum CSV download CSV

Ekspression af RhoE i cellelinier blev analyseret ved Western blot (fig 1C). Vi fandt, at sammenlignet med den i den GES cellelinje, ekspressionen af ​​RhoE var signifikant højere i forskellige gastrisk cancer-cellelinjer. Desuden er niveauet af RhoE proteinekspression var signifikant højere i det stærkt invasive SGC7901-M-celle delaktionslinje end i mindre invasiv celle delaktionslinje SGC7901-NM. Derfor yderligere undersøgelser af tumor metastaser blev færdig baseret på cellulære modellering med SGC7901-M og SGC7901-NM cellelinjer.

RhoE fremmer vandrende og invasive evner gastriske kræftceller in vitro og in vivo

for at udforske den rolle RhoE i gastrisk kræft metastase, vi opreguleret sit protein-ekspression i SGC7901-NM celler efter transduktion med RhoE lentivirusvektor eller kontrol vektor (opkaldt SGC7901-NM-RhoE eller SGC7901-NM-kontrol ). Derimod dæmpning af RhoE udtryk i SGC7901-M-celler blev opnået efter transfektion med siRNA rettet mod RhoE mRNA eller med kontrol siRNA (opkaldt SGC7901-M-siRhoE eller SGC7901-M-kontrol henholdsvis). Protein-ekspressionsniveauer blev bekræftet ved Western blot-analyse efter transfektion (figur 2A).

(A), RhoE blev nedreguleret i SGC7901-M-celler efter behandling med siRNA mens RhoE ekspression var opreguleret i SGC7901- NM celler efter behandling med lentivirus. RhoE proteinniveauer blev bekræftet ved Western blot analyse. (B) blev migreringsevnen af ​​cellerne evalueret af en sårhelende assay. Såret bredder af hver prøve blev målt ved forskellige tidspunkter af fase-kontrast mikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan), og lukningen forholdet blev beregnet i overensstemmelse med følgende formel: Wound Lukning (%) = (bredde 0 h) – bredde 24 h) /bredde 0 t. * P 0,05. Disse resultater blev derefter sammenlignet med dem af kontrolcellerne. (C), blev tumorcelleinvasion aktiviteter målt ved Transwell assay. Repræsentative billedfelter af invasive celler på membranen er vist. Data er repræsenteret som normaliseret cellulær invasion (invasion indeks) i forhold til kontrolceller. * P 0,05. De viste billeder er repræsentative for tre eksperimenter.

Dernæst

in vitro

migration og invasion assay blev udført (figur 2B og 2C). Vi fandt øget udtryk for RhoE kunne betydeligt opregulere de vandrende og invasive evner af mavekræft celle-line SGC7901-NM, i sårheling og Transwell invasion assays. Derimod SGC7901-M-celler, udviser afdæmpet udtryk for RhoE viste en bemærkelsesværdig hæmning af vandrende og invasive evner i forhold til kontrol celler. For at forstå, om funktionerne i RhoE var almindelige begivenheder i forskellige gastrisk cancerceller eller SGC7091-specifikke hændelser, blev gastrisk cancer cellelinjer MKN45 og MKN28 bruges til at gennemføre de samme eksperimenter. Resultaterne af både sårhelende og Transwell invasion analyser afslørede, at RhoE fremmet vandrende og invasive evner både MKN45 og MKN28 celler (figur S1), der foreslog, at funktioner RhoE, der blev detekteret

in vitro

var omfattende for alle mavekræft cellelinjer. I mellemtiden har vi også udført MTT-assay til at teste wether ændring af RhoE ekspression kan påvirke cellevækst af gastrisk cancer i vores undersøgelse. Som figur S3A vist, kunne hverken op- regulering af RhoE i SGC7901-NM celler eller nedregulering af RhoE i SGC7901-M-celler forårsager markant ændring af celleproliferation (p 0,05), således udelukket effekten af ​​RhoE på celleproliferation hvilket ville bringe forvirring til vores resultater, og yderligere bekræftet, at RhoE kan fremme celle motilitet af gastriske kræftceller.

for yderligere at undersøge, om øget RhoE kunne ændre den

in vivo

metastatisk evne gastriske cancerceller udførte vi

in vivo

hale vene metastatiske analyser i nøgne mus ved hjælp SGC7901-NM-RhoE og SGC7901-NM-kontrol cellelinjer. I aflivet mus, blev det konstateret, at celler, som viser højere niveauer af RhoE ekspression foranlediget en stærkt synlige lever- og lunge-overflade tumorer i sammenligning med kontrolceller (P 0,05, figur 3). H og E-farvning viste, at SGC7901-NM-RhoE celler tilsyneladende produceret metastaser i både lever og lunger, medens kontrolceller vises kun delvis metastaser. Tilsammen disse data antydede, at RhoE spillede en vigtig rolle i at fremme metastase af gastriske kræftceller både

in vitro

in vivo

.

H og E farvning af både lungerne og leverne blev vurderet fra mus, der havde fået intravenøse hale injektioner af SGC7901-NM-RhoE og kontrol celler hhv. Metastatiske loci blev identificeret og mærket med pile. Antallet af metastatisk loci i leveren og lungen blev også talt (midten). * P. 0,05

CXCR4 kunne være en nedstrøms gen af ​​RhoE i mavekræft

For at bestemme de mulige nedstrøms gener, hvorigennem RhoE kan mediere sin funktion i metastaser af gastrisk kræftceller, vi udførte PCR Array til at udforske det differentielt udtryk for metastase-relaterede gener deles mellem SGC7901-NM-RhoE og SGC7901-NM-kontrol cellelinjer. Gener, der øges eller mindskes ≥ 2 gange blev betragtet som potentielle RhoE-afhængige nedstrøms gener. I summen, vi har registreret 84 gener og i sidste ende fundet 6, som markant blev ændret efter ekspressionen af ​​RhoE blev forbedret (tabel 3). Blandt de 6 gener, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) var opreguleret, og tre andre (MMP7, CD82, CTSL1) blev nedreguleret i SGC7901-NM-RhoE celler.

Expression niveau af mRNA

Gene navn

Beskrivelse

SGC7901-NM-kontrol

SGC7901-NM-RhoE

CXCR4Chemokine (CXC motiv) receptor 41.003.30VEGFAVascular endotel vækstfaktor A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidase 71.00-2.47Table 3. differentielt udtrykte Metastase gener efter Augmented RhoE Expression.

CSV Hent CSV

i denne undersøgelse blev ekspressionen af ​​CXCR4, VEGFA, CTSK og CD82 verificeret ved Western blot-analyse og interessant, vi fandt, at kun CXCR4-ekspression var i overensstemmelse med resultaterne opnået ved PCR array analyse. Proteinet niveau af CXCR4 blev undertrykt af interferens fra RhoE og derimod blev øget, når RhoE blev ektopisk udtrykt (figur 4A). Således blev sammenhængen mellem RhoE og CXCR4 ekspression analyseret ved immunohistokemi i 60 mavekræft væv Resultaterne viste, at CXCR4 blev højt udtrykt i væv, hvor RhoE var positivt farvede, mens det dårligt blev udtrykt i disse væv hvor RhoE blev udtrykt på et lavt niveau (figur 4B). Desuden har både RhoE og CXCR4 udtryk var overensstemmende i 83,3% (50/60) af gastrisk carcinomer prøver, den Spearman R korrelationskoefficienten var 0,80 (P 0,001) og angives en tæt sammenhæng mellem både RhoE og CXCR4 ekspression i gastrisk kræft (tabel 4). Som rapporteret, overudtrykkes CXCR4 også spiller en vigtig rolle i cancer metastase og er involveret i EMT-processen, hvilket antydede, at CXCR4 kan være en nedstrøms gen af ​​RhoE med betydning for metastase af gastriske cancerceller [23].

(A) RhoE, CXCR4, VEGFA, CD82 og CTSK ekspression af SGC7901-M-kontrol, SGC7901-M siRhoE, SGC7901-NM-kontrol, og SGC7901-NM-RhoE cellelinjer. Ekspressionen af ​​β-actin blev anvendt som intern kontrol. De relative ekspressionsniveauer af CXCR4 blev vist som søjlediagrammer. * P 0,05. Værdier repræsenterer det aritmetiske gennemsnit og standardfejl på middelværdien (SEM) som bestemt ud fra mindst tre eksperimenter. (B) immunhistokemisk farvning af RhoE og CXCR4 i 60 par af mavekræft væv. Tre repræsentative sager viste, at CXCR4-ekspression godt korreleret med den af ​​RhoE.

CXCR4

Spearmans correlation

RhoE

+

++

+++

Negative

n

p

p

R

+1820060 0.001 0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Korrelation mellem ekspression af RhoE og CXCR4 i 60 par mavekræft Væv.

CSV Hent CSV

CXCR4 er afgørende at fremkalde invasion af RhoE i gastriske kræftceller

For at undersøge effekten af ​​CXCR4 på evnen hos RhoE at fungere i metastaser af gastrisk cancer, forstærkede vi ekspressionen af ​​CRCR4 i SGC7901-M-siRhoE celler ved lentiviral tranduction og nedreguleret dets ekspression i SGC7901-NM-RhoE celler ved siRNA interferens. Proteinniveauet blev bestemt ved Western blot-analyse (figur S2). I den følgende transwell assay, fandt vi, at en øget ekspression af CXCR4 kan genoprette den invasive evne SGC7901-M-siRhoE celler, medens derimod silencing endogene CXCR4 undertrykt invasionen af ​​SGC7901-NM-RhoE celler (figur 5). Disse observationer indikerede, at RhoE induceret gastrisk cancercelleinvasion, som blev delvist medieret af CXCR4. Disse observationer også yderligere vist, at CXCR4 var en ned-stream mål for RhoE.

Indflydelsen af ​​CXCR4 på RhoE induceret metastase blev målt ved en transwell assay. I SGC7901-M-siRhoE celler blev CXCR4 forbedret efter lentivirus-infektion. I SGC7901-NM-RhoE celler blev CXCR4 slået ud ved behandling med siRNA indblanding. Antallet af invaderende celler blev bestemt og præsenteret som søjlediagrammer. * P 0,05, i sammenligninger mellem de cellelinjer der udviser forskellige niveauer af ekspression af RhoE. ** P. 0,05, i sammenligninger mellem celle-linjer viser differentierede niveauer af ekspression af CXCR4

Diskussion

Aberrant udtrykte RhoE er ofte forbundet med tumor progression. rollen o RhoE kan imidlertid skifte mellem tumor suppressor og onkogen afhængigt af oprindelsen af ​​tumoren [7-9]. Som rapporteret, mavekræft er stadig en af ​​de mest almindelige kræftformer i hele verden, især i Østasien. Tidligere er det blevet vist, at unormal RhoE udtryk er godt korreleret med udviklingen af ​​gastrisk cancer. Som Zhou og Li beskrevet er ekspressionen af ​​RhoE steg i gastrisk cancer ved induktion af HIF-1α, og hvis ekspression kunne gå augmented endnu mere, når kræftceller generere modstand mod antitumorlægemidler. Desuden forøget ekspression af RhoE fremmer lægemiddelresistens ved at undertrykke Bax udtryk [13,24].

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at RhoE ekspression blev forhøjet i mavekræft væv mens det var fraværende eller svagt udtrykt i tilstødende ikke-tumor-væv. Derudover viste kliniske beviser, at RhoE over-ekspression blev signifikant korreleret med de grader af kræft celledifferentiering og TNM mellemstationer, som består af tumorstørrelse (T), lymfeknude invasion (N) og metastase (M). Vigtigere, RhoE ekspressionsniveauer var en uafhængig og væsentlig risikofaktor for overlevelse i gastrisk cancer. Desuden kunne opreguleret udtryk for RhoE forudsige et dårligt resultat i gastrisk kræftpatienter. Tilsammen vores data kraftigt antydet, at RhoE kunne have tjent som et onkogen i gastrisk kræft og spillet en positiv rolle i gastrisk cancer progression, især i cancer metastaser. Det er formelt muligt, at RhoE kunne være et hidtil ukendt prognostisk faktor i patienter med gastrisk cancer. Således betragtning af at metastase er en af ​​de vigtigste grunde til gastrisk dødelighed kræft, kan vores resultater tilvejebringe en ny ledetråd eller nyt mål til hæmning af tumormetastase i gastrisk cancer og måske endelig hjælpe med udviklingen af ​​terapeutiske strategier til at forlænge overlevelsen af ​​patienter.

Ikke desto mindre rolle RhoE i cancer metastaser er stadig delvist ubestemt. I levercellecancer og mesenkymale tumorceller, øget RhoE udtryk korrelerer med reduceret metastatisk evne, mens der i melanom celler, RhoE fremmer celle migration og invasion [10,12,25]. At udforske rolle RhoE i metastase af gastrisk kræft, vi bankede ned RhoE i SGC7901-M-celle-linje, som har en høj metastatisk potentiale og vi inducerede sit udtryk i SGC7901-NM celle-linje, der er dårlige til metastase . Efterfølgende

in vitro

assays demonstrerede, at øget RhoE fremmet cellulær motilitet og invasionsevne, mens faldet RhoE førte til en ikke-invasiv karakter af gastriske cancerceller. Disse resultater blev yderligere bekræftet af

in vivo

assay. Det er velkendt, at forbedret kræftcelle migration og invasion er nødvendige skridt for den endelige dannelse af metastaser. Derfor, i gastriske cancerceller, kan RhoE være en funktionel metastase-fremmende gen. Ikke desto mindre, vi bemærkede også, at cellen morfologi ændret sig meget efter ændring af RhoE udtryk. Yderligere undersøgelser fundet, at denne morfologisk ændring kan forårsages af forsvinden af ​​stress fiber (fig S3B), snarere end forandring af celleproliferation.

Som rapporteret, RhoE regulerer kræft metastase, og gør det meste ved at hæmme ROCK /MYPT vej [26]. Dette afsnit blev undersøgt i en anden forskningsundersøgelse fra vores gruppe (data ikke vist).