PLoS ONE: Anti-Cancer Effekter af Reić /Dkk-3-koder adenovirusvektor til behandling af ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Målsætninger

Reić /DKK-3 er nedreguleret i en bred vifte af humane cancerceller og anses for at fungere som en tumorsuppressor. Vi har tidligere rapporteret, at Reić /DKK-3-udtrykkende adenovirus vektor (Ad-Reić) inducerede endoplasmatiske reticulum (ER) stress og kræft-specifikke apoptose i human prostatacancer. I denne undersøgelse undersøgte vi den terapeutiske virkning af Ad-Reić på ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Materialer og metoder

Vi undersøgte antitumorvirkningen af ​​Ad-Reić på 25 NSCLC cellelinjer

in vitro

og A549 celler

in vivo

. To af disse cellelinjer blev kunstigt etableret som EGFR-tyrosinkinasehæmmer (TKI) resistente underlinjer.

Resultater

Ad-Reić-behandling hæmmede celle levedygtighed med 40% eller mere i 13 ( 52%) af de 25 cellelinier ved infektionsmultiplicitet (MOI) på 20 (20 MOI). Disse cellelinier blev betragtet som værende yderst følsomme celler. Cellelevedygtigheden af ​​en ikke-malign immortaliseret cellelinie, OUMS-24, blev ikke inhiberet ved 200 MOI af Ad-Reić. Virkningerne af Ad-Reić på EGFR-TKI resistente underlinjer var ækvivalente med dem i forældrenes cellelinjer. Her viste vi, at Ad-Reić behandling aktiveret c-Jun N-terminal kinase (JNK) i NSCLC cellelinjer, hvilket indikerer induktion af ER stress med GRP78 /BiP (GRP78) opregulering og resulterer i apoptose. En enkelt intratumoral injektion af Ad-Reić hæmmede tumorigen vækst af A549 celler betydeligt

in vivo

. Som prædiktive faktorer af følsomhed for Ad-Reić behandling i NSCLC, vi undersøgte udtrykket status GRP78 og coxsackievirus og adenovirus receptor (CAR). Vi fandt, at kombinationen af ​​de GRP78 og CAR udtryksmæssige status kan anvendes som en prædiktiv faktor for Ad-Reić følsomhed i NSCLC celler.

Konklusion

Ad-Reić induceret JNK aktivering og efterfølgende apoptose i NSCLC celler. Vores undersøgelse viste, at Ad-Reić har terapeutisk potentiale mod NSCLC, og at udtrykket statusser for GRP78 og CAR kan forudsige en potentiel terapeutisk fordel af Ad-Reić

Henvisning:. Shien K, Tanaka N, Watanabe M, Soh J, Sakaguchi M, Matsuo K, et al. (2014) Anti-Cancer Effekter af Reić /Dkk-3-koder adenovirusvektor til behandling af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (2): e87900. doi: 10,1371 /journal.pone.0087900

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: December 4, 2013; Accepteret: December 30, 2013; Publiceret: 3 feb 2014

Copyright: © 2014 Shien et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Ingen strøm finansieringskilder til denne undersøgelse

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til død af kræft på verdensplan , og den metastatiske formular er en vigtig faktor, der fører til dødelighed [1]. Der er to store histologiske undertyper af lungecancer: ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet lungecancer. Nylige intensive undersøgelser har identificeret sygdomsfremkaldende molekylære forandringer, der har direkte ført til udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier og har forbedret prognose patient [2]. For eksempel mutationer af epidermal vækstfaktor receptor genet (

EGFR

) findes hos ca. 30% af NSCLCs, især i lunge-adenocarcinomer og EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) er særligt effektive i disse tumorer [ ,,,0],3], [4]. For nylig er crizotinib vist sig at være effektive til NSCLCs med en

EML4-ALK

fusionsgen [5], [6]. Men antallet af patienter med disse ændringer er begrænset og lille forbedring i prognosen er opnået NSCLCs uden disse narkotika-følsomme ændringer. Endvidere erhvervet resistens vinder forekommer i de fleste

EGFR

-mutant tumorer, som tidligere havde responderet på EGFR-TKI, efter gennemsnitligt 10 måneders behandling [7]. Således er der behov for en ny terapeutisk modalitet til at forbedre det kliniske resultat af patienter med lungekræft.

Reić /DKK-3, et medlem af Dickkopf (Dkk) gen-familien, er oprindeligt fundet i immortaliserede celler og har blevet rapporteret at være en tumor suppressor; sit udtryk er signifikant nedreguleret i en bred vifte af kræft celletyper, herunder lungekræft [8]. Det Heatmap billede af messenger-RNA (mRNA) udtryk for

Reić /DKK-3

gen fra UCSC Cancer Genome Gennemse, som er frit tilgængelig offentlig database (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (vi hentede data den 16. juli 2013), viste, at

Reić /DKK-3

genekspression blev reduceret i størstedelen af ​​undersøgte prøver af både lunge adenokarcinomer og planocellulært karcinom sammenlignet med normale lungevæv (figur S1) . Derudover kunne det bekræftes fra en offentlig database, der udtryk for

Reić /DKK-3

var også lav i mange NSCLC cellelinjer (Gene Expression Omnibus repository [http: //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo, GEO tiltrædelse GSE4824]). Reić /Dkk-3 vides at interferere med Wnt signalering via Wnt receptorer [9], [10] og er tidligere blevet rapporteret at spille en særlig rolle i induktionen af ​​apoptose og inhibering af metastase [11], [12]. Den induktion af apoptose i cancerceller er primært forårsaget af endoplasmatiske reticulum (ER) stress fremkaldt af overproduktion af Reić /Dkk-3 i cellerne. ER stress udløser aktiveringen af ​​c-Jun N-terminal kinase (JNK), som er en kritisk begivenhed i apoptose induceret af overproduktion af Reić /Dkk-3 under anvendelse af en adenovirusvektor (Ad-Reić) [11], [13] . I vores tidligere undersøgelser fandt vi, at Ad-Reić havde en terapeutisk virkning på forskellige typer af human cancer, herunder prostata, testikel, lungehinden, og brystcarcinomer [11], [13] – [15]. Ad-Reić infektion og Reić /Dkk-3-protein er også kendt for opregulere antitumor immunosystem [16]. Baseret på prækliniske data, har en klinisk undersøgelse med Ad-Reić til human prostatacancer været i gang i Japan og USA (NCT01197209).

I denne undersøgelse undersøgte vi den terapeutiske virkning af Ad-Reić på NSCLC celler

in vitro

in vivo

. Vi undersøgte også faktorer relateret til følsomheden af ​​cellelinier til Ad-Reić som et skridt i retning af udviklingen af ​​tilpassede Ad-Reić terapi for patienter med NSCLC.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Okayama University (Permit nummer: OKU-2012-549). Alle operation blev udført under ketamin og xylazin anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cellelinjer

Seksten cellelinier af human lunge adenocarcinom, 3 pladecellekræft, 3 storcellet carcinom , 1 adenosquamøst cellecarcinom, 2 EGFR-TKI-resistente underlinjer fra HCC827 og PC-9-celler (HCC827-GR-HØJ2 og RPC-9), den humane mesotheliom cellelinie MSTO-211H (211H), og det normale humane fibroblastcellelinie line OUMS-24 blev anvendt i denne undersøgelse (tabel 1). Detaljerne i cellelinier anvendt i denne undersøgelse, er beskrevet i fremgangsmåde S1. Den HCC827-GR-HØJ2 og RPC-9 cellelinjer blev etableret som beskrevet tidligere [17], [18]. OUMS-24 blev etableret på vores institution [19].

Adenovirus vektor, der bærer Reić /DKK-3

Reić /DKK-3 blev overudtrykt ved hjælp af en adenovirus (Ad-Reić) som vi tidligere har genereret [11]. En fuld-længde cDNA af Reić /Dkk-3 blev integreret i en cosmid vektor pAxCAwt og overføres til en adenovirusvektor af COS-TPC metode (Takara Bio, Shiga, Japan). En adenovirusvektor bærer LacZ-genet (Ad-LacZ) blev også anvendt som kontrol [11].

Cellelevedygtighed assay

Celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en tæthed på 1,5 x 10

3 celler /brønd ved 48 timer efter infektion med Ad-LacZ eller Ad-Reić ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 20, 100 eller 200 MOI. Cellernes levedygtighed blev evalueret 3 dage senere ved hjælp af en MTS assay med CellTiter 96 Vandig One Solution Reagent (Promega, Madison, WI).

Apoptose assay

For at undersøge

in vitro

induktion af apoptose efter behandling, vi podet cellerne i 6-brønds plader og inkuberes dem i 24 timer. Cellerne blev behandlet med Ad-LacZ eller Ad-Reić ved 20 MOI i serum-frit medium (500 pi) i 2 timer; mediet blev derefter udskiftet med frisk komplet medium (2 ml). Efter yderligere 48 h inkubation blev Hoechst 33342 farvestof (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tilsat til mediet i en koncentration på 2 pg /ml, og cellerne blev inkuberet i mørke i 10 min. Hoechst 33342 er en interkalerende farvestof, der muliggør bestemmelsen af ​​variationer i den samlede kromatin mængden og graden af ​​chromatinkondensering [15]. Ved hjælp af fluorescensmikroskopi, identificerede vi apoptotiske celler ved tilstedeværelsen af ​​kondenserede eller fragmenterede kerner. Apoptotiske celler blev talt i 5 forskellige områder under mikroskopisk observation.

Western blot-analyse

Den detaljerede protokol til Western blot-analyse er beskrevet i metode S1. Det blev udført under konventionelle betingelser ved hjælp af følgende antistoffer: kanin anti-human Reić /DKK-3 antistof rejst i vores laboratorium [11]; kanin-anti-humant GRP78 /BiP (GRP78) (ab21685; Abcam, Cambridge, MA); kanin-anti-humant SAPK /JNK (# 9252) og kanin-anti-humant phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185; # 9251) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); kanin anti-humant coxsackievirus og adenovirus receptor (CAR) (HPA030411; Atlas antistoffer, Stockholm, Sverige); og muse-anti-actin (MAB1501, Millipore, Billerica, MA). De følgende sekundære antistoffer blev anvendt: gede-anti-kanin eller anti-mus IgG-konjugeret peberrodsperoxidase (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). At påvise specifikke signaler blev membranerne undersøgt anvendelse af ECL plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK). Derudover båndintensiteter for GRP78, CAR, og actin, der repræsenterer deres ekspressionsniveauer, blev målt ved anvendelse ImageQuant TL software (GE Healthcare Bioscience) og kvantificeres ved GRP78 eller bil /actin-forhold.

tumorvækstassay i vivo

A549-celler (5 x 10

6 i 50 pi phosphatpufret saltvand [PBS]) blandet med 50 pi Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) blev subkutant injiceret i den højre flanke af voksne BALB /c nu /nu mus (CLEA Japan, Tokyo, Japan). Tumorvolumenet blev beregnet under anvendelse af empiriske formel V = på 1/2 × [(den korteste diameter)

2 × (den længste diameter)]. Når tumorerne havde nået ca. 50-100 mm

3, mus (n = 15) blev tilfældigt inddelt i 3 behandlingsgrupper: (a) PBS; (B) Ad-LacZ; og (c) Ad-Reić. Vira (1 × 10

9 pfu) i 100 pi serumfrit medium blev administreret intratumoralt. I slutningen af ​​eksperimenterne blev mus aflivet efter 24 dage efter den virale injektion og tumorer blev høstet, målt, og fotograferet.

Statistiske analyser

Alle data blev analyseret under anvendelse af STATA ver.12 (STATA Corp., College Station, TX). Fishers eksakte test blev anvendt efter behov. For en sammenligning af induktion af apoptose mellem Ad-Reić-behandlet og Ad-LacZ-behandlede A549 celler, blev en Cochran-Mantel-Haenszel statistik anvendes til at sammenligne. Gentagen måling ANOVA blev anvendt til sammenligning af xenotransplanted NSCLC tumor størrelser blandt PBS, Ad-LacZ og Ad-Reić.

P

0,05 blev betragtet som signifikant. Alle tests var to-sidet.

Resultater

Effekt af Ad-Reić på NSCLC cellelinjer

Vi undersøgte hæmning af cellelevedygtighed hjælp Ad-Reić og en MTS assay . I 13 (52%) af 25 NSCLC cellelinjer, Ad-Reić behandling ved 20 MOI inhiberede cellelevedygtighed (40% -60% hæmning) sammenlignet med Ad-LacZ behandling (tabel 1, figur 1). Disse cellelinjer blev betragtet som meget følsomme over for Ad-Reić. I modsætning hertil blev 12 cellelinier (48%) ikke inhiberet af Ad-Reić behandling ved 20 MOI og blev betragtet som resistente celler. OUMS-24 blev ikke hæmmet ved 20 eller 200 MOI af Ad-Reić. At bemærke, Ad-Reić behandling ved 100 og 200 MOI forbedret inhibering af cellelevedygtighed (100 MOI: 15% -59% inhibering, 200 MOI: 40% -78% hæmning) sammenlignet med Ad-LacZ behandling (tabel 1) . Således definerede vi 20 MOI som en lav MOI værdi og 200 MOI som en høj MOI-værdi. Til sammenligning blev Ad-Reić behandling også udført i den humane mesotheliom cellelinie 211H, som vi tidligere rapporteret at være Ad-Reić-sensitive [14]. Den 211H blev ikke inhiberet ved 20 MOI men blev inhiberet ved 200 MOI af Ad-Reić (tabel 1). De kendte molekylære karakteristika for hver cellelinje er vist i tabel 1. De 25 NSCLC cellelinier bestod af 8

EGFR

-mutant, 6

KRAS

-mutant, 1

HER4

-mutant, en

NTM

-mutant, en

PIK3CA

-mutant, en

EML4-ALK

fusion, en

HER2

-amplified, og 6 cellelinjer uden genændringer opført. Ni af de 17

EGFR

-Wild typen cellelinjer var følsomme over for Ad-Reić. HCC827 og dens modstandsdygtige sublinie, HCC827-GR-HØJ2, viste en lignende grad af følsomhed over for Ad-Reić. Ingen tendens i molekylær genotype blev set mellem de følsomme og ikke-følsomme cellelinjer. Disse resultater tydede på, at effekten af ​​Ad-Reić ikke afhænger af en kendt molekylær genotype.

De hæmning satser 25 NSCLC cellelinjer transficeret med Ad-Reić sammenlignet med Ad-LacZ vises som sort bar i 20 MOI og hvide bar i 200 MOI. Tretten cellelinjer med over 40% hæmning sats i 20 MOI er defineret som meget følsomme og 12 cellelinjer med lavere hæmning sats i 20 MOI er defineret som resistente. Alle de resistente cellelinier viser over 40% inhiberingshastighed i 200 MOI. De cellelinjer er klassificeret i 3 kategorier baseret på GRP og CAR proteinekspression niveau som følger; kategori A (lav GRP /høj CAR), kategori B (lav GRP /lav CAR eller høj GRP /høj CAR), kategori C (høj GRP /lav CAR). Alle 8 meget følsomme cellelinjer blev inkluderet i kategori A, og alle 5 resistente cellelinier blev inkluderet i kategori C. Sq; pladecellecarcinom, AD; adenocarcinom, LC; storcellet carcinom, ADSQ; adenosquamøst cellecarcinom, MM; malignt mesotheliom, NHF; normal human fibroblast.

Hoechst 33342-farvning blev udført i A549-celler for at undersøge induktionen af ​​apoptose. Apoptotiske celler blev observeret i Ad-Reić-behandlede A549-celler (figur 2A). Gennemsnittet af apoptose var 22%, og det var signifikant (p 0,001 af Cochran-Mantel-Haenszel-test). Forøget i sammenligning med kontrolgruppen Ad-LacZ behandling

(a) Induktion af apoptose efter

in vitro

Ad-Reić behandling som undersøgt i A549 celler ved hjælp af Hoechst 33342 farvning. Den øvre panel viser udseendet af apoptotiske celler efter Ad-Reić behandling. Det nedre panel viser den apoptotiske sats af A549-celler efter den angivne behandling. I alt 5 forskellige felter blev undersøgt under et mikroskop for at bestemme den apoptotiske sats. En signifikant forskel blev observeret (* p 0,001) mellem Ad-LacZ og Ad-Reić behandling. (Bar: 100 pm) (b) Western blot-analyse for proteiner involveret i signaltransduktion udløst af Ad-Reić. Celler blev høstet ved 48 timer efter transfektion med Ad-LacZ eller Ad-Reić ved 20 MOI. (C) H460-celler, som er resistente over for adenovirus transduktion, blev høstet ved 48 timer efter transfektion med Ad-LacZ eller Ad-Reić ved 20, 100 og 200 MOI.

Virkningen af ​​rekombinant Reić /DKK-3 protein på NSCLC cellelinjer blev undersøgt i 7 tilfældigt udvalgte cellelinier (NCI-H522, NCI-H611, NCI-H1299, NCI-H1819, NCI-H2009, PC-9, og A549). MTS assay viste, at Reić /Dkk-3-protein ikke påvirkede cellelevedygtigheden i de undersøgte cellelinier, når de indgives ved en koncentration i området fra 1 til 200 ug /ml (data ikke vist).

Ekspression af GRP78 og CAR som reaktion på Ad-Reić terapi

Som prædiktive faktorer af Ad-Reić følsomhed i NSCLC, vi undersøgte udtryk for GRP78 og CAR; disse udtryk statusser blev korreleret med hæmning af cellernes levedygtighed af Ad-Reić i 13 cellelinjer. En tidligere undersøgelse rapporterede, at overekspression af GRP78 inhiberede ER-stress, som kan være modsat korreleret med virkningen af ​​Ad-Reić. CAR ekspression er stramt forbundet med effekten af ​​adenovirus-infektion, som kan være positivt korreleret med virkningen af ​​Ad-Reić. Western blotting blev udført, og ekspressionsniveauet blev kvantificeret som vist i tabel 1 og figur 1. median (række) af GRP78 og CAR udtryk var 0,24 (0,075 til 0,98) og 0,60 (0,080 til 2,1), hhv. Baseret på disse data blev celler med et GRP78 ekspressionsniveau mere end 0,25 defineret som High CRP78 ekspression, mens dem med en GRP78 mindre end 0,24 blev defineret som lav GRP78 ekspression. Vedrørende CAR blev 15 cellelinier signifikant højt CAR-ekspression (over 0,50) defineret som High CAR ekspression, mens 10 cellelinier disse med et særlig lavt niveau af CAR-ekspression (under 0,20) blev defineret som lav CAR ekspression. GRP78 udtryk var lav i 8 af de 13 Ad-Reić-sensitive celler (62%) og i 4 af de 12 Ad-Reić-resistente celler (33%). CAR udtryk var høj i 12 af de 13 Ad-Reić-sensitive celler (92%) og i 3 af de 12 Ad-Reić-resistente celler (25%).

Dernæst vi klassificeret de cellelinjer i tre kategorier baseret på grp78 og CAR udtryk statusser; celler med en lav GRP78 /Høj CAR udtryk blev klassificeret som kategori A, blev de med lav GRP78 /Lav CAR eller High GRP78 /Høj CAR udtryk klassificeret som kategori B, og dem med høj GRP78 /Lav CAR udtryk blev klassificeret som kategori C. de høje følsomme cellekulturer satser var 100% i kategori A (8 af 8, 95% konfidensinterval [CI]: 63 til 100), 42% i kategori B (5 ud af 12, 95% CI: 15-72), og 0% i kategori C (0 ud af 5, 95% CI: 0-52) (tabel 2). Kategorierne blev signifikant associeret med følsomheden over for Ad-Reić behandling (p 0,01).

JNK og GRP78 udtryk i NSCLC cellelinjer behandlet med Ad-Reić

En western blotting analyse viste signifikant udtryk for Reić /DKK-3 protein i 14 NSCLC cellelinjer behandlet med Ad-Reić. I 9 cellelinjer inficeret med 20 MOI, Ad-Reić behandling resulterede i phosphorylering af JNK og opregulering af GRP78 (figur 2b). I de øvrige 8 cellelinjer, som var relativt resistent over for Ad-Reić, aktiveringen af ​​JNK og GRP78 blev observeret ved højere MOI værdier (100 og 200 MOI) (Figur 2c).

Effekt af Ad-Reić på NSCLC tumorer i en xenotransplantation model

Vi undersøgte effekten af ​​Ad-Reić på væksten af ​​A549 celler

in vivo

. En uge efter transplantation, når tumoren volumen nåede 50 til 100 mm

3, 1 x 10

9 plakdannende enheder af Ad-Reić eller Ad-LacZ i 100 pi PBS eller 100 pi PBS alene var injiceret intratumoralt. De voksede progressivt i PBS og Ad-LacZ behandlingsgrupper i den efterfølgende 24-dages observationsperiode. I modsætning hertil tumorvækst i Ad-Reić behandlingsgruppen var signifikant (p 0,001 ved gentagen måling ANOVA). Undertrykt under observationsperioden (fig 3a, b)

(a) Middelværdien volumen af subkutane xenotransplantattumorer blev beregnet for 5 mus i hver gruppe. En signifikant forskel blev observeret mellem resultaterne af Ad-Reić og Ad-LacZ behandling (* p 0,001 ved gentagen måling af ANOVA). (B) Udseende af tumorerne på tidspunktet for aflivning efter behandling med PBS, Ad-LacZ, og Ad-Reić.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at Ad-Reić var ​​direkte virkning i mere end halvdelen af ​​NSCLC cellelinier, der blev undersøgt, uafhængigt af dets kendte driver ændringer såsom

EGFR

og

KRAS

mutationer. Et dyr xenograftmodel viste også den terapeutiske virkning af Ad-Reić. Den anti-tumor effekt af Ad-Reić afhænger ER-stress-medieret JNK-aktivering belastet af overproduktion af Reić /Dkk-3-protein, hvilket resulterer i induktionen af ​​apoptose [14], [20]. Aktiveringen af ​​JNK, hvilket er et væsentligt skridt i induktion af ER stress og apoptose af Ad-Reić, blev observeret ved 20 MOI i NSCLC cellelinjer. På den anden side blev den anti-tumor effekt af rekombinant Reić /DKK-3 protein ikke overholdes, som i andre former for kræft, der tidligere blev undersøgt. Oprindeligt Reić /DKK-3 blev identificeret som et sekretorisk protein og blev antaget til at udøve en fysiologisk funktion, men dens celleoverfladereceptor og dens rolle som en sekretorisk protein er ikke blevet identificeret.

Vi definerede 20 MOI som en lav MOI værdi og 200 MOI som en høj MOI værdi, fordi de normale human fibroblast cellelinje OUMS-24 ikke blev inhiberet ved 20 eller 200 MOI af Ad-Reić, hvorimod maligne cellelinier blev inhiberet, når MOI værdi blev hævet til 100 og 200 MOI i cellelinier, hvor Ad-Reić havde været ineffektive ved 20 MOI. I NSCLC, Ad-Reić var ​​effektivt ved en lav MOI værdi i mere end halvdelen af ​​de cellelinjer, der blev testet. I betragtning af det resultat, at 211H kun blev hæmmet på et højt MOI værdi, kan Ad-Reić være mere effektiv i NSCLC end i lungehindekræft.

Patient valg baseret på de molekylære karakteristika af tumorceller er et vigtigt tema for at maksimere terapeutiske fordele og minimere bivirkninger. Til dette formål har vi fokuseret på de GRP78 udtryk og CAR ekspressionsniveauerne. GRP78 er et medlem af Hsp70-familien, der tjener som en ER stress-signalering regulator [21]. En tidligere undersøgelse har vist, at overekspressionen af ​​GRP78 tillægges resistens over for en lang række kemoterapeutiske midler i forskellige former for celler [22]. Vi viste også, at den erhvervet resistens klon af PC-3 celler til Ad-Reić etableret efter gentagen eksponering for Ad-Reić udstillet et højt udtryk niveau GRP78 sammenlignet med forældrenes PC-3 celler [13]. Teoretisk set bør Ad-Reić være effektive for tumorceller, der er defineret som kategori A og ikke så effektive for dem, der defineres som kategori C. Selv følsomme celler i kategori B blev identificeret, alle 8 celler i kategori A reagerede på Ad-Reić behandling. Disse resultater antydede, at udtrykket statusser for GRP78 og CAR i tumorer kan være nyttige som biomarkører for tilpassede Ad-Reić terapi i NSCLC mens yderligere bekræftelse er nødvendig af en stor skaleret undersøgelse ved hjælp af forskellige former for cellelinjer.

Som en nylig emne for lungekræft behandling, EGFR-TKI’er er blevet vist at være effektive til behandling af

EGFR

-mutant NSCLCs. Men erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er efter TKI behandling er et problem, der skal overvindes. I den aktuelle undersøgelse, viste vores resultater, at effekten af ​​Ad-Reić mod erhvervede EGFR-TKI-resistente celler var lig med mod stamcellerne, tyder på, at Ad-Reić kan være nyttige efter overtagelsen af ​​resistens over for EGFR-TKI’er.

Selvom adenovirusvektorer der bærer passende tumorsuppressorgener, såsom Reić /Dkk-3, har et stort potentiale for cancer genterapi, de ikke udviser målrette specificitet og kan derfor også inficere normale celler i nærheden af ​​cancerceller . Forfatterne rapporterede, at infektionen af ​​normale humane fibroblaster (NHF) med Ad-Reić ikke forårsagede apoptose af NHF selv, men i stedet inducerede produktion af interleukin (IL) -7. Når Ad-Reić-inficerede NHF blev blandet med ubehandlede cancerceller og blandingen blev transplanteret ind i mus, blev væksten af ​​kræftceller undertrykte signifikant, hvilket antyder en indirekte tumor-undertrykkende virkning af Ad-Reić medieret af IL-7 [20] . Disse resultater viser, at mis-målrettet infektion af cancer stromaceller af Ad-Reić aktiverer immunforsvaret gennem produktion af IL-7. Desuden rapporterede forfatterne at Reić /DKK-3 protein spillede en cytokin-lignende rolle i monocyt differentiering i dendritiske celler-lignende funktioner

in vitro

at infiltration af CD11c- og CD8-positive (dendritiske og dræber T-celle-markører, henholdsvis) celler blev observeret inden for de behandlede tumorer

in vivo

. I eksperimentet under anvendelse af en ortotopisk prostata tumor model med forud fastsat lunge metastase, antallet af metastatiske lungetumorer faldt betydeligt efter injektionen af ​​Ad-Reić ved det primære tumorsted foruden inhibering af væksten af ​​ortotopisk prostatatumorer, hvilket tyder at anti-cancer immune opregulering af Ad-Reić behandling i primære tumorsteder udløste antitumorvirkninger selv ved fjernt tumorsted [16]. Disse kendsgerninger antyder kraftigt, at Reić /Dkk-3 viser en indirekte antitumorvirkning gennem anti-tumor immunsystem, der er en vigtig faktor i behandlingen af ​​metastatisk sygdom. Fordi Ad-Reić har både direkte og indirekte virkninger på kræftbehandling, kan det blive en magtfuld behandlingsmulighed som en “one-kugle, to arme” anti-cancer middel specielt til NSCLCs, som ofte metastaserer til andre organer.

med hensyn til klinisk brug, fordi vores data tyder på, at CAR og GRP78 udtryk statusser i tumorceller forudsige reaktionsevne Ad-Reić behandling, bør Ad-Reić behandlingen fortrinsvis udføres for patienter, der er kategoriseret som høj følsomme gruppe i begyndelsen af fase af behandling med lav dosis Ad-Reić. For patienter, hvis tumor celler afslører mellemliggende eller dårlig effektivitet med lav dosis Ad-Reić, bør det være sene fase i deres behandling med høj dosis Ad-Reić. For disse patienter bør omkostningseffektivitet til behandling og klinisk resultat overvejes nøje. Som for administration strategi kan lokal indgivelse være at foretrække frem for systemisk administration for at minimere den negative virkning i kliniske situationer. Vi har tidligere bekræftet i musemodel som Ad-Reić kunne vidt udbredt i de organer efter intratumoral lokal administration, og den lokale administration var effektivt ikke kun direkte, men også indirekte gennem immunsystemet effekt [16], [23]. Desuden kunne intrapleural lokale administration være en anden administration strategi for patienter med maligne pleuraekssudat. Det er blevet rapporteret, at den intrapleural administration af adenovirus-medieret genterapi er en nyttig metode til at danne anti-tumor immunrespons i malignt mesotheliom og metastatisk pleural effusion i flere kliniske undersøgelser [24], [25].

Afslutningsvis vi vist, at Ad-Reić induceret JNK aktivering og efterfølgende apoptose i NSCLC celler uanset hvilken type af kendte molekylære ændringer eller følsomhed over for EGFR-TKI. Den foreliggende undersøgelse tyder på, at Ad-Reić har en terapeutisk potentiale for NSCLC, og udtrykket status for GRP78 og CAR kan være en indikator for Ad-Reić terapi.

Støtte Information

Figur S1.

Heatmap billede af mRNA ekspressionen af ​​

Reić /DKK-3

gen. MRNA-ekspression på

Reić /DKK-3

genet blev opnået fra UCSC Cancer Genome Gennemse, som er frit tilgængelig offentlig database (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (vi hentede data den 16. juli 2013), viste, at

Reić /DKK-3

genekspression blev reduceret i størstedelen af ​​undersøgte prøver af både (a) lunge adenokarcinomer og (b) skællede celle carcinomer, sammenlignet med normale lungevæv.

doi: 10,1371 /journal.pone.0087900.s001

(PDF)

Metode S1.

yderligere oplysninger til cellelinjer og Western blot-analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0087900.s002

(DOC)