Abstrakt
Kliniske forsøg har bekræftet sikkerheden af selektivt onkolytiske adenovirus til behandling af fremskredne kræftformer. Dog kunne stadig mere effektive virus resultere i mere toksicitet og det ville derfor være nyttigt, hvis replikation kunne ophæves, hvis det er nødvendigt. Vi analyserede vira indeholdende cyclooxygenase-2 (COX-2) eller vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) promotor til at styre replikationen. Anti-inflammatoriske midler kan sænke Cox-2 protein niveauer og derfor vi den hypotese, at også promotoren kan være påvirket. Som Cox-2 modulerer ekspression af VEGF, også VEGF-promotoren kan være styrbar. Først, vi evaluerede effekten af antiinflammatoriske midler på promoter aktivitet eller adenovirus infektivitet
in vitro
. Endvidere har vi analyseret den onkolytiske styrken af virus
in vitro
in vivo
med og uden reagenserne. Desuden blev analyseret effekten af på virusreplikation. Vi fandt, at RGD-4C eller Ad5 /3 modificerede fibre forbedret onkolytiske styrken af virus
in vitro
og
in vivo
. Vi fandt, at begge promotorer kunne nedreguleres med dexamethason, natriumsalicylat, eller salicylsyre. Onkolytisk effekt korreleret med promoter aktivitet og
in vitro
virus produktionen kunne ophæves med stofferne.
In vivo
, så vi god terapeutisk virkning af viraene i en model for intravenøs terapi af metastatisk livmoderhalskræft, men den inhiberende virkning af dexamethason var ikke stærk nok til at give betydelige forskelle i et kompleks
in vivo
miljø. Vores resultater antyder, at anti-inflammatoriske lægemidler kan påvirke replikationen af adenovirus, som kan være relevante i tilfælde af replikations- associeret bivirkninger
Henvisning:. Kanerva A, Lavilla-Alonso S, Raki M, Kangasniemi L, Bauerschmitz GJ, Takayama K, et al. (2008) Systemisk Terapi for livmoderhalskræft med Potentielt regulerbar onkolytiske adenovirus. PLoS ONE 3 (8): e2917. doi: 10,1371 /journal.pone.0002917
Redaktør: Alfred Lewin, University of Florida, USA
Modtaget: May 5, 2008; Accepteret: 7 juli, 2008; Udgivet: 13 August, 2008
Copyright: © 2008 Kanerva et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af EU FP6 THERADPOX og APOTHERAPY, Huch forskningsmidler (EVO), Sigrid Juselius Foundation, Academy of Finland, Emil Aaltonen Foundation, finsk Cancer Society, University of Helsinki, Sohlberg Foundation, Instrumentarium Research Fund, finsk Oncology Association, Helsinki Biomedical Graduate Skole, Helsinki Graduate School i Bioteknologi og Molekylær Biologi, finsk Kulturfond, Research Foundation of Bayer Schering Pharma, Deutsche Forschungsgemeinschaft /DFG og Biocentrum Helsinki. A.H. er K. Albin Johansson Research Professor i det finske Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
patogenesen af livmoderhalskræft er karakteriseret ved vedvarende infektion med en høj-risiko humane papillomavirus (HPV), almindeligt anerkendte som krævet for livmoderhalskræft indvielse. I en brøkdel af patienterne, HPV-infektion skrider fra dysplasi og karcinom
in situ
til invasiv cancer og metastatisk sygdom [1]. Kun få virusstammer er specifikt ansvarlige for cervikale neoplasmer, hvoraf HPV16 tegner sig for mere end halvdelen af de indberettede sager. Desværre har hverken forbedringer i kirurgi eller strålebehandling faldt betydeligt dødeligheden hos patienter med fremskreden, recidiverende eller metastatisk sygdom. The American Cancer Society anslår omkring 9 700 nye tilfælde og 3 700 dødsfald i livmoderhalskræft i 2006 [2]. Men livmoderhalskræft forbliver den førende årsag til gynækologisk kræft dødelighed på verdensplan med over 270 000 dødsfald i 2002 [3].
Adenoviral genterapi er blevet foreslået som en ny alternativ til avanceret kræftbehandling [4]. Men effektiv tumor transduktion fortsætter med at være den begrænsende trin for at opnå kliniske resultater. Onkolytiske adenovirus kan vise sig nyttige i denne henseende [5]. Disse vira har en cytolytisk natur,
dvs..
Den replikative livscyklus virus resultater i værtscelle ødelæggelse. Modifikationer i det virale genom reducere replikation i normale væv, medens tumorceller fortsat tillade produktiv replikation fører til cancer cellelysering (onkolyse). Type I onkolytiske adenovira har tab-af-funktion-mutationer i virusgenomet, som kompenseres af mutationer i cancer, men ikke normale celler. Dette kan opnås ved at inkorporere deletioner i de tidlige adenovirusgener resulterer i mutante E1-proteiner ikke er i stand til at binde cellulære proteiner er nødvendige for viral replikation i normale celler, men ikke i cancerceller. I type II virusser, tumor- eller vævsspecifikke promotorer erstatter endogene viruspromotorer såsom E1A-promotoren, for at begrænse viral replikation til målvæv udtrykker promotoren.
Selvom kliniske forsøg har bekræftet sikkerheden af onkolytiske adenovirus til behandling af fremskredne kræftformer [6] – [9], de fleste forsøg har featured relativt svækkede vira. Således kunne stadig mere effektive midler resultere i mere toksicitet og det ville derfor være nyttigt, hvis replikation kunne ophæves, hvis det er nødvendigt. Genekspression fra visse promotorer kan reguleres. For eksempel er den tidlige vækst respons gen 1 (
EGR
-1) enhancer /promotor, er blevet anvendt som en regulerbar promotor til ekspression af HSV-TK i gliomceller og kan induceres af stråling [10] . En anden regulering strategi er anvendelsen af hypoxi-inducerbare promotorer [11]. Endvidere kan regulering opnås med kemisk inducerbare promotorer. For eksempel kan en tetracyklin-aktiveret promotor anvendes til at regulere genekspression og efterfølgende proteinproduktion ved oral tetracyclin. Tilbagetrækning af lægemidlet ophæver hurtigt genekspression [12].
Cox-2 er det hastighedsbegrænsende enzym i prostaglandinsyntesen, og det er involveret i kontrollen af inflammatoriske reaktioner i respons på skade eller infektion. Anvendelse af ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID’er) har vist, at aktiviteten og også niveauet for Cox-2-proteinet kan reguleres. Selvom andre faktorer end promotoraktivitet ofte har en rolle i protein-ekspressionsniveauer, har undersøgelser vist, at aktiviteten af cox-2-promotoren korrelerer godt med proteinekspression [13]. Endvidere aktiviteten af cox-2-promotoren i de fleste raske normale væv er lav, medmindre den er induceret af vækstfaktorer (såsom VEGF), cytokiner eller tumorspecifikke faktorer [14]. Med hensyn til adenovira, den mest relevante organ for toksicitet er leveren. Derfor er det nyttigt at hepatisk udtryk for Cox-2 er lav [15], [16]. Cox-2 kan have en rolle i carcinogenese af mange epiteliale cancere, og ekspressionsniveauer har været forbundet med tumorindtrængen og angiogenese [14]. Disse grunde har ført til anvendelse af Cox-2-promotoren som en tumor-specifik promotor for kræft specifik ekspression [15] – [20]
VEGF spiller en vigtig rolle i induktionen af tumor-associeret angiogenese, som. det er en mediator af endotelcelleproliferation, differentiering og vaskulær permeabilitet [21]. VEGF er bredt udtrykt under tumorigenese og det er påvist i de fleste maligne tumorer epiteliale [18], [19], [21] Cox-2 eller vækstfaktorer som TGF-β1 kan regulere VEGF [22], [23]. Endvidere voluminøse faste tumormasser indeholder hypoxiske områder, som byder høje niveauer af HIF-1 transkriptionsfaktor, som igen inducerer VEGF og Cox-2-ekspression [23]. Således er reguleringen og ekspressionen af Cox-2 og VEGF forbundet. Det er derfor ikke fuldstændigt overraskende, at også VEGF-promotoren har vist anvendelighed til tumorspecifik ekspression [18], [19], [24]. En hidtil uudforsket mulighed er regulering af Cox-2 og VEGF promotorer af anti-inflammatoriske midler. Dette kan tilbyde en sikkerhedsafbryder i tilfælde af promotor- medierede bivirkninger i kliniske forsøg.
Kliniske livmoderhalskræft prøver udtrykke høje niveauer af COX-2, mens det er målbart i den normale epitelforingen af livmoderhalsen. Yderligere er der en progressiv stigning i Cox-2 niveauer afhængigt sygdomsstadie, og også tumorstørrelse. Cox-2-ekspression er også en negativ prædiktiv faktor for overlevelse [25], [26]. Med hensyn til VEGF og livmoderhalskræft, har vist en høj forbehandling niveau for at associere med store tumorer, stromal invasion og bækken lymfeknudemetastase. VEGF-ekspression korrelerer også med dårlig prognose [27] – [29]. Derfor er både initiativtagere tiltalende kandidater for livmoderhalskræft specifikke genterapi tilgange.
Natriumsalicylat og salicylsyre er NSAID’er, som enzymatisk hæmmer Cox-2. Endvidere er det blevet rapporteret, at disse stoffer reduceres Cox-2-mRNA-niveauer, som kunne medieret gennem modulation af promotoraktivitet [13], [30]. Dexamethason er et anti-inflammatorisk steroid, som inhiberer ekspression af både COX-2-mRNA og protein [30]. Endvidere kan post-transkriptionel mRNA destabilisering være en vigtig mekanisme i virkningen af dexamethason [31]. TGF-β1 er et peptid vækstfaktor og anti-inflammatorisk cytokin, som produceres af mange celler, men er fundet mest koncentreret i mammale blodplader. Det kan modulere ved fx celleproliferation og differentiering, angiogenese og metastase, og har vist sig at have en virkning på Cox-2-niveauer [32].
Vi antager, at det kan være muligt at reducere adenovirus replikation med farmakologisk intervention. Konkret har vi analyseret oncolytiske vira indeholdende cyclooxygenase-2 (COX-2) eller vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) -promotor styre ekspressionen af
E1A
, og evaluerede effekten af anti-inflammatoriske reagenser [natriumsalicylat, dexamethason, salicylsyre og transformerende vækstfaktor-β1 (TGF-β1)] om onkolyse og replikation
in vitro
in vivo
virkningsfuldhed. Som kontroller, inkluderet vi en retinoblastoma (Rb) -p16 pathway selektiv Δ24-baserede type I onkolytiske virus [33] og en vildtype adenovirus. Endvidere, som det er blevet klart, at en afgørende faktor for effekten af replikerende adenovira er gen-levering effektivitet [34], vi udnyttet fiber ændret, infektivitet forbedret virus.
Resultater
Infektivitet af menneskelig livmoderhalskræft cellelinjer
in vitro
livmoderhalskræft cellelinjer C33A blev SiHa, Caski og HeLa inficeret med isogene luciferase udtrykker virus byder enten adenovirusserotype 5 kapsid (Ad5luc1), en kimære kapsid med knop domæne fra serotype 3 (Ad5 /3luc1) eller RGD-4C kapsid modifikation (Ad5lucRGD). I tre ud af fire cellelinier, infektion med Ad5 /3luc1 resulterede i 6 til 14 gange højere luciferase ekspression i sammenligning med Ad5luc1 (5 000 viruspartikel (vp) /celle, fig. 1b-d). Men med C33A celler, som byder høj ekspression af Coxsackie-adenovirus receptor [19], [35], Ad5luc1 var mest effektive (7-fold, fig. 1a). Ad5lucRGD forøgede ikke infektivitet af cervikale cancerceller
in vitro
, undtagen i SiHa-celler (2,5 til 5,5 ganges forøgelse, fig. 1b). Salg
(a-d) cellelinier blev inficeret med Ad5luc1, Ad5 /3luc1, og Ad5lucRGD. Luciferaseaktivitet er udtrykt som relative lysenheder (RLU) normaliserede for total proteinkoncentration. (E-h) Virkningen af antiinflammatoriske reagenser på transduktion effektivitet af capsid modificerede adenovira. Celler var smittet i tilstedeværelsen af stoffer. Værdien uden reagenser blev sat til 1, og relative luciferase værdier er vist. Hvert punkt repræsenterer middelværdien af tre eksperimenter ± standardafvigelse. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,0001
versus
Ad5luc1
effekten af anti-inflammatoriske reagenser på transduktion effekten af capsid modificerede adenovirus
livmoderhalskræft cellelinier blev inficeret med capsid modificeret adenovirus i tilstedeværelsen af stoffer. Som vist i fig. 1e-h, dexamethason øgede transduktion effektivitet med alle de vira på SiHa og Caski cellelinjer. Andre undersøgte stoffer havde kun mindre effekt.
Regulering af Cox-2 og VEGF initiativtagere med anti-inflammatoriske reagenser
transkriptionsaktiviteten af Cox-2 og VEGF initiativtagere blev evalueret i livmoderhalskræft celle linier med og uden anti-inflammatoriske reagenser natriumsalicylat, dexamethason, salicylsyre og TGF-β1 (fig. 2a-h). Ad5luc1, som indeholder en meget stærk CMV-promotor, blev anvendt til sammenligning, og relative luciferaseaktiviteter vist. Samlet, VEGF-promotoren inducerede en højere transgenekspression end Cox-2 (fig. 2b, d, f, h). Promotor-ekspression var godt i overensstemmelse med tidligere data om Cox-2 og VEGF-mRNA-ekspression i disse cellelinier [19]. Selvom begge promotorer kan nedreguleres med antiinflammatoriske stoffer, VEGF var mere regelmæssigt påvirket (fig. 2b, d).
Monolag blev præinkuberet med reagenser, og C33A (a, b), SiHa (c, d ), Caski (e, f) og HeLa (g, h) celler blev inficeret med 1 000 viruspartikler (VP) /celle i Ad5luc1 (med CMV kontrollerende luciferase) blev Adcox-2Mluc eller AdVEGFluc, og luciferaseekspression analyseret. Transgenekspressionsniveau med Cox-2 og VEGF promotorer sammenlignet med CMV-promotoren (%). Hvert punkt repræsenterer middelværdien af fire forsøg ± standardafvigelse. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,0001
versus
ingen substans
onkolytiske adenovirus viste effektiv aflivning af livmoderhalskræft celler
in vitro
Monolag af livmoderhalskræft celler blev inficeret med onkolytiske adenovirus, vildtype-virus og Ad5luc1, en
E1
-deleted kontrol virus (fig. 3a-d). I alle cellelinier, viste det kvantitative celledræbende assay cytolyse med onkolytiske virus og vildtype-virus, mens Ad5luc1 forårsaget minimal celledrab. På de fleste cellelinjer, blev onkolyse væsentligt forbedret med replikerende virus i sammenligning med Ad5luc1. Endvidere onkolyse forårsaget af RGDCRADcox-2R var også signifikant på C33A og Caski-celler, når anvendtes dosis på 10 vp /celle (fig. 3a, c). På alle cellelinjer, celledræbende med Ad5-Δ24RGD var sammenlignelig med vildtype adenovirus, mens effekten af RGDCRADcox-2R og Ad5 /3VEGF-E1 var svagere.
(a-d) Monolag blev inficeret med RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD, vildtypeadenovirus og Ad5luc1 (
E1
-deleted kontrol virus). Cellelevedygtighed blev målt med MTS assay. OD
490 værdier for ikke-inficerede celler blev sat til 100%. Dataene er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af firdobbelte forsøg. (E-f) C33A celler blev injiceret subkutant i nøgne mus og avancerede tumorer fik lov at udvikle sig. Musene blev behandlet med enten (e) tre intratumorale injektioner af 1 x 10
9 viruspartikler (VP) af Ad5luc1, vildtypevirus eller onkolytiske adenovirus på tre på hinanden følgende dage, eller med (f) en enkelt intravenøs injektion af 1 × 10
11 vp. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,0001
versus
Ad5luc1. Barer indikerer standardafvigelser.
onkolytiske adenovirus leveret terapeutisk effekt i murine livmoderhalskræft modeller
in vivo
Avancerede subkutane C33A tumorer blev behandlet med tre intratumorale injektioner af 1 × 10
9 vp af Ad5luc1, vildtype-virus, Ad5 /3VEGF-E1, RGDCRADcox-2R eller Ad5-Δ24RGD på tre på hinanden følgende dage, eller med en enkelt intravenøs injektion af 1 x 10
11 vp af samme vira. Behandling med onkolytiske virus gav betydelig terapeutisk effekt i begge modeller (Fig 3e, f:
P
0,0001 for RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 eller Ad5-Δ24RGD
versus
Ad5luc1. ). Vildtypeadenovirus ikke vise en signifikant effekt på tumorvækst (
P
= 0,1471 og 0,8297
versus
Ad5luc1 for intratumorale og intravenøs modeller, henholdsvis).
Anti- inflammatoriske reagenser reduceret onkolyse forårsaget af Cox-2 og VEGF-promotoren drevet onkolytiske adenovirus og vildtype adenovirus
virkningen af anti-inflammatoriske midler på onkolytiske adenovirus og vildtype-virus blev analyseret på C33A og SiHa cellemonolag. Ingen af de analyserede reagenser (dexamethason, salicylsyre og natriumsalicylat) forårsaget betydelig celledrab alene eller i kombination med replikationsdeficient
E1
-deleted Ad5luc1 (fig. 4a, e). Den celledræbende effekt af replikerende virus blev reduceret med dexamethason (fig. 4b, c, f-h), salicylsyre (fig. 4c) og natriumsalicylat (fig. 4f, g).
(a- h) cellemonolag præinkuberet med stoffer, og C33A (a-d) og SiHa (e-h) celler blev inficeret med Ad5luc1, vildtypevirus, Ad5 /3VEGF-E1 og RGDCRADcox-2R. Celledræbende effekt af replikerende virus blev reduceret med dexamethason (b, c, f-h) og natriumsalicylat (c, f, g). For at vise effekten af stofferne
per se
på celle overlevelse, har en anden mock blevet tilføjet i paneler a og e. Y-aksen overgangssted angiver cellelevedygtighed uden virus eller stoffer, mens “0” til højre for det indikerer celleoverlevelse uden virus, men med stofferne.
in vivo
effekt af dexamethason på terapeutiske effekt af onkolytiske eller vildtype-adenovirus. (I) Subkutan C33A cervicale cancertumorer fik lov til at etablere og mus blev behandlet med en enkelt intravenøs injektion af 1 x 10
11 viruspartikler (VP) af oncolytiske vira eller uden virus. I RGDCRADcox-2R grupper blev 3 × 10
8 vp injiceret intratumoralt på dag 1, 3 og 5. Endvidere modtog musene intraperitoneale dexamethason eller PBS. (J) Humant ovariecancer (Hey) tumorer blev etableret i nøgne mus, og behandles med intratumorale injektioner af 3 × 10
8 vp af RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD eller ingen virus på dag 1 , 3 og 5. Mus modtog intraperitoneale injektioner af PBS eller dexamethason dagligt. Streger indikerer standardafvigelser. På trods af en suggestiv tendens på nogle tidspunkter, påvirkede dexamethason ikke væksten af tumorer betydeligt i den samlede analyse af enten model. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,0001
versus
ingen substans. Barer indikerer standardafvigelser.
in vivo
effekt af dexamethason på terapeutiske effekt af onkolytiske eller vildtype-adenovirus
Subkutan C33A livmoderhalskræft tumorer fik lov til at udvikle og musene blev behandlet med en enkelt intravenøs injektion af 1 x 10
11 vp af Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD eller uden virus. I RGDCRADcox-2R grupper blev 3 × 10
8 vp injiceret intratumoralt på dag 1, 3 og 5. Derefter blev musene randomiseret til intraperitoneal dexamethason eller PBS-behandling (fig. 4i). Ad5-Δ24RGD blev anvendt som en model for et onkolytisk virus uden en vævsspecifik promotor. Vildtypevirus kunne ikke anvendes, da det ikke gav nogen effekt i modellen (fig. 3). Trods visse lovende omend mindre tendenser, påvirkede dexamethason ikke tumorvækst signifikant (
P
= 0,5726 til 0,9909
versus
virus kun). Men alle onkolytiske adenovirus fortsatte med at vise anti-tumor effekt som i det foregående eksperiment (alle
P
0,0001
versus
mock)
For at se, om vi kunne. drille ud replikation dæmpende effekt af dexamethason i en hurtigt voksende, meget aggressiv subkutan model, vi brugte Hey ovariecancerceller (fig. 4j). Tidligere arbejde antydede, at de vira, der anvendes her, vil replikere i Hey celler [36], [37]. Xenotransplantater blev behandlet med intratumorale injektioner af 3 × 10
8 vp af vira eller ingen virus på dag 1, 3 og 5. Mus modtog intraperitoneale injektioner af PBS eller dexamethason dagligt, og tumorvækst blev fulgt. Igen, selv om der var en antydning af svækkelse af virusreplikation (
dvs..
Større tumorer), dexamethason havde ingen signifikant effekt på terapeutisk effekt af analyserede virus (
P
= 0,8897 til 0,9441). Den antitumor effekt af onkolytiske adenovirus fortsat signifikant sammenlignet med mock-behandling (alle
P
0,0001)
Effekten af dexamethason på replikation af Cox-2 og VEGF-promotor drevet oncolytisk. adenovirus og vildtypeadenovirus om livmoderhalskræft celler
in vitro
Vi har analyseret
in vitro
produktion af virioner ved RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 og vilde -typen adenovirus i SiHa-celler med og uden dexamethason behandling (fig. 5a-c). Samlet, dexamethason reducerede replikationen af analyserede vira. Replikation af RGDCRADcox-2R blev reduceret 2-, 7- og 10-fold på 24, 60 og 96 timer, henholdsvis (figur 5a:
P
0,0001 ved 60 t.). En lignende, men svagere effekt blev set med Ad5 /3VEGF-E1 (figur 5b:. 1,5 til 3,5 gange,
P
= 0,0640 ved 96 h). Replikation af en vildtype virus blev reduceret signifikant ved 96 h (Fig 5c: 40-fold,
P
0,0001.)
(a-c) SiHa livmoderhalskræft monolag var. inficeret med virus alene (10 viruspartikel (vp) /celle) eller i kombination med dexamethason og virusproduktion blev analyseret ved plaque assay. På trods af en klar tendens på tidlige tidspunkter, var der ingen statistisk signifikant effekt af dexamethason på
in vivo
replikation grundet større variation
in vivo
(d-f). Humane ovariecancer tumorer blev etableret i nøgne mus og behandlet med en enkelt intratumoral injektion af 3 × 10
8 vp. Mus modtog intraperitoneale injektioner af dexamethason eller PBS dagligt. Fire tumorer /gruppe blev høstet på dag 2 og 4, og mængden af infektiøse partikler blev analyseret ved TCID
50. ***
P
0,0001
versus
virus alene. N.A. = ikke analyseret. Barer indikerer standardafvigelser.
Effekten af dexamethason på replikation af Cox-2 og VEGF-promotor drevet onkolytiske adenovirus og vildtypeadenovirus på kræftceller
in vivo
Regulering af replikation med dexamethason
in vivo
blev analyseret med de subkutane humane ovarie Hey adenocarcinom-tumorer behandlet med intratumorale injektioner på dag 0. Halvdelen af musene fik intraperitoneale injektioner af dexamethason dagligt. Tumorer blev analyseret på dag 2 og 4. Selv dexamethason reducerede replikationen af Ad5 /3VEGF-E1 og vildtypevirus på tidligt tidspunkt, forskellen var ikke statistisk signifikant (fig. 5d-f, alle
P
= 0,1283 til 0,6144).
diskussion
Fordi det primære adenovirus-receptoren kan være ofte fraværende eller udtrykkes afvigende i fremskredne tumorer [34], vi først analyseret
in vitro
transduktion effekt af fiber modificeret, infektivitet forbedret adenovirusvektorer udtrykker luciferase transgenet (fig. 1). RGD-4C modifikation ikke synes at være meget effektiv til at øge genoverførsel, men Ad3 receptoren målrettet igen virus var ganske effektiv i tre ud af fire cellelinier (fig.1A-d). Endvidere har vi vurderet effekten af de anti-inflammatoriske reagenser på transduktion effektivitet, og fundet en vis stigning i transgen ekspression efter behandling med dexamethason på to ud af fire livmoderhalskræft cellelinjer (Fig.1 f, g) Som en afgørende faktor for effekt af oncolytiske adenovira er infektivitet [34], vi udnyttet genetiske fiber modifikationer til forbedring celledræbende effekt. Vi evaluerede
in vitro
cytolytisk styrken af disse onkolytiske adenovirus i livmoderhalskræft cellelinjer, og fundet korrelation mellem onkolytisk potens, gen-levering og promotor-aktivitet,
dvs
jo stærkere promotoren og højere infektivitet, jo stærkere var den onkolytiske styrke (fig. 3a-d).
vigtigere, alle de analyserede onkolytiske adenovirus havde statistisk signifikant terapeutisk virkning i både lokale og systemiske behandling skemaer af murine livmoderhalskræft xenotransplantater (fig. 3e, f). Nogle variation i effekten blev set mellem
in vitro
og
in vivo
resultater med nogle af de vira. Dette kan skyldes de seneste opdagelser tyder på, at mens gen-levering
in vitro
afhænger hovedsageligt på primære adenovirus-receptorer, biotilgængelighed spørgsmål synes at dominere med hensyn til
in vivo
effekt. For eksempel er det i stigende grad accepteret, at mens binding til CAR er en vigtig faktor for transduktion
in vitro
, andre regioner i fiberen kan være endnu mere relevant
in vivo
[38]. Parallelt med tidligere resultater med andre cellelinjer [37], [39], var vildtype adenovirus ikke effektive på C33A celler
in vivo
trods aktivitet
in vitro
. Selvom vi antager dette vedrører forskelle mellem
in vitro
in vivo
miljøer (f.eks. Stroma, kar, receptor-ekspression), yderligere arbejde er nødvendigt at afklare spørgsmålet.
Når Cox-2 og VEGF-promotor drevne transgenekspression blev evalueret begge promotorer blev fundet aktive i cervikale cancercellelinier. Samlet set VEGF promotoraktivitet var højere end Cox-2 i alle cellelinjer, og sammenlignes med tidligere data [19]. Vigtigere, har tidligere undersøgelser rapporteret, at normale leverceller ikke udtrykker VEGF [40]. Også cox-2 niveauer set i livmoderhalskræft celler var højere end hvad der er blevet rapporteret for leveren tidligere [16]. Væsentlig reduktion af VEGF-promotoren medieres luciferase-ekspression blev set med natriumsalicylat, dexamethason og salicylsyre (fig. 2b, d). Natriumsalicylat også reduceret Cox-2-promotoren styret transgenekspression (fig. 2e).
Når udførtes celledrab forsøg i nærvær af anti-inflammatoriske midler, dexamethason og natriumsalicylat var effektive til at reducere onkolyse (fig. 4). Interessant nok blev virkningen ikke begrænset til onkolytiske adenovirus, men også vildtypevirus vises svagere cytolyse når dexamethason var til stede. Således kan effekten ikke være helt relateret til promotoren styrer replikation, men en mere generelt fænomen i viral replikation kan være også involveret. En årsag til reduceret replikation kan være nedregulering af de relevante receptorer, der er nødvendige for infektion. Tidligere har vi og andre analyserede modulering af adenovirus primære receptorekspression på celleoverfladen af forskellige stoffer, herunder en række kemoterapeutiske midler og anti-inflammatoriske reagenser. Vi fandt ingen effekt på receptor-niveau, som vurderet ved flowcytometri analyse, efter dexamethason behandling, mens andre opdaget en lille reduktion i niveauet af både primære receptor og a
Vp integriner [41], [42].
effekten af dexamethason på serotype 3 receptoren havde ikke undersøgt, og heller ikke havde bestemt cellelinje her blevet undersøgt før med hensyn til de andre relevante adenovirus receptorer. Vi analyserede derfor virkningen af stofferne på genafgivelse og fandt, at luciferase-ekspression i visse tilfælde blev forøget (fig. 1e-h). Således reducerede replikation ses her var sandsynligvis ikke skyldes receptor nedregulering.
En anden mekanistisk mulighed kan indebære induktion af Cox-2 ved virusreplikation
per se
. Med hensyn til herpes, cytomegalovirus og andre DNA-vira, er det blevet påvist, at virusinfektion fremkalder Cox-2 [43], [44]. Endvidere den opdagelse, at inhibering af Cox-2 reducerer replikationen af disse vira antyder, at COX-2-induktion er til gavn for virusformering. Disse vira kan udnytte de anabolske virkninger af COX-2 til optimering af deres replikation effektivitet. Foreløbige data tyder på, at det samme også kan være tilfældet for adenovirus, som kan hjælpe med at forklare, hvorfor den onkolytiske virkning af vildtype-adenovirus blev svækket ved dexamethason [45].
Selvom onkolyse sandsynligvis korrelere med replikation af virus, undersøgte vi dette separat. Som forventet blev virusreplikation reduceret med dexamethason behandling
in vitro
(fig. 5a-c). Dette synes at understøtte den teoretiske antagelse, at onkolyse er tæt forbundet med virusreplikation. Da menneskelige adenovirus ikke replikere produktivt i murine normale væv [46], menneskelige xenografter i mus blev anvendt til replikation dæmpning
in vivo
undersøgelser. I disse modeller hvis replikation og /eller celledræbende effekt reduceres
in vivo
med dexamethason, tumorer i mus behandlet med virus og dexamethason ville være større end virus kun behandles. I begge modeller undersøgt dexamethason ikke signifikant reducere antitumorvirkningen af de analyserede onkolytiske adenovirus, på trods af en tendens i den retning (fig. 4i-j, alle
P
≥0.1654). Endelig har vi analyseret mængden af infektiøse partikler i subkutane tumorer med og uden dexamethason behandling (fig. 5d-f). På trods af en tendens fremtrædende på tidlige tidspunkter, blev ingen signifikante forskelle set, hvilket kan skyldes variation typisk for
in vivo
eksperimenter.
Den mest sandsynlige årsag til uoverensstemmelsen mellem den observerede
In vitro
in vivo
effekt af dexamethason på onkolytiske potentiale virus kan vedrøre den højere kompleksitet
in vivo
modeller. Disse komplekse var godt påvist i en nylig undersøgelse, hvor en stigning i VEGF-niveauer i Cox-2 positive og COX-2 negative bugspytkirtelkræftceller sås efter behandling med høje koncentrationer af COX-2-inhibitorer, hvilket antyder, at forholdet mellem Cox-2-protein inhibering og VEGF eller Cox-2-promotoren ekspression kan ikke altid være tæt knyttet [47]. Mod forventning både Cox-2 positive og negative
in vitro
udstilles forhøjede niveauer af VEGF følgende Cox-2-hæmning. i Cox-2 positive tumor
in vivo
model, ikke-maligne celler udtrykte imidlertid et markant nedsat niveau af murin VEGF fører til reduceret total VEGF og tumor angiogenese og vækst, mens COX-2 negative tumorer de viste øget tumorvækst. Disse resultater tyder også på, at tumor stroma kan have en stor indvirkning på ekspressionen af Cox-2 og relaterede faktorer.
Et andet aspekt vedrører den ikke-lineære forhold mellem E1A niveauer og effekt af virusreplikation. Klassiske undersøgelser tyder på, at meget varierende E1A niveauer tillader effektiv replikering uden direkte sammenhæng mellem E1A udtryk og virion produktion [48]. Således er det meget muligt, at selvom E1A-ekspression blev påvirket på grund af dexamethason inhiberer promotorerne, effekten var ikke dramatisk nok til at blive set som en forskel i tumorvækstkurver. Dexamethason regulerer flere komponenter af både medfødte og adaptive immunitet.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.