PLoS ONE: GATA6 Aktiverer Wnt signalering i kræft i bugspytkirtlen ved Negativt Regulering af Wnt Antagonist Dickkopf-1

Abstrakt

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er en meget dødelig sygdom karakteriseret ved sen diagnose og behandling modstand. Tilbagevendende genetiske ændringer i definerede gener i association med forstyrrelser af udviklingsmæssige celle signalveje er blevet forbundet med PDAC udvikling og progression. Her viser vi, at GATA6 bidrager til pancreas carcinogenese under den tidsmæssige progression af pancreas intraepitelialneoplasi i kraft af Wnt-vejen aktivering.

GATA6

er gentagne forstærkes af både kvantitativ-PCR og fluorescerende in situ hybridisering i humane pancreas intraepitelialneoplasi og i PDAC væv, og

GATA6

kopi nummer er signifikant korreleret med generelle patient overlevelse. Tvungen overekspression af GATA6 i kræftcellelinjer forbedret celledeling og kolonidannelse i blød agar

in vitro

vækst

in vivo

, samt øget Wnt signalering. Derimod siRNA-medieret knockdown af GATA6 ført til tilsvarende fald i de samme parametre. Virkningerne af GATA6 viste sig at være på grund af dets evne til at binde DNA, som tvungen overekspression af et DNA-bindende mutant af GATA6 havde ingen virkning på cellevækst

in vitro

eller

in vivo,

heller ikke de påvirker Wnt signalering niveauer i disse samme celler. En mikroarray-analyse afslørede Wnt antagonist Dickopf-1 (DKK1) som et dysreguleret gen i association med GATA6 knockdown, og direkte binding af GATA6 til DKK1 promotoren blev bekræftet ved chromatin immunoprecipitation og elektroforetiske mobilitet ændring-assays. Transient transfektion af GATA6, men ikke mutant GATA6, i cancercellelinier førte til nedsat DKK1 mRNA-ekspression og sekretion af DKK1 protein til kulturmedier. Tvungen overekspression af DKK1 antagoniserede virkningerne af GATA6 på Wnt signalering i bugspytkirtelkræftceller. Disse resultater illustrerer, at en mekanisme, hvorved

GATA6

fremmer bugspytkirtlen carcinogenese er i kraft af sin aktivering af kanoniske Wnt signalering via regulering af DKK1

Henvisning:. Zhong Y, Wang Z, Fu B, Pan F, Yachida S, Dhara M, et al. (2011) GATA6 Aktiverer Wnt signalering i kræft i bugspytkirtlen ved Negativt Regulering af Wnt Antagonist Dickkopf-1. PLoS ONE 6 (7): e22129. doi: 10,1371 /journal.pone.0022129

Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 31 januar 2011; Accepteret: 16 Juni 2011; Publiceret: 19 jul 2011

Copyright: © 2011 Zhong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af NIH giver CA106610, CA62924 og CA140599, The George Rubis Endowment for kræft i bugspytkirtlen Research, The Michael Rolfe kræft i bugspytkirtlen Foundation, Sigma Beta Sorority, Joseph C. Monastra Foundation, The Alfredo Scatena Memorial, The Patty Boshell Pancreas Cancer Foundation, og Grants SAF2007 -60.860 og ONCOBIO Consolider fra Ministerio de Ciencia e Innovación, Madrid, Spanien (FR). Forfatterne har ingen finansielle interessekonflikter i relation til dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

GATA6 er medlem af GATA transkriptionsfaktor familie, der spiller kritiske regulatoriske roller i væv udvikling [1]. GATA-proteiner deler en konserveret zinkfinger-sekvens, som binder til den kanoniske DNA motiv (G /A) GATA (A /T) [2], og er opdelt i to undergrupper baseret på rumlige og tidsmæssige ekspressionsmønstre. GATA1 /2/3 er udtrykt i hæmatopoietiske cellelinier, og GATA4 /5/6 i mesoderm og endoderm afledt organer [1], [3]. GATA6 i særdeleshed er afgørende for udviklingen af ​​hjertet, mavetarmkanalen, bugspytkirtel og andre væv [4], [5]. Betydningen af ​​GATA6 understreges af den iagttagelse, at målrettet inaktivering af

GATA6

gen i mus forårsager tidlige embryonale dødelighed som følge af en mangel på endoderm differentiering [5] -. [7]

Tilbagevendende kopital gevinst på

GATA6

er for nylig blevet identificeret i pancreas kanalen adenocarcinoma (PDAC) cellelinjer og xenografter [8], [9]. Mens dens rolle i PDAC carcinogenese er ukendt, stigende evidens for, at GATA6 er forbundet med tumorigenese i en række forskellige vævstyper [10] – [14]. I ovarietumorer, er ektopisk GATA6 ekspression korrelerede med celle dedifferentiation [15] henviser i colorektal cancer, GATA6 påvirkninger celleproliferation og apoptose ved at påvirke ekspression af 15-lipoxygenase-1, som spiller en rolle i p53-afhængig celle standsning [16]. Aberrant GATA6 ekspression af har også været impliceret i humane binyretumorer samt i et alfa /SV40 T-antigen transgen musemodel, der udvikler adrenocorticale tumorer i en gonadotropin-afhængig måde [17], [18]. Derimod

GATA6

har været impliceret som et tumorsuppressorgen i astrocytomer [14].

Denne undersøgelse søgt at klarlægge de mekanismer, hvormed GATA6 bidrager til bugspytkirtlen carcinogenese. Vi viser nu, at

GATA6

forstærkning sker i løbet af de sene stadier af bugspytkirtlen intraepithelial neoplasi, er signifikant korreleret med patientens udfald, og fremmer bugspytkirtlen carcinogenese ved at aktivere den kanoniske Wnt signalvejen på grund af sin direkte transkriptionel undertrykkelse af det udskilte Wnt antagonist Dickkopf-1.

Metoder

Etik Statement

Alle prøver humant væv blev indsamlet med godkendelse af Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board (IRB protokoller # NA_00036610 og NA_00001584) efter informeret og skriftligt samtykke. For dyreforsøg blev undersøgelser udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske dyreforsøg fra University of Minnesota (ACUC protokol # MO09M84). Alle procedurer blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

cellelinier og væv

A6L, A13A, A10.7 og IMIM-PC2 cellelinier blev etableret i vores egne laboratorier. PK8 og PK9 var fra Dr. Akira Horii (Tohoko Universitet, Sendai, Japan), og HCG-25 fra Dr. Tony Hollingsworth (University of Nebraska Medical Center, Omaha NE). Alle resterende pancreas cancer anvendte cellelinier blev fremskaffet fra ATCC (Manassas VA). De normale pankreatiske duktale epitel cellelinier HPNE og Æske med HDPE blev fremstillet som tidligere beskrevet [19]. Den tyktarmskræft cellelinjer HCT116 (

CTNNB1

mutant), SW480 (

APC

mutant) og RKO (

APC

og

CTNNB1

vildtype) var tilvejebragt af Dr. James Eshleman (Johns Hopkins Medical institutioner, Baltimore MD USA). Alle celler blev dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 2 mmol /l L-glutamin ved 37 ° C og 5% CO

2.

Menneskelige bugspytkirtlen vævsprøver blev opnået fra Kirurgisk Patologi Institut for Johns Hopkins og xenotransplantater blev generøst tilvejebragt af Dr. Scott Kern (Johns Hopkins Medical institutioner, Baltimore MD USA). Alle prøver blev indsamlet med godkendelse af Johns Hopkins Hospital Board Institutional Review.

Lentiviral konstruktioner

Rekombinante lentivirus udtrykker GFP nedstrøms en mock shRNA eller en shRNA specifikt for GATA6 blev skabt ved hjælp af en tre- virus system som tidligere beskrevet detaljeret [20], [21]. Oligonukleotidsekvenser til GATA6 knockdown var sense, 5′-gatccgctgtcacaccacaactaccttcaagagaggtagttgtggtgtgacagctttttta-3 ‘; og anti-sense, 5’-cgataaaaaagctgtcacaccacaactacctctcttgaaggtagttgtggtgtgacagcg-3 ‘. Efter infektion blev en alikvot af hver cellelinje (1 × 10

5) blev analyseret ved FACS i flowcytometri Core Facility for at bekræfte effektiviteten af ​​transduktion ( 95% i alle testede cellelinier) ved at overvåge GFP-ekspression 60 timer efter transduktion.

plasmidkonstrukter

Den menneskelige GATA6 pcDNA3.1-GATA6 var en gave fra Dr. Clement Ho (University of Pennsylvania, Philadelphia PA) og bruges til at skabe pcDNA3.1 -mGATA6 ved site directed mutagenese (Invitrogen), hvor de otte mest høj konserverede baser af zink-finger-motivet blev deleteret [22], [23]. Menneskelig DKK1 ekspressionsvektor pCMV-DKK1 og DKK1 promotor luciferase reporter pGL3-DKK1 var begge generøst tilvejebragt af Dr. Hirotaka Osada (Aichi Cancer Instititue, Nagoya, Japan). Stabile cellelinjer blev oprettet efter tidligere er rapporteret i detaljer vores metoder [8].

In vitro Analyser af cellevækst

Cell proliferationsassays blev udført ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies) efter den foreslåede protokol. Kolonidannelse assays blev udført som tidligere beskrevet [8]. Alle assays blev udført tre gange.

Cell Cycle Analysis

Flowcytometri blev udført på et Becton Dickenson LSR Benchtop flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Procentdele af celler i G0-G1, S og G2 fase blev bestemt ved anvendelse af CellQuest (BD Biosciences).

enzymbundet immunsorbentassay

ELISA’er blev udført under anvendelse af muse-mAb-anti-humant DKK-1 antistof (Klon 141.119) efter producentens protokol (R 2.3 blev anset kopital gain at tage højde for polysomy af kromosom 18q, og fordi op til 20-fold GATA6 overekspression kan forekomme i PDACs med endnu kopi lavt niveau nummer gain [8]

Luciferase. og TOPFLASH analyser

For TOPFLASH analyser, pGL3-OT og pGL3-aF plasmider blev anvendt (venligt leveret af Dr. Bert Vogelstein). Relativ Wnt aktivitet blev bestemt ved forholdet mellem luciferase ekspression fra pGL3-OT vektor divideret med den for pGL3-vektor som beskrevet tidligere. For alle andre luciferaseassays blev vektoren pRL-TK (Promega), der udtrykker søfjer luciferase anvendt som kontrol. PcDNA3.1-tom vektor blev anvendt til at justere den totale mængde af transfekteret DNA. Luciferaseassays blev udført 40 timer efter transfektion under anvendelse af Dual-Luciferase-Reporter Assay System (Promega), og luciferaseaktiviteten blev bestemt med 1420 multilabel counter (PerkinElmer liv og analyse videnskab, CT, USA). Ildflueluciferase aktiviteter blev normaliseret ved søfjer luciferaseaktiviteter. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

chromatin immunpræcipitationsassay (CHIP assay)

chip assays blev udført under anvendelse af reagenser og protokoller fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) under anvendelse af tidligere beskrevne fremgangsmåder [24 ]. Alle anvendte primere blev designet til specifikt at målrette GATA bindende motiver i

DKK1

promotor. (Probesekvenser er tilvejebragt i File S1).

elektroforetiske mobilitet (EMSA)

EMSA assays blev udført under anvendelse af tidligere beskrevne fremgangsmåder [24]. Proteinekstrakter blev normaliseret til totalt protein, og 5-10 mg protein blev inkuberet med

32P-mærkede høj affinitet GATA6 prober specifikke for hver af de fire formodede GATA bindingssekvenstemaer i

DKK1

promotor . Mutant prober, hvor bindende motiv sekvensen blev muteret blev også anvendt. En GATA6-P-probe (5′-GCCAGCAGATAGCATGGAAAAG-3 ‘) afledt af

TFF2

promotor indeholdende et GATA6 bindingssted [25] blev anvendt som en positiv kontrol. Protein-DNA-komplekser blev opløst på 5% nondenaturating polyacrylamidgeler og analyseret ved autoradiografi under anvendelse af Kodak film. (Probesekvenser findes i File S1).

shRNA Mediated Knockdown

Dyrkede celler i den logaritmiske vækstfase (50% sammenflydende) blev transficeret med DKK1 shRNA (Dharmacon), CTNNB1 shRNA (CTNNB1- VHS50819, Invitrogen Inc., CA) eller mock shRNA (# 4611, Ambion) ved hjælp af lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen Inc., CA) efter den anbefalede protokol. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne høstet og underkastet RT-qPCR analyse, celleproliferation og kolonidannelse assays.

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)

FISH blev udført som beskrevet tidligere [8] ved brug af bakterielle kunstige kromosom kloner CTD-2376C8 indeholdende de genomiske sekvenser af 18q11.2 amplicon til 0,11 Mb (Invitrogen, Carlsbad, CA).

methylering specifik PCR

Promoter methylering var vurderet ved hjælp primere og betingelser som tidligere rapporteret af Suzuki et al [26].

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med en uparret

t

-test for parametriske distributioner, eller en chi i anden-test til sammenligning af frekvenser. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

GATA6 Copy Number Gain opstår under pancreas intraepitelialneoplasi

Normalt bugspytkirtlen ductal epitel menes at udvikle sig til at infiltrere kræft gennem en række. i morfologisk definerede forstadier kaldet pancreas intraepitelialneoplasi (Panin-1, 2, 3) [27]. For at forstå sammenhængen mellem genetiske gevinst på

GATA6

PDAC udvikling, vi vurderede

GATA6

kopi nummer i Mikrodissekterede prøver af normal kanal epitel, Panin, og menneskelig PDAC ved kvantitativ PCR. I forhold til det haploide genom, var der ingen gevinst på

GATA6 Salg i normal kanal epitel (0 af 4), Panin-1 (0 af 13) eller Panin-2 (0 af 10) læsioner. Derimod steget

GATA6

kopitallet (≥2.3 kopier) blev identificeret i 6/17 prøver (35%) af Panin-3 og i 18/55 prøver (33%) af PDAC (figur 1A).

GATA6

kopi nummer gevinst blev yderligere bekræftet af fluorescerende

in situ

hybridisering (FISH) i paraffinindlejrede sektioner af en Panin-3 og 10 PDAC prøver (Figur 1B).

(A)

GATA6

kopiantal (gennemsnit ± SE) i Mikrodissekterede normale kanaler (N = 4), Panin-1 (N = 13), Panin-2 (10), Panin-3 (N = 17) læsioner og pancreascancer (N = 55). (B) repræsentant FISH af kernen af ​​en neoplastisk celle i en PanIN3 læsion med 11-fold

GATA6

amplifikation (højre) sammenlignet med kernen i en neoplastisk celle fra en anden PanIN3 læsion uden kopiantal gevinst af

GATA6

(til venstre). GATA6 probe blev mærket med rød og kromosom 18 centromer sonde (18 Cent) blev mærket med grønt. Snittene blev modfarvet med DAPI for at fremhæve kerner. (C) Korrelation af GATA6 mRNA ekspression og kopiere nummer i Mikrodissekterede prøver af normal, Panin og kræftvæv. (D) GATA6 immunolabeling af to pancreas cancer væv med GATA6 kopi nummer gevinst i forhold til to kræftformer uden kopi nummer gevinst. Øget kopital er stærkt forbundet med nuklear mærkning af GATA6 protein. (E) Kaplan Meier overlevelse kurve viser forholdet af

GATA6

kopi nummer gevinst (≥2.3 kopier pr haploide genom) til samlede overlevelse hos patienter med kirurgisk resektion kræft i bugspytkirtlen.

For seks patienter den matchede Panin-3 og PDAC blev mikrodissekeres fra samme vævssnit og analyseret for

GATA6

kopiantallet,

KRAS

TP53

gen status (tabel 1) . Hos to patienter (patienter 7 og 53)

GATA6

kopi nummer forstærkning er blevet fundet i både Panin-3 og PDAC prøver indikerer den opstod før udviklingen af ​​infiltrerende carcinoma, hvorimod i en tredje patient (patient 53)

GATA6

kopi nummer gevinst var kun til stede i PDAC prøve tyder det opstod under tidsmæssig progression til PDAC. Men som en enkelt Panin-3 blev analyseret i denne patient, kan vi ikke udelukke, at yderligere og uprøvede Panin-3 læsioner i denne patientens bugspytkirtel også indeholdt kopi nummer gevinst. For at bekræfte, at stigninger i

GATA6

kopi nummer resultat i øget genekspression, vi kvantificeret GATA6 mRNA-niveauer i de samme Mikrodissekterede prøver (figur 1C), hvilket indikerer, at de relative niveauer af GATA6 mRNA var signifikant større i prøver med

GATA6

kopiere numre ≥2.3 sammenlignet med dem med kopi-numre 2,3 (461,9 ± 126,2 og 194,1 ± 69,7, s 0,0004). Tilsvarende immunolabeling for GATA6 i fem pancreascancer med kopi nummer gevinst viste stærk positiv nukleare mærkning hvorimod ingen mærkning blev set i fem pancreascancer med kopi-numre. 2,3 (Figur 1D)

bugspytkirtlen carcinogenese er ledsaget af ophobning af genetiske ændringer i

KRAS, CDKN2A, TP53

og

Smad4

gener [27]. Vi har derfor bestemt forholdet mellem

GATA6

kopi nummer gevinst til den genetiske status af disse fire gener i 56 xenograft beriget PDACs. Sytten xenografter (30%) havde en

GATA6

kopi nummer ≥2.3 forhold til det haploide genom, hvoraf seks (11%) havde en kopi nummer 5,0. Men der var ingen korrelation af

KRAS, CDKN2A, TP53

eller

Smad4

status med

GATA6

kopi nummer. Fordi

GATA6

er også placeret på det samme kromosom arm som

Smad4 Hoteller, som ofte målrettet efter homozygot deletion [28], vi næste spekulerede på, om

GATA6

kopi nummer gevinst er specifikt relateret til genomiske omlejring begivenheder, der kan føre til homozygot sletning af

Smad4

i samme xenograft DNA. Men dette igen viste ikke en forening, med seks af otte

Smad4

mutanter opstår på grund af homozygot deletion i xenotransplantater med øget

GATA6

kopi antal versus 13 af 21 med en homozygot deletion i xenografter uden

GATA6

kopi nummer gevinst (p = 0,2844). Samlet set konkluderer vi, at

GATA6

kopi numbe≥r gevinst opstår under sene stadier af pancreas intraepitelialneoplasi men er ikke specielt beriget til inden karcinomer med ændringer af disse fire gener.

Vi næste bestemmes i hvilket omfang

GATA6

kopi nummer gevinst er forbundet med clinicopathologic funktioner i resekteres PDAC. Ingen relationer blev fundet for

GATA6

og alder, køn, tumorstørrelse, tumor differentiering, tumor placering eller lymfeknude status. Men patienter med kopi nummer ≥2.3 havde en længere samlet overlevelse end patienter uden kopi nummer gevinst ved Kaplan Meier overlevelse estimat (p = 0,0096, Figur 1E).

GATA6 Fremmer cellevækst

In Vitro

og

In Vivo

Forstærkning og overekspression af

GATA6

i Panin og PDAC foreslår det bidrager til PDAC biologi [8], [9]. Vi konstruerede derfor lentivirusvektorer der udtrykker enten en mock eller GATA6 specifik shRNA og brugte dem til stabilt at inficere PDAC cellelinier AsPC1 og A13A med kopiantal på 2,3 og 9,0 i forhold til det haploide genom henholdsvis [8], [9]. I begge cellelinier, er GATA6 også overudtrykkes mindst 10 gange i forhold til normale ventilationskanal celler [8], [9] (figur S2). Knockdown af GATA6 i begge cellelinier (figur 2A, 2B) førte til signifikante fald i celleproliferation og kolonidannelse (figur 2C og D) en reduktion i celler indenfor G2 /M-fase (Figur 2E) og nedsat vækst in vivo (figur 2F og 2G). Omvendt tvungen overekspression af GATA6 i PDAC cellelinien Panc1 med lave niveauer af endogen GATA6 udtryk [8] (figur 3A og figur S2) ført til øget celleproliferation og kolonidannelse (figur 3B og 3C) svarende til den, også tidligere vist for cellelinien MiaPaCa2, der ikke har endogen ekspression af GATA6 [8].

(A) Samlet protein blev ekstraheret fra AsPC1-GATA6sh og A13A-GATA6sh celler og mock shRNA kontroller og analyseret ved Western blot for relative niveauer af GATA6 protein i forhold til actin. (B) Real-time PCR til GATA6 udtryk i AsPC1-GATA6sh og A13A-GATA6sh celler. (C) Disse celler blev også analyseret for celleproliferation på forskellige tidspunkter, (D) dyrket i blød agar, og antallet af kolonier ved 2 uger tælles, og (E) analyseret ved flowcytometri for at bestemme procent af celler i G2 /M-fasen. (F) Repræsentant xenograft dannelse

in vivo

(ovenfor) og efter eksplantation (lavere) af AsPC1 kontrol og GATA6sh celler ved 8 uger efter injektion. (G) Gennemsnitlig tumorvolumen (middel ± SE) af disse samme xenotransplantater på 8 uger efter injektion. Tilsvarende resultater blev bemærket for A13A-GATA6sh celler (data ikke vist). Med undtagelse af flowcytometri, der blev udført i dobbeltbestemmelse, alle eksperimentelle data vist repræsenterer resumé tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P. 0,001

(A) Real-time PCR til GATA6 udtryk i Panc1-mock, Panc1-GATA6 og Panc1-mGATA6 celler. (B) Panc1-mock, Panc1-GATA6 og Panc1-mGATA6 celler blev enten analyseret for celleproliferation eller (C) dyrket i blød agar, og antallet af kolonier ved 2 uger optalt. (D) Repræsentant xenograft dannelse

in vivo

(ovenfor) og efter eksplantation (lavere) af Panc1-mock, Panc1-GATA6 og Panc1-mGATA6 celler på 8 uger efter injektion. (E) Gennemsnitlig tumorvolumen (middel ± SE) af disse samme xenotransplantater på 8 uger efter injektion. Alle eksperimentelle data vist repræsenterer resumé tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P. 0,001

GATA6 regulerer DNA transskription ved binding til kanoniske GATA motiver, eller som en transkriptionel cofaktor [2], [29]. At afgøre, om virkningerne i Panc1 celler skyldtes GATA6 DNA-bindingsaktivitet, anvendte vi steddirigeret mutagenese for at skabe en mutant cDNA, hvor GATA6 Zn finger-domæne blev afbrudt (kaldet mGATA6), og igen stabilt transficeret Panc1 celler (figur 3A ). Der var ingen forskel i cellevækst eller kolonidannelse blandt Panc1-mGATA6 celler og Panc1-kontrol transficerede celler (figur 3B og 3C) tyder på, at den vækstfremmende virkninger af GATA6 observeret

in vitro

er på grund af sin funktion som en transskriptionsfaktor. For yderligere at tydeliggøre vækstfremmende effekt af GATA6 blev nøgne mus podet subkutant med Panc1-GATA6 eller Panc1-mGATA6 celler. Efter 8 uger var den gennemsnitlige tumor volumen var signifikant større i mus injiceret med Panc1-GATA6 celler end med Panc1-mGATA6 celler (figur 3D og 3E), fører os til at konkludere, at GATA6 fremmer carcinogenese via sin evne til at binde DNA.

den Wnt Antagonist Dickkopf1 (DKK1) er en GATA6 Target Gene

GATA proteiner er knyttet til Wnt signalering i embryogenese af hjertet og lungerne [4], [30], [31]. Vi hypotese derfor, at GATA6 bidrager til bugspytkirtlen carcinogenese dels gennem dens virkninger på Wnt signalering, en formodet forhold, der ikke er blevet udforsket i detaljer for denne tumortype. Sammenlignet med mock shRNA lentiviral-inficerede celler, viste både AsPC1-GATA6sh og A13A-GATA6sh celler et signifikant fald i funktionel Wnt signalering aktivitet ved TOPFLASH assay (figur 4A), mens overekspression af GATA6 i Panc1 og HPNE celler fremmes Wnt signalering aktivitet (figur 4B ). For at bestemme om ß-catenin ekspression kræves til disse virkninger, vi lyddæmpede ß-catenin ekspression under anvendelse af et shRNA strategi i Panc1-GATA6 celler, hvilket fører til en signifikant inhibering af celleproliferation og kolonidannelse (figur 4C og 4D). I bugspytkirtelkræft væv, blev GATA6 overekspression signifikant korreleret med nukleare ophobning af ß-catenin protein (8/12 PDACs med GATA6 overekspression viser ß-catenin nukleare ophobning versus 3/20 uden GATA6 overekspression, p = 0,004) (Figur 4E). Således GATA6 overekspression i PDAC bidrager til celledeling og kolonidannelse ved at styrke kanonisk Wnt signalering.

(A) Wnt signalering aktivitet i AsPC1-GATA6sh og A13A-GATA6sh celler baseret på TOPFLASH assay. Luciferaseaktivitet er repræsenteret som forholdet mellem OT til niveauer i celler med GATA6 knockdown forhold til den for mocktransfekterede celler. (B) Wnt signalering aktivitet i Panc1-GATA6 og HPNE-GATA6 celler bestemt ved TOPFLASH assay. Luciferaseaktivitet er repræsenteret som forholdet mellem OT til niveauer i GATA6 transficerede celler i forhold til den for mocktransfekterede celler. (C og D) Panc1-GATA6 celler blev transient transficeret med ß-catenin eller mock shRNA og (C) celleproliferation eller (D) kolonidannelse bestemt. Alle eksperimentelle data vist repræsenterer resumé tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P 0,01. (E) immunmærkning mønstre af GATA6 og ß-catenin protein i to repræsentative PDAC væv. Pile viser nuklear mærkning af både GATA6 og ß-catenin i serielle sektioner af samme kræftvæv. Derimod PDAC prøven med lav GATA6 ekspression viser også ingen ekspression af ß-catenin.

GATA6 regulerer dets målgener ved at binde til GATA-bindende motiv [2]. For at identificere GATA6 målgener, som kan påvirke Wnt signalering, udførte vi genekspression profilering ved anvendelse AsPC1-GATA6sh og A13A-GATA6sh og deres mock kontroller og identificeret 113 almindeligt dysreguleret gener (figur 5A og tabel S1) hvoraf den ene var Dickkopf-1 (

DKK1

), en antagonist af kanoniske Wnt signalering [32]. Wnt11, en kendt GATA6 målgen [30], blev også identificeret tyder på, at GATA6 bidrager til Wnt pathway regulering dels gennem regulering af disse gener. Fordi DKK1 ikke tidligere er blevet anerkendt som en

GATA6

målgenet vi specifikt fokuseret på forholdet mellem GATA6 til DKK1.

(A) Venn-diagram, der angiver antallet af dysregulerede gener identificeret ved microarray analyse af AsPC1-GATA6sh (venstre cirkel, blå) og A13A-GATA6sh celler (højre cirkel, gul). Det grønne cross-område indikerer almindeligt dysreguleret gener og omfatter DKK1. (B) Real-time PCR bekræfter DKK1 overekspression i AsPC1-GATA6sh og A13A-GATA6sh celler. (C) Påvisning af udskilt DKK1 protein i konditioneret medier i AsPC1-GATA6sh og A13A-GATA6sh celler. Secernerede DKK1 proteinniveauer er angivet ved hjælp af absorbans OD450. (D) kromatin immunopræcipitationsassay bekræfter binding af GATA6 til

DKK1

promotor. Ikke-immune IgG og hele genomet afledt gDNA anvendes som negative og positive kontroller, hhv. (E) EMSA-assay, der bekræfter binding af GATA6 til formodede GATA-bindingssteder # 2 og # 3. Den mutant sekvens mGATA- # 3 ikke generere nogen påviselig binding. Nuclear Extr, nuklear ekstrakt; GATA6-P, en positiv kontrol sonde afledt af

TFF2

promotor indeholdende et GATA6 bindingssted; Gata # 2, probe, der indeholder formodede GATA bindingssted No. 2; Gata # 3, probe, der indeholder formodede GATA bindingssted No. 3; mGATA- # 3, probe, der indeholder en muteret formodet GATA-bindingssted No. 3; henvises til metoder til yderligere detaljer (F) Effekt af GATA6 udtryk for aktiviteten af ​​

DKK1

promotor. Dataene er angivet som forholdet mellem ildflueluciferaseaktivitet til søfjer luciferaseaktivitet. pGL3 blev anvendt som en negativ kontrol til baggrund. (G) Real-time PCR for DKK1 mRNA-ekspression i Panc1 celler. Når det er relevant, alle eksperimentelle data vist repræsenterer resumé tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; ***, P. 0,001

Real-time PCR bekræftede DKK1 mRNA opregulering og øget udskillelse af DKK1 protein i cellen medier i begge cellelinier i tilstedeværelse af GATA6 knockdown (figur 5B og 5C) . At afgøre, om

DKK1

er et direkte mål for GATA6, vi søgte

DKK1

promotor for GATA6 konsensus bindende sekvenser. Fire uafhængige GATA-bindende motiver blev identificeret (Fig S3), og ved at kromatin immunpræcipitationsassay direkte binding af GATA6 til disse motiver i

DKK1

promotoren blev demonstreret (figur 5D). Binding af GATA6 blev også bekræftet ved elektroforetisk mobility shift-assay (figur 5E og data ikke vist). Dernæst anvendes en luciferase reporter under kontrol af

DKK1

promotor for at bestemme, om GATA6 binding til

DKK1

virkninger på transkriptionsaktivitet fra genet. Denne reporter blev aktiveret i både 293T og Panc1 celler afspejler endogen aktivering af DKK1 ekspression. Men efter tvungen GATA6 udtryk (fig. 5F) luciferaseaktivitet blev signifikant reduceret, mens ingen effekt på

DKK1

promotor-aktivitet blev set i tilstedeværelsen af ​​GATA6 bindende motiv mutant (mGATA6), hvilket indikerer, at de repressive effekter af GATA6 på

DKK1

kræver direkte binding af GATA6 til

DKK1

promotor. Tvunget udtryk for vildtype, men ikke mGATA6 protein i Panc1 også ført til betydelige fald i DKK1 mRNA-niveauer (figur 5G). Tilsammen indikerer disse data, at GATA6 negativt regulerer DKK1 transskription gennem direkte binding til GATA motiv i

DKK1

promoter region.

DKK1 Expression i PDAC korrelerer med Wnt Aktivering

medlemmer af DKK familien (DKK1, DKK2, DKK3 og DKK4) udskilles proteiner, der hæmmer kanoniske Wnt signalering ved at binde til en underenhed af Wnt-receptorkomplekset LRP5 /6 [32].