PLoS ONE: Piperine, en Bioaktive Del af Pepper Spice Udøver terapeutiske virkninger på androgenafhængige og androgen Uafhængig Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Prostatakræft er den mest almindelige solid malignitet hos mænd, med 32.000 dødsfald årligt. Piperine, en større alkaloid bestanddel af sort peber, er tidligere blevet rapporteret at have anti-cancer-aktivitet i forskellige cancercellelinier. Virkningen af ​​piperin mod prostatakræft er i øjeblikket ikke kendt. Derfor i denne undersøgelse undersøgte vi de anti-tumor mekanismer piperin på androgenafhængige og androgenuafhængige prostata cancerceller. Her viser vi, at piperin inhiberede proliferationen af ​​LNCaP, PC-3, 22RV1 og DU-145 prostatacancerceller på en dosisafhængig måde. Desuden Annexin-V farvning viste, at piperin behandling induceret apoptose i hormonafhængige prostatacancerceller (LNCaP). Brug af global caspaseaktivering assay viser vi, at piperin-induceret apoptose resulterede i caspaseaktivering i LNCaP og PC-3-celler. Yderligere undersøgelser afslørede, at piperin behandling resulterede i aktivering af caspase-3 og spaltning af PARP-1-proteiner i LNCaP, PC-3 og DU-145 prostatacancerceller. Piperine behandling også forstyrret androgen receptor (AR) udtryk i LNCaP prostata kræftceller. Vores evalueringer viser endvidere, at der er en betydelig reduktion af prostataspecifikt antigen (PSA) niveauer efter piperin behandling i LNCaP celler. NF-kB og STAT-3 transkriptionsfaktorer har tidligere vist sig at spille en rolle i angiogenese og invasion af prostatacancerceller. Interessant behandling af LNCaP, PC-3 og DU-145 prostatacancerceller med piperin resulterede i reduceret ekspression af phosphoryleret STAT-3 og nukleare faktor-KB (NF-kB) transkriptionsfaktorer. Disse resultater korrelerede med resultaterne af Boyden kammer assay, hvor piperin behandling reducerede cellemigrering af LNCaP og PC-3-celler. Endelig viser vi, at piperin behandling reducerede signifikant androgenafhængige og androgenuafhængige tumorvækst i nøgne mus model xenotransplanted med prostatacancerceller. Tilsammen disse resultater understøtter yderligere undersøgelse af piperin som en potentiel terapeutisk middel i behandlingen af ​​prostatacancer

Henvisning:. Samykutty A, Shetty AV, Dakshinamoorthy G, Bartik MM, Johnson GL, Webb B, et al . (2013) Piperine, en Bioaktive Del af Pepper Spice udøver terapeutiske virkninger på androgenafhængige og androgen Uafhængig Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e65889. doi: 10,1371 /journal.pone.0065889

Redaktør: Bart O. Williams, Van Andel Institute, USA

Modtaget: November 2, 2012; Accepteret: April 30, 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Samykutty et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. forfatterne erklærer, at Mary Margaret Bartik og Gary Johnson er ansat med immunokemisystemer Technologies, LLC, Bloomington, MN, og Brian Webb er ansat på Thermo Fisher Scientific, Rockford , IL. Endvidere forfatterne anfører, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

vestlige mænd konfronteres med en stigende forekomst af kræft og kræft relaterede dødsfald årligt. Statistikker viser, at prostatakræft er den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt mænd i USA. Ifølge de seneste skøn i USA, vil 217,730 mænd være nyligt diagnosticeret med prostatakræft og 32,050 mænd vil dø af denne sygdom i 2010 [1]. Prostatacancer oprindeligt begynder som værende hormonafhængig men som sygdommen skrider det går over i at være hormon uafhængige og modstandsdygtige over for hormon relateret behandling. I øjeblikket tilgængelige behandlingsmuligheder såsom kemoterapi, strålebehandling, kirurgi eller hormonbehandling er utilfredsstillende [2]. Naturlige produkter, der stammer fra planter eller mikroorganismer, er blevet en vigtig kilde til anti-cancer behandlinger, med et betydeligt antal af de nuværende behandlinger bliver enten fysisk eller afledt fra naturlige produkter. Der er derfor en stor interesse i at identificere naturlige forbindelser i behandlingen af ​​prostatacancer. Beviser akkumulerer at forbindelser af vegetabilsk oprindelse (fytokemiske) udøve anti-cancer effekter med mindre toksicitet [3]. Sort peber, krydderi årtusinder har været meget anvendt i forskellige næringsmidler hele kloden. I USA alene, er den gennemsnitlige daglige indtagelse af sort peber blevet anslået til 359 mg. Piperine udgør 5% til 9% af sort peber indhold, hvilket indebærer den daglige indtagelse af ca. 60-110 uM [4]. Piperine (trans-isomer af 1-piperoyl piperidin) er det aktive princip, og den vigtigste ingrediens i sort peber bruges som traditionel medicin i Indien [5]. Potentialet i piperin som anti-cancer middel er blevet påvist tidligere. Piperine hæmmede solid tumor udvikling i mus induceret med DLA (Dalton Lympoma Ascites) celler og forlænget levetid mus med Ehrlich ascites tumor [6]. Piperine har også vist sig at have anti-invasion aktivitet af B16F-10 melanomaceller [7]. Den cytobeskyttende virkning piperin om B (α) -p (Benzopyren) induceret eksperimentel lungecancer er blevet undersøgt i mus og udlede, at piperin kunne udøve sin kemoforebyggende virkning ved at modulere lipidperoxidation og forstærke antioxidantforsvarssystem [8]. Interessant nok har nylige undersøgelser vist, at piperin kan inhibere brystkræft ved at målrette kræft stamceller fornyelse egenskaber [9].

Trods dets brede anvendelse og dens evne til at inhibere flere kræfttyper, lidt om de gavnlige virkninger af piperin mod prostatakræft. Makhov og kolleger [4] tidligere vist, at samtidig administration af docetaxel og piperine resulteret i øget anti-tumor effekt i en xenograft model af menneskelig kastrationsresistent prostatacancer via hæmning af CYP3A4-aktivitet. Til dato har imidlertid ikke andre studier karakteriseret de direkte anticancer effekter af piperin i prostata kræftceller trods af at blive vist at forøge den kemoterapeutiske potentiale docetaxel mod prostata tumorer [4]. Derfor er formålet med undersøgelsen er at bestemme de anti-prostatakræft aktiviteter piperin, samt at bestemme de underliggende molekylære mekanismer i sin indsats.

Materialer og metoder

Etik Statement

Dyreforsøg blev udført i denne undersøgelse i henhold til retningslinjerne for pasning og anvendelse af forsøgsdyr, og med de regler, formuleret af det amerikanske landbrugsministerium (USDA) under dyreværnsloven. Protokollen blev godkendt af IACUC udvalg fra University of Illinois, College of Medicine i Rockford og dyreforsøg udført på et anlæg akkrediteret af AAALAC og USDA.

Kemikalier og reagenser

føtalt kalveserum (FCS), RPMI-1640 og Minimum Essential Medium (MEM) blev opnået fra American Type Cell Culture (ATCC), Manassas, VA, USA. Piperine blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cellelevedygtighed assaykit blev købt hos Dojindo Molecular Technologies Inc., Gaithersburg, MD. Annexin V-FITC apoptose afsløring Kit blev opnået fra MBL international, Woburn, MA.

cellelinjer og cellekultur

LNCaP, DU-145, 22RV1 og PC-3 cellelinier blev opnået fra American Type Cell Culture (ATCC), blev Manassas, VA, USA og celler dyrket i RPMI medium suppleret med 10% FCS og 50 ug /ml gentamycin. For alle eksperimenter, 1 x 10

5 celler /ml blev udsået og dyrket i 24 timer før forsøgsbehandlinger. Celler blev holdt ved 37 ° C, 5% CO

2 miljø.

Cellelevedygtighed assay

LNCaP, 22RV1, DU-145 og PC-3-celler blev podet i 96-brønds vævskulturplader og inkuberet indtil celler bundet til brøndene. Alle cellerne blev derefter behandlet og inkuberet med forskellige koncentrationer af piperin (5-200 uM) i 24, 48 og 72 timer. Cell levedygtighed blev bestemt ved anvendelse af en celletælling kit-8 (CCK-8) fra Dojindo Molecular Technologies. 10 pi CCK-8-opløsning blev tilsat til piperin behandlet cellsand inkuberet i 3 timer. Optisk densitet blev målt ved 450 nm under anvendelse af en BIO-RAD-mikropladelæser model 680.

caspaseaktivering assay

LNCaP og PC-3-celler blev podet i 96-brønds vævskulturplader og dyrket indtil de nåede 50% konfluens. Prostatacancerceller blev derefter behandlet og inkuberet med forskellige koncentrationer af piperin (50-200 uM) i 24, 48 og 72 timer hhv. Hver plade blev derefter inkuberet med 2 pi fluorescens-mærket caspase-probe (NIR-FLIVO 747 In Vivo Apoptose Tracer, immunokemisystemer Technologies, LLC, Bloomington, MN) i 15 minutter. Celler blev vasket med 100 pi 1 × PBS til fjernelse caspase substrat. Efter denne, 100 pi 1 × PBS blev sat til 24 timer plade og 100 pi af komplet medium blev tilsat til 48 h og 72 h plader, så cellerne ikke ville tørre ud, før læses. Pladerne blev aflæst under anvendelse af en LI-COR Odyssey maskine V3.0 til påvisning globale caspaseaktivering.

Annexin V-FITC farvning for apoptose detektion Salg

LNCaP-celler blev dyrket i en 8-kammer vævskultur slide i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og gentamycin, indtil celler bundet til brøndene. Celler blev derefter behandlet og inkuberet med forskellige koncentrationer af piperin (60 uM og 75 uM) i 24 timer. Medium blev derefter fjernet fra brøndene og anvendes senere til PSA testen. Apoptose blev bestemt under anvendelse af et Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit fra MBL International. Celler blev farvet ved tilsætning af 500 pi bindingspuffer, 5 pi Annexin, og 5 pi PI til hver brønd og inkubere i mørke ved stuetemperatur i 5-10 minutter. Bindingsbuffer blev Annexin og PI fjernes derefter fra brøndene sammen med kammeret. 2-3 dråber 1 × PBS blev sat til hver sektion af dias og overdækkede. Objektglasset blev derefter analyseret under anvendelse af et fluorescensmikroskop.

PSA testen

PSA assay blev udført under anvendelse supernatanterne indsamlet fra LNCaP-celler behandlet med piperin (5-150 uM). Prostataspecifikt antigen sekretion (ng /ml) blev bestemt ved anvendelse af et humant prostataspecifikt antigen ELISA Kit købt fra Abnova.

Western blot-analyse

LNCaP og PC-3-celler behandlet med 60 pM og 75 uM piperine henholdsvis og DU145 celler behandlet med 160 pM for 24 timer. Derudover blev LNCaP-celler også behandlet med 25 pM af piperin at bestemme virkningerne lav dosis. Efter behandling blev celler lyseret med prøve opløseliggørende puffer og underkastet SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembran for Western blot-analyse. Følgende antistoffer blev anvendt til immunoblotting. Anti-NF-kB (MBL International Inc.), anti-caspase-3 (eBioscience), anti-PARP-1 (SantaCruz Biotechnology), anti-STAT-3 og anti-phospho STAT-3 (cellesignalering Technologies), anti -PSA (Thermo Fisher), anti-Androgen receptor (Sigma Aldrich) og anti β-Actin-peroxidase (Sigma Aldrich) antistoffer blev anvendt med sælgerens anbefalede fortyndinger. Celler behandlet med 0,1% DMSO opløsningsmiddel tjente som kontroller.

Boyden kammer assay

LNCaP og PC-3-celler blev podet i en Transwell® (Corning) kammer, behandlet og inkuberes med piperin koncentrationer af 60 pM og 75 pM for henholdsvis 24 timer. Celler blev derefter fjernet fra toppen af ​​membranen med en pipette og eventuelle resterende celler blev fjernet under anvendelse af en vatpind. En HEMA 3 farvning sæt fra Fisher Scientific blev brugt til at fastsætte og plette cellerne. Derefter blev hver membran skylles med vand og eventuelt resterende plet blev fjernet fra toppen af ​​hver membran under anvendelse af en vatpind. Membraner blev analyseret for celle migration ved hjælp af et lysmikroskop (Nikon).

Dyr

6 uger gamle mandlige nøgne mus vejer cirka 20 gram blev opretholdt i Animal Facility på University of Illinois i Rockford College of Medicine. Alle eksperimentelle procedurer med dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Illinois i Rockford College of Medicine. LNCaP (5 x 10

6) og DU145 (1 × 10

6) celler suspenderet i samme volumen matrigel blev injiceret subkutant i siden regioner af de mandlige nøgne mus og tumorer fik lov at vokse. Når tumoren nåede 50 mm

3 i størrelse, mus blev behandlet dagligt med piperin (100 mg /kg) homogent fremstillet i vegetabilsk olie ved intraperitoneale injektioner i 1 måned. Kontrolgruppe blev injiceret med vegetabilsk olie alene. Virkningerne af piperin på prostata tumorvækst i nøgne mus blev også testet ved oral tvangsfodring som tidligere [10] beskrevne. For sondeernæring undersøgelse, LNCaP-celler (7 × 10

6) suspendend i matrigel blev subkutant implanteret i nøgne mus. Efter 24 timer efter implantation af LNCaP-celler blev mus behandlet dagligt med piperin (10 mg /kg legemsvægt) fremstillet i PBS ved oral sondeernæring. Kontroldyr modtog PBS alene gavage behandling. Følgende 1 måneds behandling blev mus aflivet ved carbondioxid inhalation efterfulgt af forblødning og tumorer blev udskåret og målt masse og volumen. Tumorvolumener blev beregnet ved formlen: [Volume = 0,5 × (Width)

2 x længde. Ovenstående

in vivo

eksperiment var i konkordans med ANKOMMER retningslinjer [11].

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med Graph Pad Prism 5-softwaren. Data blev sammenlignet ved anvendelse af t-test. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Piperine hæmmer proliferation og inducerer død i begge androgenafhængige (AD) LNCaP og androgen uafhængige (AI) DU145, 22RV1, PC-3 celler i. vitro

Vi først bestemmes anti-proliferative virkninger af piperin på humane prostata carcinom celler, herunder androgen følsomme (LNCaP) (figur 1A) og androgen ufølsomme (PC-3, 22Rv1, DU-145 celler: Figur 1B- 1D). Cellerne blev behandlet med (5-200 uM) piperin i 24, 48, 72 timer. Behandlingen af ​​LNCaP (AD) og PC-3 (AI) celler med piperin resulterede i signifikant reduktion af proliferation eller levedygtighed på en dosisafhængig måde med et IC-50 værdier på 60 pM og 75 pM henholdsvis som vurderet ved MTT. I tilfælde af 22Rv1 og DU-145 prostatacancerceller, piperin behandling udviste højere IC-50 værdier på 110 pM og 160 pM hhv. Således piperine synes at være i stand til at udøve en differentieret niveau af cytotoksiske virkninger afhængigt af typen af ​​prostatacancerceller med androgenafhængige prostatacancerceller (LNCaP) er den mest følsomme én. IC50-værdierne opnået fra denne celleviabilitetstest Resultaterne blev anvendt til at vurdere virkningerne af piperin på prostatacancerceller i efterfølgende eksperimenter.

Piperine inhiberer celleproliferation af LNCaP, PC-3, 22RV1 og DU-145 med et IC50 på ca. 60 pM, 75 pM, 110 pM og 160 pM i de respektive prostatacancerceller. Resultaterne viste, at piperin inhiberede proliferation af både androgen afhængig (LNCaP) og androgenuafhængige afledt prostatacancerceller (PC-3, 22Rv1 og DU145) i et tidsrum og dosisafhængig måde. Data præsenteret er repræsentativ for en af ​​tre lignende forsøg.

Piperine behandling reducerer prostataspecifikt antigen (PSA) niveauer i LNCaP celler

PSA er guld standard markør anvendes i diagnose og overvågning behandlingseffekt af prostatacancer. Vores indledende undersøgelser viste, at AR-positive LNCaP-celler var følsom for piperin behandling. Piperine behandling ved 75 uM koncentration inhiberede signifikant sekretion af PSA til nær normale niveau (4,244 ng /ml) sammenlignet med ubehandlede LNCaP-celler (41.24 ng /ml) (figur 2). Interessant, piperin med en lav dosis området fra 25 um til 60 uM havde også en betydelig indvirkning på PSA-sekretion fra LNCaP-celler.

PSA testen Resultaterne viste, at piperin har dosis afhængige virkninger på sekretionen af ​​PSA (nedstrømsmål af AR) i LNCaP-celler. . * P 0,05 sammenlignet med kontrol LNCaP celler

Piperine inducerer apoptose i PCA celler: Annexin-V FITC farvning analyse og caspaseaktivering assay

For at afgøre, om reduktionen i spredning og cellelevedygtighed af prostatacancerceller ved piperin blev associeret med induktion af apoptose, blev LNCaP-celler behandlet med forskellige koncentrationer af piperin og antal apoptotiske celler blev vurderet ved anvendelse af Annexin V- apoptotis afsløring kit som tidligere beskrevet [12]. LNCaP-celler blev behandlet med 60 pM eller 75 uM piperin i 24 timer og farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid at visualisere cellerne under fluorescerende mikroskop. Fluorescerende mikroskopisk analyse viste, at LNCaP-celler behandlet med piperin resulterede i et øget antal af apoptotiske celler sammenlignet med kontrolgruppen LNCaP-celler (figur 3) i en dosis-afhængig måde (60 uM og 75 uM henholdsvis). Baseret på de ovennævnte resultater, hvor vi bestemte koncentrationen af ​​piperin på inhibering af celleproliferation og induktion af apoptose, valgte vi en piperin koncentration på 60 uM til yderligere mekanistiske undersøgelser med LNCaP-celler.

Annexin-V- FITC-farvning af LNCaP-celler, viser, at celler behandlet med piperin var positive for annexin V binding som fremgår af fluorescenssignal. Pilen angiver celler positive for Annexin-V-farvning. Apoptotiske celler blev kvantificeret på grundlag af antallet af celler positive for Annexin-V-farvning sammenlignet med det totale antal celler er til stede i hvert felt. Resultater viser, at forøgelse af koncentrationen af ​​piperin ført til øget apoptose som vist i tabel 1 i Figur 3. Repræsentative resultater af en af ​​tre uafhængige evalueringer.

Udover Annexin-V-farvning, vi analyserede apoptose i LNCaP og PC-3-celler ved Global Caspase aktivering assay. Caspase er en værdifuld og pålidelig markør for apoptose. Vi analyserede derfor sin aktivering i LNCaP og PC-3-PCA cellelinier efter behandling med piperin af global caspaseaktivering assay under anvendelse fluorescens-mærket poly-caspase probe (figur 4). Cellerne blev inkuberet med 50-200 uM piperin på forskellige tidspunkter (24, 48, 72 timer). Både LNCaP og PC-3-celler behandlet med piperin resulterede i øget caspaseaktivering. Stigningen i caspaseaktivering i LNCaP-celler var i en dosis og tid afhængig måde henviser PC-3 udviste konsekvent høje niveauer af caspase aktivering ved både koncentrationen og på alle de tidspunkter, bortset fra 48 timer, hvor caspaseaktivering syntes at reducere og forøge igen. Dette kan skyldes de forskellige følsomheder af celle under forskellige tidspunkter. Taget sammen indikerer disse resultater, at piperin-induceret apoptose i både LNCaP og PC-3-celler via caspaseaktivering.

A NIR-FLIVO 747-konjugeret poly-caspase probe, som er en celle-permeable fluorescerende detektor af aktive caspaser, blev anvendt til at bestemme, om piperin aktiverer caspase i prostata kræftceller. LNCaP og PC-3-cellelinjer blev behandlet med piperin og derefter testet for caspaseaktivering. Resultaterne viste, at piperin induceret global caspase aktivering i både LNCaP (A) og PC-3 celler (B) så tidligt som 24 timer. Forsøgene blev gentaget fire gange og fået lignende resultater som vist i denne repræsentativt tal

Western blotting-analyse:. Piperine behandling aktiverer ekspression af caspase-3 og spalter PARP-1

aktivering af bøddel caspaser, dvs. caspase-3, resulterer i spaltning af et bredt spektrum af cellulære målproteiner, herunder poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), der fører til celledød [13]. Derfor bestemte vi effekten af ​​piperin på aktiveringen af ​​caspase-3 og Poly (ADP) ribose polymerase. Immunoblotanalyse af LNCaP (figur 5A og figur 5C) og DU-145, PC-3-celler (figur 5B) blev behandlet med piperin resulterede i en stigning i spaltningen af ​​caspase-3 og PARP-1 sammenlignet med celler behandlet med DMSO alene . Disse resultater var i overensstemmelse med de i globale caspaseaktivering at vi observeret før (figur 4).

(a) Western blot-analyse viste, at 60 pM piperin inhiberer ekspressionen af ​​AR, STAT-3 og NF-kB transkription faktorer i LNCaP-celler, mens samtidig at aktivere apoptotiske signaler (caspase-3 og PARP-1 aktivering). (B). Western blot analyse viste, at 160 pM og 75 pM piperin behandling inhiberer ekspressionen af ​​STAT-3 og NF-kB transkriptionsfaktorer i DU-145 og PC-3-celler ved at aktivere apoptotiske markører (caspase-3 og PARP-1 aktivering). C) immunblotresultaterne viste thatpiperine ved lavere dosis på 25 uM også hæmmer ekspressionen af ​​AR, STAT-3 og NF-kB transkriptionsfaktorer i LNCaP-celler foruden nedregulering PSA ekspression. Ændringer i ekspressionen af ​​proteiner er angivet med + eller – tegn. LNCaP, DU-145 og PC-3 celler behandlet med 0,1% DMSO alene tjente som kontroller (ctrl) i dette eksperiment.

Piperine behandling ned regulerer ekspressionen af ​​androgen receptor (AR), NF kB og phosphorylerede STAT-3

NF-kB og STAT-3 (phosphoryleret form af STAT-3) transkriptionsfaktorer og Androgen receptor (AR) spiller en kritisk rolle i celleproliferation, anti-apoptose, angiogenese og invasion af prostatacancerceller. Immunoblotanalyse af LNCaP (figur 5A) celler behandlet med 60 uM piperin viste reduktion i ekspressionen af ​​NF-kB og STAT-3 (phosphorylerede form af STAT-3) transkriptionsfaktorer og nedregulering af Androgen receptor (AR) i disse celler. Interessant lavere koncentration (25 uM) af piperin behandling faldt også ekspressionen af ​​phosphorylerede STAT-3, NF-kB og PSA-niveauer i LNCaP-celler (figur 5C). Vores resultater viste også, at DU-145 og PC-3 PCa (figur 5B) celler behandlet med 160 pM og 75 uM piperin henholdsvis dosis også resulteret i nedregulering af NF-kB og phosphorylerede STAT-3 ekspressionsniveauer, hvilket understreger anti- cancer effekter af piperin i prostata kræftceller.

piperine behandling reducerer celle migration in vitro

piperine behandling reducerede celle migration af LNCaP og PC-3 celler, hvilket antyder, at piperin har anti-vandrende effekter i prostatacancer (figur 6).

Boyden kammer assay shows der styrer LNCaP og PC-3 prostatacancerceller har et større antal af migrerede celler, mens LNCaP og PC-3-prøver behandlet med 60 pM og 75 pM piperin vise færre migrerede celler i Transwell® kamre. Pilen angiver migrerede celler. Inhiberingen af ​​cellemigrering antyder, at piperin kan have anti-migrerende egenskaber i prostatacancer. De viste data her er repræsentant for en af ​​tre lignende resultater.

Piperine administration hæmmer tumorvækst af human prostata cancer celle xenografter implanteret i immunsvækkede mus

Vi næste forsøgt at bestemme antitumor virkninger af piperin

in vivo

bruger xenograftmodel i nøgne mus. Som det fremgår af resultaterne, behandling med piperin reducerede signifikant tumorvækst i nøgne mus implanteret med LNCaP-celler med 72% [tumorvolumen (p 0,01) og tumormassen (p 0,01)] (Figur 7A 7B) og behandling af piperin reducerede også tumorvækst i nøgne mus implanteret med DU-145-celler med 41% [tumorvolumen (p 0,05) og tumormassen (p 0,05)] (Figur 7C 7D). Vigtigere, piperin (10 mg /kg) indgivet til nøgne mus ved tvangsfodring behandling inhiberede også tumorvækst af LNCaP-celler med 38% [tumorvolumen (p 0,05) og tumormassen (p 0,05)] (figur 8A 8B ) .Den reduktion i tumormasse og volumen i piperin behandlede grupper var signifikant. Baseret på disse resultater, synes piperin at have tumor undertrykkende virkninger på begge androgenafhængige og androgen uafhængige prostatacancerceller

in vivo

.

Piperine hæmmer væksten af ​​LNCaP og DU-145 afledte tumorxenoplantater i nøgne mus model. Tumorvolumen (mm

3) og vægte (g) af PIPERIN behandlede og kontrol ubehandlede nøgne mus blev målt på de angivne dage. Seks uafhængige tumorer blev indsamlet fra piperin behandlet LNCaP, DU-145 og styre nøgne mus hhv. Resultater (A-D) viste, at piperin injektion reducerede signifikant tumorvolumener og tumorvægt af både androgenafhængige og androgenuafhængige afledt prostatacancerceller implanteret i nøgne mus. * P 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen

Piperine givet til nøgne mus (n = 6) i en dosis på 10 mg /kg via tvangsfodring væsentlig grad hæmmer xenograft væksten af ​​LNCaP-tumorer sammenlignet med nøgen. mus (n = 6) givet PBS alene kontrolgruppe. Efter afslutning af behandlingen blev tumorer indsamlet fra nøgne mus målt for tumorvolumener og tumorvægt. Resultater (A B) viste, at piperin reducerede signifikant både tumorvolumener og tumorvægt af LNCaP afledte prostatacancerceller i nøgne mus. * P 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen

Diskussion

De seneste skøn i kønsfordelingen afslørede, at antallet af mænd i alderen 15 og 65 blev voldsomt forøget som havde. en direkte indvirkning på antallet af prostata cancer patienter [14]. Forskellige fysiske og genetisk forbundne faktorer bidrager til udviklingen af ​​prostatacancer. Håbet om prostatakræft behandling af “naturlige” diætprodukter også kendt som fytokemikalier er blevet et aktivt forskningsområde. Piperine er en sådan lovende forbindelse rigeligt til stede i peber krydderi [15]. Indtil videre er der ingen undersøgelse, som vurderer den direkte terapeutiske effekt af piperin på prostatakræft og kun få undersøgelser har vist sit potentiale i andre kræftformer [16], [17], [18], [19], [20]. Derfor har man i den foreliggende undersøgelse, vi søgte at evaluere effekten af ​​piperin som anti-cancer middel mod både androgenafhængige og uafhængige prostatakræft-cellelinier og undersøge de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for dens anti-proliferative aktiviteter. Den anti-cancer virkning piperin blev for nylig demonstreret i colon cancerceller [21]. I denne undersøgelse, piperine viste en tendens til anti-spredning på kolon kræftceller på 24 timer og en betydelig grad af hæmning på celleproliferation blev rapporteret på 48 og 72 timer henholdsvis [21]. I en anden undersøgelse blev piperin vist sig effektivt at inhibere Benzo (α) pyren induceret lunge carcinogenese i albinomus ved at beskytte proteiner fra skader, og ved at undertrykke celleproliferation [8]. I den foreliggende undersøgelse, observerede vi en antiproliferativ aktivitet udvist af piperin på androgenafhængige (AD) LNCaP og androgenuafhængige (AI) PC-3, DU-145 og 22RV1 PCA celler

in vitro

i en dosis afhængig måde. Resultater af vores undersøgelse afslørede, at LNCaP-celler var mere følsomme over for piperin rensning efterfulgt af PC-3, 22RV1 og DU-145-celler antyder, at piperin handlinger differentielt afhængigt af typen af ​​prostatacancer-cellelinie.

Den robuste anti proliferativ virkning udøvet af piperin på begge androgenafhængige og androgenuafhængige prostatacancerceller kan betragtes fordelagtig i behandlingen af ​​prostatacancer. Den tidlige fase prostatakræft afhænger af androgener for vækst og overlevelse, og androgen ablation terapi får dem til at relatere [22]. Kræft, der ikke helbredes ved hormonbehandling i sidste ende blive androgen uafhængig, hvilket gør anti-androgen terapi ineffektiv [22], [23]. Desuden vores undersøgelser viste også, at piperin er en inducer af apoptose i prostata cancer celler som indlysende fra Annexin-V immunfluorescensfarvning studier.

potentiale piperine at fremme apoptose er yderligere understøttet af dens evne til at forbedre caspaseaktivering i både androgenafhængige og androgen-uafhængige prostatacancerceller. En effektiv terapeutisk middel bør ikke kun begrænse spredning, men skal også være i stand til at aktivere programmeret celledød i både AD og AI prostata cancer celler [24], [25]. I betragtning af, at piperin effektivt hæmmede spredning af prostata cancer celler og induceret apoptose kan piperin være en lovende anti-prostatakræft agent, der fortjener yderligere undersøgelse som en kemoforebyggende eller kemoterapeutisk middel. Caspaserne, er impliceret i apoptose, klassificeres generelt som initiatorer og bødler celledød [26]. I denne undersøgelse fandt vi, at der var en hurtig stigning i den globale caspaseaktivitet fremkaldes af piperin i LNCaP-prostatacancerceller. Caspase-3 er den kritiske død relateret enzym, der udfører apoptose i prostatacancerceller [27]. Resultaterne i denne undersøgelse bekræfter, at piperin behandling aktiveret caspase-3 i prostatacancerceller. Dette blev yderligere bekræftet i vores studier, som vi observerede spaltning af PARP-1 [28] i piperin behandlet prostata kræftceller. At afgrænse den molekylære mekanisme, ved hvilken piperin inducerer apoptose, STAT-3 en central anti-apopoptic overlevelsesfaktor i prostatacancerceller blev evalueret. STAT-3 spiller en vigtig rolle i cancer celleproliferation, migration og invasion i mange typer cancer, såsom blære, ovarie, og hjerne [29], [30], [31]. I prostatacancer, er fundet STAT-3-aktivering at være forbundet med lymfeknude- og knoglemetastaser [32]. Blandt STAT-familien af ​​transskription proteiner, har hæmning af phosphoryleret STAT-3 er blevet identificeret som en kritisk mål for celledød ved forøget apoptose i PCA celler [33], [34], [35], [36]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse kan det postuleres, at piperin kan inducere apoptose ved at inhibere aktiveringen af ​​phosphoryleret STAT-3 i LNCaP, DU145 og PC-3-celler, som igen kan hæmme overlevelsen og væksten af ​​prostatacancerceller.

Udover at inhibere STAT-3, viste vores resultater, at piperin også målrettet ekspressionen af ​​nuklear faktor-kB (NF-kB) transskriptionsfaktor og androgen receptor (AR). NF-kB spiller vigtige roller i reguleringen af ​​cellevækst, differentiering, apoptose og metastaser [37], [38], [39]. Den eksisterende dokumentation fra nærværende undersøgelse peger også, at mange anti-cancer effekter af piperin også kan reguleres enten direkte eller indirekte af NF-kB. Vores resultater antyder, at NF-kB ned reguleres i LNCaP, PC-3 og DU-145 PCA-celler. Tilsvarende androgen receptor (AR) blev nedreguleret i LNCaP-celler. Nedreguleringen af ​​AR var i overensstemmelse med den samtidige reduktion i PSA-ekspression i LNCaP-celler behandlet med piperin. Den omstændighed, at androgenafhængige prostatacancerceller er mere følsomme for piperin behandling kan skyldes nedregulering af AR, som er kritisk for overlevelsen af ​​androgenafhængige prostatacancerceller såsom LNCaP-celler, som vi anvendt i denne undersøgelse.