PLoS ONE: BRAF Mutationer i Canine Cancers

Abstrakt

Aktivering mutationer af

BRAF

genet fører til konstitutiv aktivering af MAPK-vejen. Selvom mange humane cancere bærer den muterede

BRAF

gen, denne mutation er endnu ikke blevet karakteriseret i hunde cancere. Som menneske og hunde kræft deler molekylære abnormiteter, vi hypotese, at

BRAF

genmutationer findes også i hunde kræftformer. For at teste denne hypotese, vi sekventeret exon 15 i

BRAF

, mutation hot spot af genet, i 667 hunde primære tumorer og 38 kontrol væv. Sekventering afslørede, at et enkelt nukleotid T til A transversion ved nukleotid 1349 fandt sted i 64 primære tumorer (9,6%), med særlig høj frekvens i prostatacarcinom (20/25, 80%) og urothelial carcinoma (30/45, 67%) . Denne mutation resulterer i aminosyre-substitution af glutaminsyre til valin ved kodon 450 (V450E) af hunde

BRAF

, svarende til den mest almindelige

BRAF

mutation i human cancer, V600E. Den evolutional bevarelse af

BRAF

V600E mutation fremhæver betydningen af ​​MAPK pathway aktivering i neoplasi og kan tilbyde mulighed for molekylær diagnostik og målrettede lægemidler til hunde, der bærer

BRAF

-mutated kræftformer.

Henvisning: Mochizuki H, Kennedy K, Shapiro SG, Breen M (2015) BRAF Mutationer i canine kræftformer. PLoS ONE 10 (6): e0129534. doi: 10,1371 /journal.pone.0129534

Academic Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: April 6, 2015; Accepteret: 11 maj 2015; Udgivet: Juni 8, 2015

Copyright: © 2015 Mochizuki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af North Carolina State University (NCSU) Cancer Genomics Fund (MB)

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

RAF proteiner er evolutionære bevaret serin /threonin-kinaser, der regulerer grundlæggende cellulære processer, herunder vækst, differentiering og overlevelse. RAF familie består af tre medlemmer: araf, BRAF og ku. Alle RAF-proteiner aktiveres af RAS og efterfølgende aktivere MEK, initiere signaltransduktion kaskade af MAPK-vejen. Konstitutiv aktivering af MAPK-vejen forårsaget af onkogene mutationer af

RAF

gener resulterer i abnorm proliferation og differentiering. Blandt de tre former for

RAF

gener,

BRAF

gen oftest muteret i human cancer [1-3]

Den mest almindelige. ( 90%) somatisk mutation af den humane

BRAF

gen er en T-til-a transversion i exon 15 i nukleotid 1799 (c.1799T a), hvilket resulterer i aminosyresubstitution fra valin til glutaminsyre ved kodon 600 ( V600E) [2]. Den V600E mutation forekommer inden aktiveringen segment af genet og efterligner phosphorylering, drastisk opløftende kinaseaktivitet og aktivering af downstream signal [3,4]. Dette aktiverende mutation er rapporteret i melanom (~ 60%) [4,5], thyroid cancer (20-40%) [6-9], hårcelleleukæmi (~ 100%) [10] og mange andre cancerformer med variabel frekvens. Kombineret med hyppige mutationer af

RAS

gener, tilstedeværelsen af ​​

BRAF

mutationer i en lang række humane cancere understreger vigtigheden af ​​MAPK-vejen aktivering som en fælles onkogent molekylær pathway.

Hunde udvikler spontane kræftformer med mange ligheder med humane kræftformer, herunder anatomiske placering, histologisk udseende og terapeutisk respons. Kræft hos hunde ikke kun deler biologiske adfærd med mennesker, men også molekylære abnormiteter [11,12]. Eftersom aktivering

BRAF

mutationer er til stede i en lang række human cancer, vi hypotese, at

BRAF

genmutationer er ligeledes involveret i canine cancere, hvilket fører til hyperaktivering af MAPK-vejen og celletransformation. For at teste denne hypotese, vi screenet for tilstedeværelsen af ​​

BRAF

exon 15 mutationer i en kohorte af 667 patologisk bekræftede hunde tumorprøver, bestående af en række hæmatopoietiske tumorer (n = 245), sarkomer (n = 160) , karcinomer (n = 115), melanocytisk tumor (n = 72) samt andre, mindre almindelige kræft (n = 75).

Materialer og metoder

Friske og formalin fast tumor prøver af forskellige hunde solide tumorer og EDTA blodprøver fra hunde leukæmi tilfælde blev indsendt fra klient-ejede hunde (med informeret ejer samtykke) private veterinære praksis i USA som en del af rutinemæssige diagnostiske procedurer (ingen IACUC påkrævet). Yderligere tumor prøver blev rekrutteret via North Carolina State University (NCSU) Clinical Studies Core, hver med informeret ejer samtykke efter en NCSU IACUC godkendt protokol (godkendelsesnummer 13-022-O), som dækkede procedure, der anvendes til at opnå de prøver og senere anvendelse til forskning ansøgning. Hematoxylin og eosin-farvede lysbilleder af formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) prøver blev gennemgået af en bord-certificeret veterinær patolog og bekræftede neoplastisk i alle undtagen leukæmi prøver. Leukæmi diagnoser var baseret på en vurdering af cytologiske og immunophenotypical undersøgelse af leukæmiceller ved en bord-certificeret klinisk patolog.

Genomisk DNA blev isoleret fra friske væv /blodprøver eller FFPE væv. I alt 667 tumorprøver blev inkluderet i denne undersøgelse. Nærmere oplysninger om prøvepopulationen er vist i tabel 1 og 2. DNA blev isoleret ved anvendelse af et QIAamp FFPE DNA-ekstraktion kittet (Qiagen, Valencia, CA, USA) eller et DNeasy blod og væv Kit (Qiagen). Spektrofotometri (NanoDrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE) og agarosegelelektroforese blev anvendt til at bestemme DNA-mængde og integritet. For ikke-neoplastiske kontroller (n = 38) blev DNA isoleret fra hunde blæreepitelet af 30 hunde og prostata kirtler i 8 hunde, opnået ved obduktion uden tegn på neoplastiske ændringer efter histopatologisk evaluering.

Exon 15 af den humane

BRAF

gen evolutionært bevaret mellem hunde og mennesker (Fig 1). Således blev PCR-amplifikation udført for at amplificere et 391-bp DNA-fragment, der spænder over det genomiske hunde

BRAF

sekvens svarende til human

BRAF

gen exon 15 (CanFam3.1, hunde kromosom (CFA) 16 : 8,296,227-8,296,345). Det følgende primer-par designet under anvendelse af primer-BLAST software (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/): fremad, AAGCAGGTCACATATGCCAAA (CFA 16: 8,296,007-8,296,027); omvendt, ATTTTTGGACCCTGAGGTGC (CFA 16: 8,296,378-8,296,397). Hver PCR reaktion indeholdt 10-20 ng genomisk DNA, 250 nM af forward og reverse primer og 1 × Taq RED Master Mix Kit (Genesee Scientific, San Diego, CA, USA). PCR-cykler består af indledende denaturering af 95 ° C i 2 min, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s med et afsluttende forlængelsestrin ved 95 ° C i 5 min. PCR-produkter blev visualiseret under anvendelse af agarosegelelektroforese og underkastet målrettet Sanger sekventering analyse med frem og /eller reverse primere. Sekvensanalyse blev udført ved North Carolina State University Genome Research Laboratory (https://research.ncsu.edu/gsl/). De sekventering blev analyseret ved hjælp 4peaks software (https://nucleobytes.com/index.php/4peaks) og sammenlignet med referencen sekvens (XM_005629550.1) ved hjælp af CLC Sequence Viewer version 7 (CLC bio, Aarthus, Danmark).

sekvenserne er stærkt konserverede mellem human og hund, herunder valin ved kodon 600 i human BRAF (understreget) og ved kodon 450 i hunde BRAF.

Fishers eksakte test blev udført for at undersøge forskel på

BRAF

mutation frekvenser mellem grupper stratificeret efter køn, kastrering status, alder eller racer. Alle statistiske analyser blev udført med JMP Pro-software version 11 (SAS Institute, Cary, NC). Værdier af P 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater og Diskussion

For at undersøge tilstedeværelsen af ​​

BRAF

mutationer, vi sekventeret

BRAF

gen exon 15 i 667 primær tumor prøver og 38 kontrol vævsprøver. Sekvensanalyse afslørede en T til A transversion ved nukleotid 1349 (c.1349T A, reference: XM_005629550.1), som forekom i 64 primære tumorer, hvilket resulterer i aminosyresubstitution fra valin til glutaminsyre ved kodon 450 (V450E) (Fig 2). Denne aminosyreændring svarer til den humane V600E mutation (figur 1). Signifikant variation findes i frekvensen af ​​V450E mutation tværs hunde cancere: 0% i hæmatopoietiske tumorer og sarcomer til 67% og 80% af urothelial carcinoma (UC) og prostatacarcinom (PC) (tabel 3). I alle V600E mutanter, elektroferogrammer indikerede tilstedeværelsen af ​​både muterede og vildtypesekvenser, hvilket tyder mutation heterozygoti. Der var ingen statistisk signifikant forskel i mutationen frekvens mellem forskellige grupper af neutering status, alder eller racer i UC og pc prøver og mellem mutationsstatus og køn i UC prøver. Nærmere oplysninger om signalments af hunde med UC og PC er vist i S1 tabel.

(A) vildtypesekvens opnået fra en kontrol prostata DNA. (B) muterede sekvens blandet med vildtype-sekvens opnået fra et prostatacarcinom. Pil angiver T-til-A nukleotid substitution resulterer i ændringen af ​​valin i codon 450 til glutaminsyre.

Ud over V450E mutation, en T-til-C overgang ved nukleotid 1305 (c.1305T C, tavs mutation) blev observeret i en mundtlig pladecellekarcinom prøve. En intron sletning af T (c.1292-189delT) blev observeret i en af ​​hver af bløddelssarkom og melanom prøver. Alle andre tumor og kontrolprøver fastholdt vildtype genomiske sekvens for

BRAF

exon 15.

konstitutiv aktivering af MAPK signalering ved at aktivere mutationer af

BRAF

(~ 60%) eller

NTM

(~ 15%) gener spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​humant melanom [4,5,11,12]. Tilsvarende er konstitutiv aktivering af MAPK-vejen impliceret i hunde melanom [13,14], selv om

RAS Salg gener blev sjældent muteret [14-16]. I denne undersøgelse, dog kun 6% af melanomer (to slimhinde og en kutant melanom) og 17% af melanocytomas nærede den

BRAF

V450E mutation. Denne mutation blev ikke identificeret i tidligere undersøgelser af hunde melanom [13,17], sandsynligvis på grund af den lave frekvens af

BRAF

mutation i hunde melanom. I humant melanom, tilstedeværelsen af ​​

BRAF

mutation er associeret med hud udsættelse for UV-lys, og melanomer på slimhinder eller ikke-UV-eksponerede hud sjældent besidder mutationen [18,19]. Som hunde melanom forekommer hovedsagelig på mundslimhinden og sjældent på søm senge og ikke-UV-eksponerede behårede hud, det faktum, at

er BRAF

muteret sjældent i hunde melanom er i overensstemmelse med resultaterne i menneskelige modstykker.

Interessant viste hunde UC meget højere frekvens af

BRAF

mutation, end der rapporteres til i humane UC tumorer [20]. Mutationer i gener opstrøms for MAPK pathway, herunder

HRAS

,

KRAS

FGFR3

gener (som alle er opstrøms molekyler af BRAF i MAPK-vejen), blev fundet i 82% af humant papillære UC, hvilket antyder, at aktivering af vejen er en drivende faktor for underklasse af humant UC [21,22]. Selvom de muterede molekyler i reaktionsvejen kan være forskellige mellem human og hunde-UC, den høje frekvens af

BRAF

mutation i hunde UC antyder, at dysregulering af MAPK-vejen kan spille en vigtig rolle i patogenesen af ​​sygdommen.

Canine PC er kendetegnet ved høj metastatisk potentiale og lokal invasiv, men de faktorer, der bidrager til aggressiv biologisk adfærd er stadig stort set ukendt [23]. Selvom

BRAF

V600E mutationer er sjældne i mennesker [24-26], akkumulere tyder på, at MAPK pathway spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​menneskelig PC, især i metastatiske tumorer [27]. Somatiske mutationer af de

RAS

gener og kopiere nummer gevinster på

BRAF

Craf

gener er observeret i humant PC ved frekvenser på ~ 10, 30% og 15%, henholdsvis [24-27]. Disse genomiske ændringer fører til aktivering og /eller forøgede udtryk for RAF-proteiner, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​nedstrøms signalering og stigende metastatiske egenskaber [26-28]. Derudover tilbagevendende kromosomale translokationer involverer

RAS

RAF

gener, der resulterer i onkogene fusion gener, blev for nylig opdaget i en delmængde (~ 5%) af humane tilfælde PC [29,30] .

En unik egenskab ved hunde PC er, at flertallet af tumorer opstår i androgen-uafhængig måde, med øget risiko i kastrerede hunde [23]. På den anden side, hormon-deprivationsbehandling er en grundpille for behandling af humant PC, som androgen spiller en kritisk rolle i patogenesen. De fleste af humant PC imidlertid udvikle sig til en mere aggressiv, hormon-refraktær (kastrationsresistent) cancer i kliniske forløb. Aktivering af BRAF /MAPK signalering gør menneskelig PC tumorceller mindre afhængige af androgen til spredning

in vivo

in vitro

, der bidrager til hormon-refraktær fænotype [31]. Den høje forekomst af

BRAF

mutation og aggressive natur hunde PC kan afspejle det faktum, at de fleste hunde PC udvikle sig uafhængigt af androgen stimulation. Disse kliniske og molekylære ligheder kan gøre hunde PC tjene som en spontant forekommende dyr kræft model er relevant for hormon-refraktær menneskelige pc.

Seneste avancement i molekylær teknologi muligt for os at opdage cirkulerende tumorceller i flydende prøver såsom perifer blod. Påvisning af

BRAF

mutationer kan anvendes som et middel til at diagnosticere og overvåge tumor byrde i flydende prøver, såsom blod eller urin, uden at nødvendiggøre biopsi af tumorer (kaldet som flydende biopsi, revideret i [32,33] ). Selv histopatologisk undersøgelse af en tumor biopsi er den gyldne standard for diagnosticering af hunde UC og PC, de anatomiske placeringer af disse tumorer gøre ofte det vanskeligt at opnå tilstrækkelig mængde væv til at diagnosticere. Derudover kan klinikere og ejere blive afskrækket fra at vælge denne diagnostiske oparbejdning grundet omkostninger og invasive procedurer, der er forbundet med biopsi. Derfor adgang til en ikke-invasive midler diagnosticere disse kræftformer er et udækket behov. Den høje

BRAF

mutation sats i disse tumorer gør BRAF V450E mutationen en potentiel diagnostisk markør for berørte kræftformer.

Identifikationen af ​​

BRAF

mutation i hunde kræft hæver mulighederne at terapi rettet mod konstitutivt aktiveret MAPK pathway kan give en klinisk fordel for dem, der udfører det

BRAF

V450E mutation, især UC og pc patienter. For nylig, vemurafenib og dabrafenib, selektive BRAF-hæmmere, forbedrede kliniske resultater hos patienter med melanom i forhold til konventionel kemoterapi [34,35]. Disse BRAF-hæmmere har også vist terapeutiske potentialer i andre neoplasmer huser

BRAF

mutationer [36-38]. I øjeblikket behandlingsmuligheder for hunde med UC og PC er af begrænset effekt. I betragtning af effektiviteten af ​​BRAF /MAPK-målrettet terapi i humane cancere, kan BRAF og MAPK pathways være lovende terapeutiske mål for disse hunde cancere. Evalueringer af

in vitro

in vivo

effekter af BRAF inhibitorer i hunde er berettiget til den kliniske anvendelse af BRAF-hæmmer til hunde der bærer kræft med muteret

BRAF

.

Som konklusion, vi identificerede

BRAF

V450E mutation i hunde kræft med forskellige frekvenser. Hyppige

BRAF

mutation i hunde UC og PC fremhæver en potentiel rolle MAPK signalvejen i patogenesen af ​​disse tumorer og kan tilbyde diagnostiske og terapeutiske anvendelser til hunde bærer

BRAF

mutationer.

Støtte Information

S1 Table. Signalments af hunde diagnosticeret med urotelial og prostata karcinom i nærværende undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0129534.s001

(XLSX)