Abstrakt
Evaluering
HER2
genamplifikation er et væsentligt element i terapeutisk beslutningstagning for fremskreden eller metastatisk mavekræft. En simpel metode, der kan anvendes på små, formalinfikserede, paraffinindlejrede biopsi prøver er ønskeligt som et supplement til eller som erstatning for øjeblikket anvendes HER2 immunhistokemi og in situ hybridisering protokoller. I denne undersøgelse har vi udviklet en mikrofluidik-baserede digitale PCR-metode til bestemmelse af
HER2
og kromosom 17 centromer (CEP17) kopiere numre og estimering tumor indhold ratio (TCR).
HER2-service /CEP17 forholdet er bestemt af tre variabler-TCR og absolutte kopi antal
HER2
CEP17-ved at undersøge tumorceller; kun forholdet mellem de to sidstnævnte kan opnås ved digital PCR under anvendelse af helt præparat uden oprensning tumorceller. TCR blev bestemt ved halvautomatisk billedanalyse. Vi udviklede en tumor Content diagram, som er et plan af rektangulære koordinater bestående af
HER2-service /CEP17 digital PCR data og TCR der afgrænser amplificerede, ikke-amplificeret, og tvetydige områder. Ved at anvende denne fremgangsmåde blev 44 kliniske mavekræft biopsiprøver klassificeret som amplificeret (n = 13), ikke-amplificeret (n = 25), eller tvetydig (n = 6). Til sammenligning 11 prøver var positive, 11 var negative, og 22 var tvetydigt immunhistokemi. Således er vores ny metode reduceret antallet af tvivlsomme prøver fra 22 til 6, hvorved behovet for bekræftelse ved fluorescens eller dual-sonde in situ hybridisering til 30% af tilfældene. Tumor indhold chart-assisteret digital PCR-analyse er også for flere steder i kirurgisk resektion væv. Disse resultater indikerer, at denne analyse er et nyttigt alternativ til HER2 immunhistokemi i gastrisk kræft, der kan tjene som grundlag for den automatiske evaluering af
HER2
status
Henvisning:. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Chart-Assisted
HER2 /
CEP17 Digital PCR analyse af mavekræft biopsi prøver. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA
Modtaget: November 7, 2015; Accepteret: 13. april, 2016 Udgivet: 27 April, 2016
Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer
Finansiering:. Dette arbejde blev udført som en del af BioBank Japan Project (https://www.src.riken.jp/english/project/person/), der blev støttet af Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (https://www.mext.go.jp/english/), Japan agentur for medicinsk forskning og udvikling (http: //www.amed.go .jp /da /), og tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning (KAKENHI) fra Japan Society for fremme af Science (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
mavekræft er en af de mest almindelige ondartede tumorer og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i hele verden [1]. Avancerede tilfælde uden operative indgreb har dårlig prognose og nødvendiggør tværfaglige behandlingsmetoder. HER2 er en 185-kDa transmembrane glycoprotein, er et medlem af den epidermale vækstfaktor-receptorfamilien og fungerer som en tyrosinkinasereceptor [2, 3]. I normale celler, HER2 protein fungerer som et signal transducer under celleproliferation eller -differentiering [4]; men det har onkogene egenskaber ved overekspression. Dette er normalt forårsaget af
HER2
genamplifikation, som er blevet rapporteret i flere typer af ondartet svulst [5], herunder brystkræft [6, 7], spytkirtel adenocarcinom [8], urinblære kræft [9] og gastrisk cancer [10]. HER2-overekspression gastrisk kræft tegner sig for 8% -31% af alle tilfælde [11-15]. I Trastuzumab for mavecancer forsøg, trastuzumab (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) -a humaniseret anti-HER2 monoklonalt antistof-øget overlevelsesraten for patienter med HER2-positive gastriske cancere, når de indgives i kombination med kemoterapi [16], og var også godkendt til behandling af brystcancer [17, 18]. Evaluering HER2 status er derfor et væsentligt aspekt af mavekræft terapi.
For patienter med inoperabel gastrisk kræft, bør HER2 status undersøges ved hjælp af en lille biopsi prøve. Som repræsenteret i seneste anbefalinger for HER2 test i brystkræft ved American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American Pathologists (CAP), immunhistokemi (IHC) og /eller in situ hybridisering (ISH) er standard metoder til evaluering HER2 status [19], men hver har sine begrænsninger. For eksempel er effektiviteten af HER2-IHC påvirkes af flere faktorer, såsom formalin fiksering proces, og pointsystemet er ikke altid reproducerbar især i tvetydige tilfælde, hvor der anbefales ISH [19-25]. I lyse felt
HER2
dual-sonde ISH (
HER2
-DISH),
HER2
og kromosom 17 centromer (CEP17) kopi kan påvises numre som signaler under et lys mikroskop over hele regionen af prøven. Selv om denne metode har overlegen følsomhed, det er dyrt og forholdsvis tidskrævende
I denne undersøgelse har vi anvendt mikrofluidik-baserede digitale PCR-teknologi. (BioMark; Fluidigm, Cambridge, UK) [26] til at bestemme
HER2
/CEP17 kopi nummer ratio. I digital PCR, er template-DNA opdelt i 770 stykker i nanoliter reaktionskamre, med en forventet koncentration på 0-1 molekyle pr kammer. Dual-farvede mål- og referencepunkter gener er samtidig PCR-forstærket og deres kopiantal beregnes ved at tælle kamrene med positive signaler. Denne meget robust metode muliggjorde sammenligning af
HER2
og CEP17 kopiantal ved hjælp af forskellige primer sæt. Formålet med denne undersøgelse var at bekræfte gennemførligheden af digitale PCR-teknologi til analyse af gastriske cancer biopsiprøver. , Et problem ved denne fremgangsmåde er imidlertid, at vævet sædvanligvis indeholder ikke-kræft stromaceller som interfererer med molekylære analyser. For at overvinde dette problem har vi udviklet todimensionale punktdiagram benævnt Tumor Content (TC) diagram, der allokerer data i amplificeret, ikke-amplificeret, og tvetydige kategorier. Målet var at udvikle en automatiseret måde at evaluere
HER2
status, med TC chart-assisteret
HER2
/CEP17 digital PCR-analyse tjener som det første skridt.
Materialer og Metoder
Etik Statement
Denne undersøgelse blev godkendt af University of Tokyo institutionelle Etisk Udvalg. Kliniske prøver med skriftligt informeret samtykke blev indsamlet under University of Tokyo Institutionelle retningslinjer for undersøgelse af humane væv.
Kliniske gastrisk kræft biopsi prøver og kirurgiske prøver
I alt, 44 mavekræft biopsi prøver fra 32 patienter, der behandles af rutinemæssig formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) var tilgængelige til analyse. Alle biopsi prøver blev opnået endoskopisk ved Institut for Endoskopi og Endoskopisk kirurgi. Fire kirurgiske prøver, som blev operativt fjernede kirurgisk ved Institut for Gastrointestinal Kirurgi, blev også analyseret. Disse prøver blev fikseret i 10% neutral pufret formalin. Alle tilfælde blev diagnosticeret ved Patologisk Institut ved universitetet i Tokyo Hospital. Snit blev skåret i en tykkelse på 4 um ved anvendelse af traditionelle histologiske teknikker; disse blev indsamlet på objektglas og anvendes til hæmatoxylin-eosin (HE) farvning, HER2-IHC, og
HER2
-DISH.
Immunhistokemi
immunhistokemisk farvning blev udført på FFPE væv under anvendelse Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) med 4D5-anti-HER2-antistof. Farvningsintensitet og membran immunoreaktivitet mønstre blev vurderet ved anvendelse af Dako pointsystemet efter retningslinier ASCO /CAP [19]. Nogen membran farvning blev bedømt som 0; svag eller lige akkurat synlig /ufuldstændig membran farvning blev scoret som 1+; ufuldstændig og /eller svag /moderat omkredsen membran farvning blev scoret som 2+; og helt og intenst omkredsen membran farvning blev scoret som 3+.
HER2-
parabol farvning og evaluering
HER2
-DISH blev udført på FFPE væv ved hjælp af HER2-DNA parabol kit (Roche Diagnostics) i overensstemmelse med producentens instruktioner, og prøver blev vurderet ved lysmikroskopi.
HER2
signaler optrådte som sorte prikker eller klynger, og CEP17 signalerne fremstod som røde prikker. Tyve ikke-overlappende kræft kerner blev scoret for
HER2
CEP17 signaler og
HER2
genamplifikation blev klassificeret som anbefalet af retningslinjerne for ASCO /CAP [19]; positiv, [
HER
2 /CEP17 forholdet ≥ 2,0] og /eller [gennemsnit
HER
2 kopiantals ≥ 6,0 signaler /celle]; tvetydig, [
HER
2 /CEP17 forholdet 2.0] og [gennemsnit
HER
2 kopiantals ≥ 4,0 og 6.0 signaler /celle]; negativ, [
HER
2 /CEP17 forholdet 2.0] og [gennemsnit
HER
2 kopiantals 4,0 signaler /celle].
Forberedelse af DNA fra FFPE klinisk materiale
For at udtrække DNA fra biopsiprøver, 10 serielle snit skåret i en tykkelse på 10 um blev placeret på en glasoverflade for HER2 -IHC og
HER2
-DISH. Tumor indhold blev bekræftet før og efter sektionering ved farvning de tilstødende lysbilleder med HE. Da en enkelt paraffin blok indeholder sædvanligvis flere stykker biopsiprøve blev individuelle prøver isoleret ved anvendelse af en glas cutter. For at ekstrahere DNA fra kirurgiske resektion prøver blev 5 serielle snit fra hvert repræsentativt væv-blok skåret i en tykkelse på 10 um, som blev anbragt på en plade fremstillet af polytetrafluorethylen (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japan). Membranen er kemisk resistens for xylen-baserede afparaffinering, og er let skæres i stykker. I undersøgelsen, forskellige dele var klippet ud fra arkene ifølge HER2 profil. Glas- eller PTFE stykker blev samlet i en 2,0-ml rør, og DNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
HER2
kopital vurdering ved digitale PCR Salg
primer sæt til amplifikation
HER2
og CEP17 er vist i tabel 1. Hver primer blev udformet således, at PCR-produkterne var de opnåede tilstrækkelig kort (59 og 65 bp) for at eliminere indflydelse af DNA-fragmentering i FFPE processen. Digital PCR blev udført under anvendelse af et EP1-system med en 48,770 digital matrix integreret strømningsteknisk kredsløb (Fluidigm). Hver chip indeholdt 48 paneler, der blev yderligere opdelt i 770 reaktionskamre. Antallet af positive fluorescerende signaler i hvert panel blev anvendt til at kvantificere forskellige DNA-sekvenser. Protokollen er beskrevet andetsteds [26]. Kort fortalt blev 4-pi reaktionsblandinger fremstillet for hver analyse, der indeholdt 1 x TaqMan genekspression mastermix, 1 × HER2-FAM og chr17cent-VIC TaqMan prober, og 1 × prøvepåfyldning reagens (Fluidigm). Reaktionsblandingen blev jævnt fordelt i 770 reaktionskamre og den digitale Grupperingen blev termo-cykluser på et EP1 System FC1 cykliseringsapparat. De to målregioner blev uafhængigt forstærket og 6-carboxyfluorescein og VIC farvestof signaler i kamrene blev registreret i slutningen af hver PCR-cyklus. Antallet af 6-carboxyfluorescein-positive (HER2) og VIC-positive (CEP17) kamre i hvert panel blev talt og
HER2
/CEP17 kopi nummer forholdet blev beregnet [27].
Evaluering af tumor indhold ratio (TCR)
Hele slide billede af HE sektioner, som var dem, lige før de serielle sektioner for dna-ekstraktion, blev scannet ved hjælp NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Data blev importeret til Definiens Tissue Studio 2.0 (https://www.tissuestudio.com) til bestemmelse af TCR. Den valgte region kirurgiske prøver blev scannet ved hjælp af en BZ-710 mikroskop (Keyence, Osaka, Japan). Data blev importeret til Hybrid celletal software (BZ-H3C, Keyence). Data, som detaljeret antallet af celler i importerede billeder og fornemme kræft fra ikke-kræft celler baseret på kerne størrelse blev automatisk genereret
Eksperimenter for at udvikle de TC diagrammer
cellelinjer.
i kontroleksperimenter, H522 lungecancer og SK-BR-3-brystcancercellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr-virus-transformerede lymfoblastoide cellelinje (LCL) blev opnået fra Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522-celler og LCL blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute-1640-medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 1% penicillin-streptomycin-opløsning ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japan) med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 5% CO
2. DNA blev ekstraheret under anvendelse af et QIAquick DNA mini kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, og LCL celle blokke var forberedt på
HER2
-DISH evaluering.
Trinvis blanding med LCL.
Genomisk DNA fra H522 og SK -BR-3-celler og LCL blev indstillet til en koncentration på 50 ng /pl. H522 og LCL genomisk DNA blev blandet i otte trin ved følgende volumenforhold: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 og 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 og LCL genomisk DNA blev blandet i fire trin ved følgende volumenforhold: 8: 2, 6: 4, 4: 6, og 2: 8 (SK-BR-3: LCL).
statistiske analyser
Chi-squared test blev anvendt til at sammenligne tællinger mellem
HER2
-DISH og digital PCR i H522 og SK-BR-3 celler og LCL. Forskelle blev anset for at være væsentlig, hvis
s
0.05
Resultater
Udvikling af TC chart for digitale PCR data
HER2-service /CEP17 forholdet blev bestemt ud fra tre variabler:. TCR og absolut kopi antal
HER2
CEP17. Kun de relative forhold mellem de to sidstnævnte kan opnås ved digital PCR under anvendelse af tumorprøve uden at isolere enkelte celler.
HER2-service /CEP17 forholdet opnået ved digital PCR [
r
] blev udtrykt som følger, baseret på den antagelse, at gen-kopi antal kræftceller er homogene, og at ikke-kræft celler er genetisk stabil med diploide kromosomer (fig 1A og 1B) 🙁 1) hvor [
r
] er forholdet mellem
HER2
at CEP17 opnås ved digital PCR (0
r
); [
x
] er TCR (0 ≤
x
≤ 1); [
En
] er CEP17 kopi nummer i en enkelt kræftcelle (0 ≤
A
); og [
B
] er
HER2
kopi nummer i en enkelt kræftcelle (0 ≤
B
). Herefter er den todimensionale scatterplot repræsenteret ved ligning (1) benævnt TC diagrammet.
(A) Matematisk repræsentation af sammenhængen mellem
HER2-service /CEP17 nøgletal opnået ved digital PCR [
r
] og TCR [
x
] (øverste). Når [
B-service /
A
= 2], [
r
] er repræsenteret ved den højre side af ligningen (angivet med en pil), og i højre hånd medlem af ligningen angiver en monoton stigning. En skematisk model er vist for [
A
= 2] og [
B
= 4] (nederst til højre). (B) TC diagram påvist ved ligning (1). Forholdet kan plottes som en lige linje (rød) repræsenteret ved [
r
=
x
+ 1], hvilket er grænsen mellem negative og tvetydige områder. Da værdien af [
En
] overstiger 2,0, linjer bliver mere og mere konveks og kurve opad i henhold til denne ligning. Linjer konvergerer ved koordinaterne (0,1) og (1,2). I kliniske prøver, [
A
] var begrænset til en værdi mellem 2 og 8. Det område, der afgrænses af lige røde linje [
r
=
x
+ 1] (
A
= 2) og den lilla linje buer opad [
r
= (7
x
+ 1) /(3
x
+ 1 )] (
A
= 8) blev udpeget som den tvetydige område, og området over den lilla linje blev udpeget som den positive område.
i den foreliggende undersøgelse, [
x
] blev bestemt ud fra HE-farvede prøver vha billedanalyse software, såsom Tissue Studio billedanalyse software til biopsi prøver og Hybrid celletal software til de kirurgiske prøver henholdsvis; og [
r
] og [
x
] blev bestemt ud fra målinger.
ligning (1) var repræsenteret grafisk som TC diagram, med [
r
] og [
x
] som de lodrette og vandrette akser, henholdsvis (figur 1B). Forholdet mellem [
B-service /
En
] var referenceværdien til bestemmelse
HER2
genamplifikation. Faktisk det faktiske antal kopier af CEP17 [
A
] og
HER2
[
B
] kunne ikke bestemmes uden at udføre
HER2
-DISH. Men en praktisk vurdering af
HER2
og CEP17 kopiere numre af parabol fandt, at [
En
] varierede fra 2,0 til 6,0 (mellem 40 og 117 CEP17 signaler blandt 20 kræftceller i S1 og S2 Tables) og aldrig oversteget 8,0 i kliniske gastrisk kræft prøver. Ifølge vores erfaring af 164 på hinanden følgende tilfælde af mavekræft (Ushiku T
et al
. Upublicerede data), CEP17 kopi nummer er 1,0-5,7, median 2,5, og monosomi, defineret som [
A
1.5], er ret sjælden i kun to tilfælde (1,2%). Således intervallet [
A
] blev indstillet som [2 ≤
A
≤ 8] med en sikkerhedsmargen.
Vi definerede
HER2
forstærkning-negativ som [
B-service /
En
2] eller [
B
2
A
]. [
Bx
+ 2 (1 –
x
)] blev derefter udtrykt som følger: (2)
Begge sider af ligning (2) blev divideret med [
Ax
+ 2 (1 –
x
)] 🙁 3)
Ved at kombinere med ligning (1) og (3) gav følgende: (4) (5)
Eq (5) var en betingelse svarende til [
B-service /
en
2]. Den højre side medlem af ligning (5) viste en monoton stigning efter variablen [
A
] (2 ≤
A
≤ 8); inkorporering af [
A
= 2], som var den mindste værdi af [
En
], i ligning (5) gav følgende: (6)
Derfor når ligning (6) var tilfreds,
HER2
forstærkning-negative tilstand [
B-service /
En
2] var sandt for enhver værdi af [
A
] (2 ≤
A
≤ 8).
På den anden side, at definitionen af
HER2
forstærkning-positive var [
B-service /
A
≥ 2] eller [
B
≥2
A
]. I dette tilfælde [
Bx
+ 2 (1 –
x
)] blev udtrykt på følgende måde: (7)
Eq (7) blev behandlet på samme måde som ligning (2) – (5) og blev udtrykt på følgende måde: (8)
ligning (8) var en betingelse svarende til [
B-service /
a
≥ 2]; højre medlem af ligningen indikerede en monoton stigning. Inkorporering af [
A
= 8], som var den maksimale værdi af [
En
], i ligning (8) gav følgende: (9)
Således når ligning (9) var tilfreds,
HER2
forstærkning-positive tilstand [
B-service /
A
≥ 2] var sandt for enhver værdi af [
A
] (2 ≤
A
≤ 8).
Når ligning (6) og (9) blev afbildet på TC diagrammet, området over linje buer opad [
r
= (7
x
+ 1) /(3
x
+ 1)] (
A
= 8) blev udpeget som det positive område, og området under den rette linje [
r
=
x
+ 1] (
A
= 2) var den negative område. Området afgrænses af linjen [
r
=
x
+ 1] og [
r
= (7
x
+ 1) /(3
x
+ 1)] var ubestemt zone afhængig af værdien af [
en
], der blev udpeget som den tvetydige område og defineret som følger (figur 1B) 🙁 10)
Når [
x
] var 0 (der ikke indeholder kræftceller), alle linjer konvergerede på koordinaterne (0,1) baseret på den antagelse, at ikke-kræft celler er genomisk stabile. Når [
x
] blev 1,0 (bestående af kun kræftceller), linjer passeret gennem koordinaterne (1,2) uafhængigt af værdier for [
En
] og [
B
].
Sammenligning af digital PCR og
HER2
-DISH i dyrkede celler
Vi valideret den teoretiske ligning (1) og TC diagrammet ved en trinvis blanding-system af cellelinier. Den ligning (1) blev opnået ved hjælp af faktisk målte værdier for [
En
] og [
B
] opnås ved
HER2
-DISH i cellelinjer, eller ved hjælp af beregnede [
B ‘
] fra [
En
] og målt [
r
].
Relativ kopi antal
HER2
CEP17 (
HER2
/CEP17) i LCL og H522 og SK-BR-3cells blev evalueret af
HER2
-DISH hjælp FFPE celle blokke og ved digital PCR (tabel 2).
HER2
signaler optrådte som diskrete prikker i kerner fra
HER2
-DISH (Fig 2A og 2B);
HER2
kopi nummer i individuelle celler var næsten to i LCL og fire i H522 celler. I modsætning hertil SK-BR-3 celler viste grupperet
HER2
signaler, der var svært at skelne individuelt (figur 2C); deres antal blev arbitrært sat til de maksimale værdier for 7, 14 og 21 ifølge klyngestørrelser. Således en lavere
HER2-service /CEP17 forholdet blev opnået ved
HER2
-DISH end ved digital PCR.
(A-C) mikrografier af
HER2
-DISH af LCL, H522, og SK-BR-3 FFPE celle blokke.
HER2
signaler vises som sorte prikker eller klynger, og CEP17 signaler vises som røde prikker.
HER2
og CEP17 kopiere numre målt ved
HER2
-DISH og digital PCR er vist i tabel 2. (A) LCL var genomisk stabil med to par signaler svarende til
HER2
CEP17, efterligner ikke-kræft stromale eller inflammatoriske celler. (B) I H522 celler, både
HER2
og CEP17 signaler viste sig som prikker og individuelle signaler var mærkbar. (C) I SK-BR-3 celler,
HER2
signaler dannet klynger og nøjagtige målinger var vanskelige. CEP17 signaler varierede mellem 3 og 7, med en gennemsnitlig score på 83/20 = 4,15. (D, E) Genomisk DNA fra H522 og SK-BR-3-celler blev blandet med LCL-genomet på en trinvis måde og analyseres ved digital PCR. Den vandrette akse repræsenterer forholdet mellem H522 eller SK-BR-3 til LCL, svarende til TCR [
x
] i kliniske tilfælde; den lodrette akse repræsenterer forholdet mellem HER2 til CEP17 i digital PCR [
r
]. [
En
] og [
B
] blev bestemt ved
HER2
-DISH (tabel 1). (D) I H522, [
A
= 2.05] og [
B
= 4,25], hvilket giver [
r
= (4,25
x
+ 2 (1 –
x
)) /(2,05
x
+ 2 (1 –
x
))] (fast grå linje). Plottede data blev tilnærmet med den teoretiske linje. (E) I SK-BR-3 celler, [
A
= 4.15], men
HER2
kopi nummer [
B
] var svært at afgøre, på grund af klyngedannelse .
HER2
kopi nummer [
B ‘
] blev forudsagt [
B’
= 5.69 × 4.15 = 23,61] baseret på digitale PCR-data [
r
] og CEP17 kopi nummer [
A
]. Ligningen [
r
= (23,61
x
+ 2 (1 –
x
)) /(4,15
x
+ 2 (1 –
x
))] er repræsenteret ved den fuldt optrukne grå linje. Plottede data blev tilnærmet med den teoretiske linje.
H522 og SK-BR-3-genomisk DNA blev blandet med den LCL på en trinvis måde, og blandingerne blev analyseret ved digital PCR. I H522 celler,
HER2
[
B
] og CEP17 [
A
] kopi tal blev beregnet ud fra
HER2
-DISH som følger: [
A
= 41/20 = 2,05] og [
B
= 85/20 = 4,25]. Når værdierne af [
En
] og [
B
] blev anvendt til ligning (1), kan dataene beskrives ved referencelinjen [
r
= ( 4,25
x
+ 2 (1 –
x
)) /(2,05
x
+ 2 (1 –
x
))] (fig 2D ). I tilfælde af SK-BR-3 celler, CEP17 kopi nummer [
En
] var [
A
= 83/20 = 4,15]; Men som beskrevet ovenfor,
HER2
signaler blev grupperet, der faldt det anslåede antal kopier. Derfor anvender [
A
= 4.15], [
r
= 5.69], og [
x
= 1,0] til ligning (1), den anslåede
HER2
kopi nummer [
B ‘
] blev formodes at være [
B’
= 5.69 × 4.15 = 23,61]. Derfor [
A
= 4.15] og [
B ‘
= 23,61] whilethe referencelinje var [
r
= (23,61
x
+ 2 (1 –
x
)) /(4,15
x
+ 2 (1 –
x
))] (fig 2E). Plottede digitale PCR data fra SK-BR-3-celler blandet med LCL lige med denne linje i stedet for [
r
= (19,50
x
+ 2 (1 –
x
)) /(4,15
x
+ 2 (1 –
x
))], som var baseret på
HER2
-DISH data, for hvilke [
B
= 19.50]. Disse resultater viser gyldigheden af TC chart-dvs. at der er tilstrækkelig quantitativity af digital PCR at skelne HER2-amplificeret fra ikke-forstærkede celler
Overensstemmelse mellem TC diagram for digital PCR og HER2-IHC /. – DISH i kliniske biopsiprøver
mavekræft biopsiprøver (n = 44) fra 32 patienter blev analyseret ved digital PCR.
HER2
status af hver prøve blev bestemt ved HER2-IHC og -DISH (Fig 3A-3C). De estimerede værdier var i overensstemmelse med manuelle tællinger foretaget af en patolog (KM). TC blev bestemt fra billeder ved at skelne kerner af kræft fra de ikke-kræft celler (Fig 3D).
(A-C) Repræsentative tilfælde vises med HE farvning, HER2-IHC, og
HER2
-DISH. (A) Sag # 37: HER2-IHC score = 0,
HER2
-DISH ratio = 1,09. (B) Sag # 6: HER2-IHC score = 2+,
HER2
-DISH ratio = 2,83. (C) Sag # 25: HER2-IHC score = 3+,
HER2
-DISH ratio = 6,56. (D) TC beregnedes baseret på forholdet af kerner tællinger af hele kerneholdige og kræftceller, som var halvautomatisk kendetegnet ved nucleus størrelse-med kræftceller, der viser forstørrede kerner-ved hjælp af Tissue Studio billedanalysesoftware.
Digital PCR-data og TCR i hvert tilfælde blev afbildet på TC diagrammet (Fig 4), herunder data for
HER2
-DISH-positive (rød), -equivocal (lilla) og – negativ (blå), samt HER2-IHC-positive (rhombi), -equivocal (trekanter), og -negative (cross-mark) prøver. Klinisk-patologisk information om repræsentative og totale tilfælde er vist i tabel 3 og S1 Table hhv. Der var ingen
HER2
-DISH-positive tilfælde under stregen [
r
=
x
+ 1]; dog én
HER2
-DISH-negative (# 32), to tvetydige (# 8 og # 15), og tre positive (# 1, # 41 og # 44) tilfælde blev observeret i tvetydige område . Desuden var der en
HER2
-DISH-negative tilfælde i den positive område (# 33). Tre tilfælde (# 25, # 26 og # 42) viste markant høje digitale PCR værdier (28.25, 19.99, og 24.00, henholdsvis). I
HER2
-DISH, disse sager viste grupperet
HER2
signaler (Fig 3C), der var vanskelig at kvantificere, som i SK-BR-3 celler. Eq (1) blev også udtrykkes således: (11)
Hver sag blev evalueret af HER2-IHC og digital PCR, og derefter godkendes af
HER2
-DISH (tabel 3 og S1 Table ). Resultaterne er afbildet på TC-chart. Resultaterne af HER2-IHC repræsenteres af symboler som følger; 3+ (positiv) som rhombi; 2+ (tvetydigt) som trekanter; 0 ~ 1 + (negativ) som cross-mærket. Resultaterne af
HER2
-DISH er afbildet med farver som følger; positiv, rød; tvetydig, lilla; negativ, blå. Flere sager er taget fra de samme patienter (PT) er fremhævet. Den lodrette akse mellem 0,5 og 2,5 blev lineært bestilt og det øverste område blev logaritmisk bestilt. Der var ingen positive tilfælde (rød rhombi) benægtende område, viser, at digital PCR kan frasortere negative sager med høj specificitet. På den anden side, tilfælde plottet i tvetydige område var ikke altid positiv, som bestemt af CEP17 kopi nummer. Tre tilfælde (# 25, # 26 og # 42) viste markant high scores, og en klyngedannelse mønster i
HER2
-DISH (figur 3C).
Teoretisk anslået [
B-service /
A
] blev beregnet ved anvendelse af målte [
r
] og [
x
] og målt [
A
], som blev bestemt ud fra tællinger af CEP17 signaler opnået ved
HER2
-DISH i 20 cancerceller (tabel 3 og S1 tabel). [
B ‘
] blev også opnået ved at måle [
r
] og [
En
] og [
x
= 1], som beskrevet for SK-BR-3 celler.
Flere sager blev evalueret for otte patienter (fig 4 og S1 tabel). Alle tilfælde i hver patient viste de samme resultater for parabol og digital PCR bortset Patient-24 (Pt-24); en af fem tilfælde (# 29) var positiv og to (# 30 og # 31) var negative for begge målinger. To tilfælde negative for parabol blev tildelt positive (# 33) og tvetydige (# 32) områder i TC diagrammet (tabel 3 og S1 tabel).
I alt 22 HER2-IHC tilfælde havde en score på 2+ (tabel 4), omfattende tre positive, 15 negative, og fire tvetydige tilfælde baseret på TC diagram af digitale PCR. Positive og negative resultater var fuldstændig overensstemmende med de
HER2
-DISH. Af de fire tvetydige tilfælde med IHC score 2+, en (# 1) var positiv, og de andre (# 8, # 32 og # 41) var negative, som bestemt af
HER2
-DISH. Den anslåede [
B-service /
A
] værdi var således ≥ 2,0 i tilfælde # 1 og 2.0 i de tre sidstnævnte, bortset fra tilfælde # 41, den anslåede [
B-service /
En
] hvoraf var 2.12.
Evaluering af intratumoral HER2 heterogenitet i kirurgiske prøver
intratumoral HER2 heterogenitet blev evalueret af en kombination af HER2-IHC /-DISH og digital PCR (Fig 5, S1 Fig og S2 tabel). Case_1, 2, og 4 viste tydelig intratumoral heterogenitet bestående af HER2-IHC-positive og -negative læsioner i en klynge, mens Case_3 generelt viste en tvetydig HER2-IHC udtryk mønster. Vigtigere, HER2-positive læsioner var tilgængeligt fra hulrummet i maven i Case_1 (# 1-2, # 1-3), Case_2 (# 2-1, # 2-2), og Case_4 (# 4-4).
(a) Fire kirurgiske resektion tilfælde blev vurderet i hvert repræsentativt udsnit af en kombination af HE farvning HER2-IHC, og -DISH. Hvert tilfælde angives med farver; Case_1, mørkegrøn; Case_2, marine blå; Case_3, mørk rød; Case_4, mørk lilla. Høje forstørrelse udsigt over HE farvning, HER2-IHC, og
HER2
-DISH er vist i S1 Fig. Regioner udvalgt til DNA-ekstraktion er afgrænset af en solid sort linje. Case_1, _2, og _4 viser heterogenitet i HER2-status. HER2-overekspression områder i HER2-IHC generelt svarede til
HER2
forstærkning områder, med klynger eller flere
HER2
signaler i
HER2
-DISH. Region # 2-2 indeholder komponenter, der viser både HER2-IHC 3+ og 0-1. Case_3 består af relativt homogene komponenter viser en HER2-IHC 2+ (tvetydig) mønster. (B) De digitale PCR-resultater er plottet på TC-diagrammet på samme måde som i figur 4. Hver plot er markeret med navnet prøven og [
r
] værdi i den enkelte sag farve. Den lodrette akse mellem 0,5 og 2,2 blev lineært bestilt og det øverste område blev logaritmisk bestilt.
Alle HER2-IHC /-DISH-positive tilfælde blev plottet i den positive område.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.