PLoS ONE: cDNA Microarray Gene Expression Profilering af pindsvinesignaleringsvejen Hæmning i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Hedgehog (HH) signalering spiller en afgørende rolle i normale cellulære processer, i normal pattedyr gastrointestinal udvikling og differentiering og i onkogenese og vedligeholdelse af den maligne fænotype i en række humane cancere. Stigende beviser implicerer yderligere inddragelse af HH signalering i onkogenese og metastatisk adfærd tyktarmskræft. Men for at genomiske tilgange belyse rolle HH signalering i kræft generelt mangler, og data, der udledes på HH signalering i tyktarmskræft er yderst begrænset.

Metode /vigtigste resultater

For at identificere unikke downstream målene i GLI-generne, de transkriptionelle regulatorer af HH-signalering, i forbindelse med colon carcinoma, anvendte vi et lille molekyle inhibitor for både GLI1 og GLI2, GANT61, i to human coloncancer-cellelinjer, HT29 og GC3 /c1. Cellecyklusanalyse demonstrerede akkumulering af GANT61-behandlede celler ved G1 /S grænsen. cDNA microarray genekspression profilering af 18,401 gener identificeret differentielt udtrykte gener (degs) både fælles og unikke til HT29 og GC3 /c1. Analyser ved hjælp GenomeStudio (statistik), Matlab (zonekort), Opfindsomhed (kanonisk pathway-analyse), eller ved QRT-PCR, identificeret p21

Cip1 (CDKN1A) og p15

Ink4b (CDKN2B), som spiller en rolle i G1 /S checkpoint, som op-regulerede gener ved G1 /S grænsen. Gener, der bestemmer yderligere cellecyklusprogression ved G1 /S, herunder E2F2, cyclin E2 (CCNE2), Cdc25A og CDK2, og gener, der regulerer passagen af ​​celler gennem G2 /M (cyclin A2 [CCNA2], Cdc25C, cyclin B2 [CCNB2], CDC20 og CDC2 [CDK1], blev nedreguleret. Derudover blev hidtil ukendte gener involveret i stressrespons, DNA beskadigelse respons, DNA-replikation og DNA-reparation identificeret efter inhibering af HH-signalering.

konklusioner /betydning

Denne undersøgelse identificerer gener, der er involveret i HH-afhængig cellulær proliferation i colon cancerceller, og efter dens hæmning, gener, der regulerer cellecyklusprogression og begivenheder nedstrøms for G1 /S grænsen.

Henvisning :.. Shi T, Mazumdar T, DeVecchio J, Duan ZH, Agyeman A, Aziz M, et al (2010) cDNA Microarray Gene Expression Profilering af pindsvinesignaleringsvejen Hæmning i Human Colon Cancer Cells PLoS ONE 5 (10): e13054. doi: 10,1371 /journal.pone.0013054

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Kina

modtaget: juni 6, 2010; Accepteret: September 2, 2010; Udgivet: 1 okt 2010

Copyright: © 2010 Shi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte fra National Cancer Institute awards RO1 CA 32613 (JAH), RO1 108.929 (Jah), og fra Cleveland Clinic. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hedgehog (HH) signalering spiller en kritisk rolle i en række normale cellulære processer. Det er afgørende i embryogenese, regulering af epitel-til-mesenchymal overgang, mønsterdannelse af en bred vifte af hvirveldyr strukturer i en række forskellige organer, opretholdelse af voksent væv homeostase, vævsreparation, cellulær proliferation og i celleoverlevelse [1] , [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Den kanoniske HH vej er også afgørende for normal pattedyr gastrointestinal udvikling, hvor det er involveret i koordinatsystemet regulering af differentiering af normale tarm villi [10], [11], [12]. Således i den normale mave-tarmkanalen, er HH ligander induceres i differentierede celler omkring villøs overflade, frembringelse af en negativ feedback loop til at inhibere kanoniske WNT signalering i de basale celler i krypten og dermed beskytte differentierede celler fra de proliferative virkninger af WNT [ ,,,0],13]. Aktivering af den kanoniske HH signalvejen omfatter bindingen af ​​HH ligander til membranen receptor Patched (PTCH1), som bliver internaliseret fører til aktivering af signalmolekyle Smoothened (SMO) via frigivelse fra PTC-medieret suppression. SMO aktiverer endelige dommer af HH-signalering, GLI-familien af ​​transkriptionsfaktorer, som binder til GACCACCCA-lignende konsensus bindende element i promotorsekvenser til transkriptionelt regulere HH målgener [3], [14], [15]. GLI1 og GLI2, de transkriptionelle aktivatorer af HH-signalering, besidder forskellige såvel som overlappende funktioner, der involverer aktivator (GLI1 og GLI2) eller repressor (GLI2) aktiviteter [16]; dog er deres roller i reguleringen af ​​HH-drevet cellulære spredning, overlevelse eller celle dødsprocesser dårligt forstået. Historisk har GLI1 blevet betragtet som den mest pålidelige markør for HH pathway aktivitet, men GLI2 synes at være den primære aktivator af HH-signalering, med GLI1 som en transkriptionel mål for GLI2 [3], [7], hvilket fører til forøgelse af HH signalering både kvantitativt samt kvalitativt [16]. Et vigtigt træk ved GLI proteiner er, at deres biologiske aktivitet er kontekstafhængig, påvirket af den cellulære miljø [17], [18].

Aktivering af den kanoniske HH signaleringskaskade er aberrerende aktiveret og velkendt for at spille en kritisk rolle i onkogenese og vedligeholdelse af den maligne fænotype i flere typer af humane cancere. En sådan aktivering indebærer forstærkning af GLI1 eller GLI2, mutationer i PTC eller SMO eller dysreguleret genekspression [3], [4]; disse maligne celler er også følsomme over for små molekyler inhibitor, der er målrettet mod SMO, cyclopamin [4], [19], [20], [21], [22], [23]. Coloncarcinomer menes at stamme fra konstitutiv aktivering af WNT signalering ved mutation af APC eller β-catenin-gener, mens inddragelse af HH signalvejen er ikke så klar. I gastrointestinale maligniteter, har transkriptionel opregulering af HH-ligander blevet identificeret som den dominerende aktivator af HH-signalering i disse sygdomme (revideret i [3]). Desuden er der ny dokumentation, at HH-signalering er involveret i colorektal carcinogenese [24], [25], coloncarcinom stamceller selvfornyelse, og i den metastatiske adfærd af avancerede coloncancerformer [26]. Men for at genomiske fremgangsmåder belyse den rolle, HH signalering i cancere generelt mangler, regulatoriske gener nedstrøms for GLI1 og GLI2 der fungerer i cellulær proliferation, overlevelse og vedligeholdelse af den maligne HH fænotype forbliver ufuldstændigt karakteriseret [5], og data udledt på HH signalering i coloncancer er yderst begrænset.

Cellulær proliferation drives af progression af celler gennem cellecyklusen bestående af sekventiel passage gennem G1, S, G2 og M-faser. Cyclin-afhængige kinaser (CDK) associeret med cycliner at drive cellecyklus maskiner [27], [28]. Således CDK2 associerer med cyclin E ved G1 /S overgang og med cyclin A i S-fasen, CDK4 og CDK6 binder til cyclin D under progression ved G1 /S, mens Cdc2 komplekser med cyclin A ved G2, og med cyclin B under G2 /M overgang. CDC25 familiemedlemmer også regulere cellecyklusprogression via dephosphorylering af CDK’er [29], [30]. CDK-inhibitorer, herunder p21

Cip1 [29], [31] og p15

Ink4b [[32], binder til cyklin-CDK-komplekser under cellecyklus overgang, især ved G1 /S (p21

CIP1, p15

Ink4b; [32]) og G2 /M (p21

CIP1; [29]), og kan også inducere standsning af cellecyklus ved G1 /S grænsen efter cytostatiske signaler via funktionel hæmning af cyclin- CDK-komplekser. E2F transkriptionsfaktorer også regulerer ekspressionen af ​​gener, der er nødvendige for G1 /S overgang, især gener involveret i aktiveringen af ​​DNA-replikation maskiner, og DNA-reparation [33].

cDNA microarray teknologi har forudsat evnen til at undersøge ekspressionen af ​​tusinder af gener samtidigt, og er et vigtigt redskab i dissektion af signaltransduktionsveje. På HH signaleringskaskade, har HH /GLI målgenekspression blevet undersøgt efter EGF-stimulering [6] eller inducerbar GLI1 [16] eller GLI2 [9] genaktivering i humane keratinocytter, eller i GLI1-induceret transformation celle [7]. For at identificere unikke nedstrøms målene i GLI gener, der fungerer i cellulær proliferation i forbindelse med colon carcinoma, anvendte vi et lille molekyle inhibitor for både GLI1 og GLI2, GANT61, der er konstateret i en celle-baseret lille molekyle skærm for inhibitorer af GLI1-medieret transkription [34]. GANT61 optræder i kernen til at blokere GLI1 funktion, hæmmer både GLI1- og GLI2- medieret transkription, og demonstrerer en høj grad af selektivitet for HH /GLI signalering [34]. Således GANT61 handlinger nedstrøms cyclopamin (målrettet SMO) til at hæmme den endelige determinanter for HH transkriptionel regulering.

I to menneskelige kolon carcinom cellelinjer, HT29 og GC3 /c1, hæmmer HH signalvej hjælp GANT61 faldt udtryk af GLI1, GLI2 og HH ligandreceptor, PTCH1, og inhiberede proliferation ved at inducere cellulær akkumulering ved G1 /S grænsen 24 timer efter behandling, bestemt ved flowcytometrianalyse. På yderligere detaljeret analyse ved hjælp cDNA microarray genekspression profilering og kvantitativ Real-Time PCR, p21

Cip1 (CDKN1A) og p15

Ink4b (CDKN2B), der kan fremkalde G1 /S checkpoint, blev opreguleret, mens gener, der yderligere bestemmer post fra G1 til S-fasen, herunder E2F2, cyclin E2 (CCNE2), Cdc25A og CDK2 blev nedsat i udtryk. Samtidig med nedsat G1 til S-fasen progression, nedsat ekspression af cyclin A2 (CCNA2), Cdc25C, cyclin B2 (CCNB2), CDC20 og CDC2 (CDK1), der regulerer passagen af ​​celler gennem G2 /M blev også påvist. Yderligere nye gener, der er involveret i stress respons, og respons på DNA-skade, der ikke tidligere er identificeret efter ophør af HH-signalering i humane cancerceller, omfatte de tidlige respons generne DDIT2 (GADD45G), DDIT3 (GADD153), DDIT4 (REDD) 1, PPP1R15A (GADD34) og ATF3 der var signifikant opreguleret. Gener involveret i DNA-syntese og reparation (Tyms, TOP2A, TK1, POLE, POLE2), og yderligere nye gener, der er involveret i S-fase progression eller DNA skader reaktioner, der var betydeligt nedreguleret, omfatter KIAA0101 (p15 [PAF]), replikering faktor C varianter 2, 3, 4, 5, CDT1, E2F transkriptionsfaktorer CDCA4 og TFDP1, MDC1, FANCD2, PCNA, og de involverede i DNA-reparation, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 og HELLS gener. Denne undersøgelse har derfor identificeret gener, der reguleres under opsigelse af HH-afhængig cellulær proliferation og overlevelse i colon cancerceller, og involverer gener forbundet med G1 /S-fasen anholdelse, DNA skader og stressreaktioner.

Resultater

GANT61 inducerer nedreguleret ekspression af GLI gener og ophobning af humane tyktarmscarcinomceller ved G1 /S

i HT29 og GC3 /C1 celler behandlet med GANT61 (20 uM) i op til 48 hR, udtryk for målgener GLI1 og GLI2 var begge nedreguleret, og også HH ligandreceptor PTCH1, som bestemt ved QRT-PCR (figur 1A). Efterfølgende blev HT29 eller GC3 /C1 celler behandlet i to eksemplarer, med GANT61 (20 uM) efterfulgt af PI farvning og flowcytometrisk analyse for bestemmelse af cellecyklus fordelingen mellem G1, S og G2 /M-faser (Figur 1B). I begge cellelinier, celler akkumuleret i G1, 24 timer efter behandling med GANT61. I GANT61-behandlede HT29-celler, blev en stigning i G1-fase celler 20% i forbindelse med et tilsvarende fald i celler i G2 /M-fasen (14%) og i S-fase (5%), konsistent med en G1 /S checkpoint anholdelse. I GC3 /C1-celler, en stigning på 8% i G1-fase celler ved 24 timer efter GANT61 behandling også svarer til et tilsvarende reduktion i celler i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus (figur 1B).

cellerne blev behandlet i op til 48 timer med GANT61 (20 uM) eller med 0,2% DMSO (vehikelkontrol). (A) QRT-PCR af GLI1, GLI2 og PTCH1 gener fra tid 0-48 timer. (B) DNA blev ekstraheret ved 24 timer efter behandling, farvet med propidiumiodid, og efterfølgende analyseret for virkningen af ​​inhibering af HH-signalering på fasefordeling af celler i cellecyklussen ved flowcytometri.

cDNA microarray-analyser identificere ændringer i genekspression både fælles og unikke til HT29 og GC3 /c1 følgende GANT61 behandling

for at afgrænse de ændringer i genekspression i HT29 og GC3 /C1 menneskelig coloncarcinom cellelinjer som respons på behandling med den GLI1 /GLI2 antagonist, GANT61, ekspressionen af ​​18,401 menneskelige gener blev profileret i kontrolceller behandlet med vehikel (0,2% DMSO) og i celler behandlet med GANT61 (20 uM) i 24 timer. Gener med en falsk Discovery Rate (FDR) -adjusted p-værdi på 0,001 og fold forandring 1,5 blev anset differentielt udtrykte gener (degs) fremkaldt af GANT61 forhold til kontrolgruppen køretøj, hvoraf 1.368 gener udtrykkes forskelligt i HT29 og 1.002 gener i GC3 /C1-celler (figur 2). 755 gener eller 558 gener blev opreguleret, og 613 eller 444 gener blev nedreguleret, i HT29 og GC3 /C1-celler, hhv. 763 og 397 generne blev differentielt udtrykt og unik for HT29 eller GC3 /c1 hhv. Af de 763 DEGS unikke for HT29, 459 (60%) var opreguleret og 304 (40%) blev nedreguleret. Ligeledes af de 397 DEGS unikke for GC3 /c1, 262 (66%) blev opreguleret og 135 (34%), nedreguleres. I modsætning hertil blev 605 gener, som repræsenterer 3,4% af alle gener differentielt udtrykt som var fælles for begge cellelinier; af disse, 296 opreguleret (49%), og 309 (51%) blev nedreguleret (figur 2). Alle gener er fælles for både HT29 og GC3 /c1, der var signifikant opreguleret eller nedreguleret (p 0,001). Er angivet i tabel 1 og 2, henholdsvis

Celler blev behandlet med GANT61 (20 uM) eller vehikel alene (0,2% DMSO) i 24 timer, og total RNA ekstraheret som beskrevet i Materialer og Metoder. Ændringer i genekspression blev bestemt ved cDNA microarray gen profilering ved anvendelse af Illumina Menneske-ref8 V3.0 Bead-Chip array. Gener med en falsk Discovery Rate (FDR) -adjusted p-værdi (p 0,001) og fold forandring 1,5 blev anset degs. Overpanel: opreguleret gener. Lavere panel: down-regulerede gener. Differential udtryk for det samlede, unikke up-reguleret, unikke nedreguleret, fælles opreguleret, og fælles ned-regulerede degs, vises. Vejviser

Modulation af kanoniske signalering veje efter hæmning af HH signalering

Gener med væsentlige ændringer i udtryk følgende GANT61 behandling blev tildelt forskellige kanoniske signalveje og udsat for Ingenuity Pathway Analysis (IPA), hvor den resulterende 1.368 degs i HT29 og 1.002 degs i GC3 /c1 blev kortlagt til net defineret af IPA-databasen (figur 3). For de kortlagte degs herunder både op- og ned- regulerede gener, de 15 mest markant ændret kanoniske veje i HT29 demonstrerede -log (p-værdi) spænder fra 2,045 til 9,025, og i GC3 /c1 2,32 til 7,509. Af de 15 veje, der involverer gener betydeligt nedreguleret, 12 var fælles for begge cellelinier. De 3 fælles veje med den største forskellen nedreguleret udtryk omfatter gener involveret i DNA skade responset, cellecyklus checkpoint kontrol, og mitose. Andre veje nedreguleret involveret G1 /S og G2 /M DNA-skader checkpoints, DNA forløber stofskifte, og celle signalering involverer forskellige veje, herunder de involverede i kræft, som også demonstrere 3 underskrifter unikke til enten HT29 eller GC3 /c1 (Figur 3 ). Af de 15 veje involverer gener, som er den mest markant opreguleret, 8 er fælles for både HT29 og GC3 /c1, og 7 repræsenterer unikke veje for hver cellelinie, hvilket viser mere mangfoldighed i mønstre af opreguleret genekspression (Figur 3 ). De op-regulerede veje fælles for begge cellelinier omfatter stofskifte-relaterede, såsom steroider, pyruvat, glykolyse glutathion eller glycerolipiddesaturase og ikke direkte relateret til kontrol af celleproliferation.

De øverste 15 kanoniske signalveje , bestemt af IPA, der var betydeligt opreguleret eller nedreguleret af GANT61 behandling i HT29 og GC3 /C1 celler, vises. De 1.368 degs i HT29 og 1.002 degs i GC3 /c1 blev kortlagt til IPA- definerede netværk. De betydning p-værdier, der bestemmer sandsynligheden for, at associationen mellem generne i datasættet og den kanoniske vej er tilfældigt alene blev beregnet ved Fishers eksakte test, og udtrykkes som -log (p-værdi). A. Veje med beriget ned-regulerede gener. B. Veje med beriget up-regulerede gener. Blå: Veje er fælles for både HT29 og GC3 /c1. Rød: Pathways unikke for enten HT29 eller GC3 /C1. Gule pladser:. Forholdet mellem antallet af degs der kort til en bestemt kanonisk vej divideret med det samlede antal af gener, der gør op den vej

Gener, der demonstrerer differentierede fold ændre mønstre i GANT61-behandlede HT29 og GC3 /C1 celler

Fold ændre mønstre af de højest degs i HT29 og GC3 /c1 blev udvalgt, analyseret og vises i en varme kort for at vurdere og sammenligne lighed og forskelle i differential udtryk mellem de to cellelinjer behandlet med GANT61 (figur 4). Ud over gener med forskellige funktioner, som ikke er direkte relateret til HH-afhængig proliferation, up-regulerede gener, der påvirker G1 /S overgang og efterfølgende cellecyklus, og som er fælles for begge cellelinier, omfatter CDKN1A, og DNA -Skader-inducerbare udskrifter 3 og 4 (DDIT3 og DDIT4). Et betydeligt større antal gener involveret i cellulær proliferation og cellecyklus overgang gennem G1 /S grænsen, S-fase progression, og G2 /M overgang, var betydeligt nedreguleret i ekspression, og fælles for begge cellelinier. Disse omfatter CDC6 (involveret på G1 /S), tre gener, der driver indrejse i og passage gennem S-fasen (CCNE2, E2F2) og G2 (CCNA2), gener involveret i DNA-replikation og reparation (Tyms, POLE, TOP2A, TK1, POLE2), og to gener, der regulerer mitose (AURKB, CDC20;. Figur 4, asterisk)

zonekort blev genereret på Matlab (Mathworks), og sammenligner fold ændre mønstre af de højest degs i HT29 og GC3 /C1 celler efter GANT61 behandling. De højest DEGS demonstrerede en differentiel ekspression p-værdi på p 0,001 mellem vehikelkontrol (0,2% DMSO) og GANT61-behandlede celler. Venstre panel (rød): op-regulerede gener. Højre panel (grøn): nedregulerede gener. Gener betegnet med stjerner definere disse gener med specifikke roller i G1 /S overgang, S-fasen progression, DNA replikation eller reparation, eller regulering af G2- eller M- faseovergange. Fold ændringer af alle nedreguleres DEGS og alle undtagen én opreguleret DEG er ≤8 (central farvespektrum bar).

fra 296 op-regulerede gener, ud over generne sammenligneligt repræsenteret i varmen kort, der omfatter DDIT3 (GADD153) og DDIT4 (REDD) 1, blev yderligere roman DNA-skader-inducerbare udskrifter også identificeret og omfatter DDIT2 (GADD45G), PPP1R15A (GADD34) og ATF3 (tabel 1). TP53INP1, som kan regulere cellecyklus arrest, og TP53INP2, identificeret i celledød svar, var også opreguleret. Af de 309 gener betydeligt nedreguleret i respons på GANT61, hidtil ukendte gener identificeret, omfatter KIAA0101 (p15 [PAF]), replikationsfaktor C varianter 2, 3, 4, 5, CDT1, E2F transkriptionsfaktorer CDCA4 og TFDP1, MDC1, PCNA , FANCD2, og de involverede i DNA-reparation, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 og HELLS (tabel 2) gener.

differentielt udtrykte gener, der er involveret i G1 /S og G2 /M overgange

for yderligere at evaluere de involveret i styring af cellecyklusprogression i humane coloncarcinomceller gener efter GANT61 behandling, 10 gener involveret i G1 /S eller G2 /M-overgange, identificeret ved IPA, blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Gener, der kræves ved G1 /S grænsen for G1 /S overgang, eller til induktion af et G1 /S checkpoint efter cytostatiske signaler, omfatter de to cyclinafhængige kinaseinhibitorer, p21

Cip1 (CDKN1A) og p15

Ink4B (CDKN2B), som blev opreguleret af 5.2- og 3.1- fold, 24 timer efter GANT61 administration (tabel 3). Yderligere gener, der er nødvendige for G1 /S overgang, der blev nedreguleret indbefatter E2 transkriptionsfaktor E2F2 (-4.2-fold), og andre kritiske gener, der blev nedreguleret ved 2.1- at 3.2- fold, indbefatter cyclin E (CCNE2) , CDK2 og Cdc25A. Ved G2 /M, GANT61 induceret nedreguleret ekspression af CCNA2 (cyclin A2), cyclin B1 (CCNB1), cyclin B2 (CCNB2), CDK1 (CDC2), og Cdc25C ved 2.3- til 3,1- gange (tabel 3).

for at bestemme robustheden af ​​cDNA microarray genekspression profilering efter behandling af HT29 og GC3 /C1 celler med GANT61 (20 uM) i 24 timer, blev QRT-PCR anvendes til at bestemme ændringer i ekspressionen af ​​den valgte gruppe på 10 DEGS bestemt ud fra cDNA-mikroarrays. Generne involveret og primere syntetiseret er vist i tabel 4. QRT-PCR blev udført på cDNA frembragt under anvendelse total RNA uafhængigt isoleret fra GANT61-behandlede HT29 og GC3 /C1 celler til 0 timer, 16 timer, 24 timer, 38 timer og 48 timer efter behandling. GAPDH blev anvendt til at normalisere alle QRT-PCR data. Gener bestemt ved QRT-PCR omfattede udtryk for E2F2, CCNE2, Cdc25A og CDK2 ved G1 /S, der blev nedreguleret, opregulering af CDKN1A og CDKN2B ved G1 /S, og nedregulering af CCNA2, Cdc25C, CCNB2 og CDK1 ved G2 /M (figur 5). Den opreguleret eller nedreguleret ændringer i genekspression efter GANT61 behandling og bestemmes ved cDNA microarray profilering, blev bekræftet ved QRT-PCR (figur 5).

Celler blev behandlet med vehikel alene (0,2% DMSO) eller GANT61 (20 uM) i 16 timer, 24 timer, 38 timer, eller 48 timer. Totalt RNA blev ekstraheret og QRT-PCR blev udført som beskrevet i Materialer og fremgangsmåder ved anvendelse af primersæt der er anført i tabel 2. Data repræsenterer middelværdien ± SD af 4 bestemmelser, og GAPDH blev anvendt til at normalisere de relative mRNA-niveauer.

Discussion

HH signalvej aktiveres i en række forskellige humane cancere følgende mutationer i gener, der regulerer kanoniske HH signalering, herunder receptoren PTC, og HH signalmolekyle, SMO, og kan også aktiveres via transkriptionel opregulering af HH-ligander (gennemgået i [3]). Denne vej er af stigende betydning på grund af få indsigt i dets fremtrædende rolle i mange udviklingsmæssige processer, og i opretholdelsen af ​​den maligne fænotype i en lang række humane cancere, hvis vækst har vist sig at være forhindret ved selektiv inhibering af konstitutiv HH pathway aktivitet [14], [35], [36]. Tumorer i hjernen, prostata, hud, bugspytkirtel og nyrer har vist behovet for HH-GLI signalering, og har reageret på inhibering af HH signalering målmolekylet SMO ved cyclopamin eller SMOshRNA [4], [19], [20] , [21], [22], [23].

de transkriptionelle aktivatorer i HH signalering omfatter medlemmer af GLI familie af transkriptionsfaktorer, GLI1 og GLI2, som har både tydelig samt overlappende funktioner [16 ]. Aktivering af GLI-proteinerne er en indviklet proces, der involverer modifikationer og interaktioner af en række positive og negative pathway regulatorer og er ikke fuldt forstået [1], [14], [35]. Målgener reguleret af HH signalvejen forskellige mellem væv og celletyper, samt at være påvirket af tilstedeværelsen eller fraværet af regulatoriske faktorer co-udtrykt med GLI proteiner, der i sidste ende bestemmer transkriptionelle programmer aktiveres af HH signalering [6], [37 ]. Således onkogene signalveje konvergere på kanoniske HH signalering på niveau med de GLI transkriptionsfaktorer og derudover på målgener nedstrøms for GLI1 og GLI2 til yderligere at drive HH signalvejen i cellulær overlevelse i maligniteter [6], [7], [20 ], [38], [39], [40]. HH signalering fænotype er således væsentligt påvirket og i sidste ende bestemmes af co-ekspression af yderligere regulatoriske faktorer, og derigennem af cellulære kontekst af genekspression.

HH signalering spiller en rolle i differentieringen program af normale intestinale villi [11], [12], [41], og det er blevet foreslået for nylig, at human coloncancer epitelceller vise et HH-GLI signalering akse i processen med carcinogenese [24], [25]. Ekspression af HH-GLI pathway komponenter konsekvent påvist i en analyse af 40 primære humane coloncarcinomer og tumorer metastatisk til leveren [26], i overensstemmelse med resultaterne af tidligere efterforskere [25], [42], [43]. Således var ved hjælp QRT-PCR, ekspressionen af ​​GLI1, PTCH1, GLI2 og SHH bestemt i alle humane coloncarcinomer undersøgte. Kravet om både GLI1 og GLI2 til vedvarende proliferation og overlevelse af humane coloncarcinom-cellelinier in vitro, herunder HT29, blev påvist under anvendelse af siRNA teknologi [26]. Desuden knockdown af SMO ved SMOshRNA forhindrede vækst af HT29-celler i SCID-mus, mens wt HT29 subkutane xenotransplantater reagerede på cyclopamin ved reduktion i tumorvolumen [26]. Således kanonisk aktivering af GLI1 og GLI2 via SMO er vigtig for overlevelse og proliferation af humane colon carcinomceller in vivo.

I den aktuelle undersøgelse, funktionen af ​​både GLI1 og GLI2 nedstrøms SMO blev inhiberet i tilstedeværelse af GANT61, et lille molekyle inhibitor, der blev identificeret fra en celle-baseret screening til specifikt at inhibere GLI1-medieret transkription, men der inhiberede også funktionen af ​​GLI2 [34]. Dette middel blev valgt til specifikt at inhibere de endelige dommere over HH signalering, GLI transkriptionsfaktorer, i belysningen af ​​de nedstrøms målgener der bestemmer HH-afhængig proliferation i humane coloncarcinomceller. To cellelinjer, godt karakteriseret i vores laboratorier, HT29 og GC3 /c1, blev behandlet med GANT61 (20 uM) i 24 timer, og udtryk for GLI1, GLI2 og PTCH1 mRNA blev nedreguleret. Endvidere er virkningerne på celleproliferation som bestemt ved fordelingen af ​​celler i cellecyklussen og flowcytometrisk analyse viste akkumulering af celler i G1 efter behandling, med en ledsagende fald af celler fra G2 /M rum, og i tilfælde af HT29 , også fra S-fase, hvilket tyder induktionen af ​​en G1 /S checkpoint.

HT29 og GC3 /C1-celler blev efterfølgende behandlet med GANT61 (20 uM) i 24 timer blev RNA ekstraheret, og ændringer i gen udtryk blev bestemt ved Illumina cDNA microarray profilering. Efter statistiske analyser, 1.368 gener i HT29 og 1.002 gener i GC3 /c1, blev bestemt til at være betydeligt moduleres af GANT61 behandling (FC 1,5; p 0,001). For gener, der var opreguleret i ekspression, 296 gener var fælles for begge cellelinier og til nedregulerede gener, 309 gener var fælles for begge cellelinier. Blokaden af ​​celler ved G1 /S grænsen fremgår af opreguleret udtryk for p21

Cip1 og p15

Ink4b der dels regulerer G1 /S overgang. P15

Ink4b er medlem af INK4 familie af CDK-inhibitorer, induceres som respons på cytostatiske signaler [32], [44], og komplekser med cyclin D /CDK4 eller cyclin D /CDK6 at mediere G1-fasen ved G1 /S overgang på visse systemer [30], [32]. p21

Cip1 kan binde en bred vifte af cyklin-CDK-komplekser, med en præference for dem, der indeholder CDK2 (revideret i [31], [45], og i løbet af en normal cellecyklus, letter aktiv cyklin-CDK kompleksdannelse at fremme celleproliferation. Men når overudtrykkes, p21

Cip1 danner en inhiberende kompleks med cyclin E /CDK2, hvilket fører til G1 og følgelig S- fasen, hvorved der dannes G1 /S kontrolpunkt [46], [47]. den planlagte timingen af ​​ekspression af cycliner E, A og B, der kører cellecyklusprogression, er afspejlet i de store ændringer i de faser af cellecyklussen. cyclin E udtrykkes ved maksimale niveauer i celler, der undergår G1 til S overgang, faldende i S- fase progression, således at G2 /M-celler er cyclin E-negativ (gennemgået i [30]). cyclin A udtrykkes i sene G1, demonstrerer udtalt ekspression under S-fasen, og forøges, når cellerne nærme G2, med nedbrydning i tidlig mitose; B-type cycliner begynder at blive udtrykt i sene S-fase, og drev cellerne selvom G2- og M- faser af cellecyklussen [30]. CDK2 styrer G1 /S overgang ved kompleksdannelse med cyclin E, og aktiveres af Cdc25A, som dephosphorylerer CDK2 [48]. CDC2 styrer cellulær indtræden i mitose ved G2 /M overgang, hvorved der dannes komplekser med cycliner A og B, der aktiveres af Cdc25C, og er nedreguleret i slutningen M-fase [29]. Alle disse gener er nedreguleret i ekspression som reaktion på inhibering af GLI1 /GLI2 funktion (tabel 2). Således signaler fremkaldte at fremme cellulær akkumulering ved G1 /S fører til undertrykkelsen af ​​gener, der regulerer yderligere cellecyklusprogression, og p21

Cip1 ekspression er blevet vist at udtømme ekspressionen af ​​gener, der regulerer DNA-replikation og reparation, og mitose [49], [50], [51]. I den aktuelle undersøgelse disse gener omfatter CDC6 (aktiv ved G1 /S overgang og afgørende for initiering af DNA-replikation), Tyms, TOP2A, TK1, POLE og POLE2 (S-fase), og AURKB og CDC20 (mitose [52] [53]), bestemt ved zonekort analyse. En skematisk fremstilling af de involverede i GANT61-induceret inhibering af cellecyklusprogression ved G1 /S, S-fase progression gener, og regulering under G2- og M-faser, der er konstateret fra cDNA microarrays, varme kort analyse, og ved QRT-PCR , er vist i figur 6, og involverer 5 af de 12 almindelige signalveje bestemt ved IPA-analyse.

fra cDNA microarray, varme kort, og QRT-PCR-analyser, gener involveret i forskellige faser af cellecyklussen, herunder G1 /S overgang, og progression gennem S-G2- og M- faser, vises. De identificerede gener inkluderer CDK-inhibitorer, medlemmer af CDK og CDC familier, cycliner, gener involveret i DNA-replikation og reparation, og gener, der regulerer mitosespindelen, og involverer fem af de 12 almindelige signalveje bestemt af IPA-analyse. Rød: Up-regulerede gener. Grøn: Down-regulerede gener. Lys skygge → mørk skygge, øge forskellen udtryk.

Omfattende cDNA microarray gen profilering analyse af gener, der bestemmer HH signalering fænotype er blevet udført kun i ikke-cancer-celle-modeller. I disse systemer er GLI aktivering blevet stimuleret af EGF behandling [6], stabil GLI1 eller HA-RAS-ekspression [7], eller ekspression af konstitutivt aktiveret GLI2 [16]. I disse undersøgelser Cyclin D [6], [7], GADD153 [7], CDKN2B, CDKN1A, CDK2, PCNA, TOP2A, CCNB1, XRCC1 [16], er blevet identificeret som gener aktiveres nedstrøms GLI.