PLoS ONE: CCL21 /CCR7 Forbedrer spredning, migration og invasion for Human blærekræft T24 Cells

Abstrakt

Målsætning

For at undersøge virkningerne af CCL21 /CCR7 om spredning, migration og invasion af T24 celler og eventuelle hermed mekanismer:. ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9, og regulering af BCL-2 og BAX proteiner

Metoder

T24 celler modtaget tilsvarende behandlinger herunder vehikelkontrol, antistof (20 ng /mL CCR7-antistof og 50 ng /ml CCL21), og 50, 100, og 200 ng /ml CCL21. Proliferation blev vurderet ved MTT-assay; cellemigration og invasion blev analyseret under anvendelse af et Transwell kammer. Celle apoptose blev induceret ved Adriamycin (ADM). Hastigheden af ​​celle apoptose blev undersøgt ved flowcytometri under anvendelse annexin V-FITC /PI-farvning. Western-blot blev anvendt til at analysere MMP-2 og MMP-9 og bcl-2 og BAX proteiner.

Resultater Salg

CCL21 fremmes T24-celleproliferation i koncentrationsafhængig måde med at 200 ng /ml inducerede den største mængde spredning. blev fundet signifikante forskelle i celle migration mellem CCL21treatment grupper og kontrolgruppen i både migration og invasion undersøgelser (P 0,001 for alle). Udtrykkene af MMP-2 og MMP-9 proteiner blev øget væsentligt efter CCL21 behandling (p 0,05 for alle). Protein ekspression af Bcl-21 følger en stigende tendens, mens ekspressionen af ​​Bax følger en nedadgående tendens som den koncentration af CCL21 stiger. Ingen forskel blev fundet mellem kontrolgruppen og antistof-gruppe for alle vurderinger.

Konklusion

CCL21 /CCR7 forfremmet T24 celledeling og styrket sin migration og invasion via øget ekspression af MMP-2 og MMP-9. CCL21 /CCR7 havde antiapoptotiske aktiviteter på T24 celler via regulering af bcl-2 og Bax proteiner. CCL21 /CCR7 kan fremme blærekræft udvikling og metastase

Henvisning:. Mo M, Zhou M, Wang L, Qi L, Zhou K, Liu L-F, et al. (2015) CCL21 /CCR7 Forbedrer spredning, migration og invasion af menneskelig blærekræft T24 Cells. PLoS ONE 10 (3): e0119506. doi: 10,1371 /journal.pone.0119506

Academic Redaktør: Rajesh Mohanraj, Faculty of Medicine Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Forenede Arabiske Emirater

Modtaget: 14 okt 2014; Accepteret: 13 januar 2015; Udgivet: 23 marts 2015

Copyright: © 2015 Mo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Blærekræft er en af ​​de mest almindelige typer af voksen kræft. Alene i 2008 blev der 386.000 patienter diagnosticeret med blærekræft, som resulterede i 150,200 dødsfald på verdensplan er baseret på globale statistikker [1]. Metastase er ikke kun et kendetegn for blærecancer, men også årsagen til dødeligheden [1]. Imidlertid patofysiologi blærekræft metastase fortsat uklar. Kemokiner, en superfamilie af små udskilles peptider karakteriseret ved deres evne til at fremkalde leukocytmigration, sammen med deres receptorer har vist sig at være involveret i migration af celler i lymfesystemet, og dermed kan påvirke udviklingen af ​​kræft og progression [2-4]. CCL21, en vigtig kemokin af CCL familien, er en af ​​de eneste to ligander (den anden er CCL19) for CCR7. [5] CCL21 produceres af fibroblastiske retikulære celler af T-celle rige område i human og venuler med højt endotel i mus. [6] CCR7 udtrykkes ved forskellige typer af lymfocytter, herunder naive B- og T-celler, semimature og modne dendritiske celler, og T regulatoriske celler [5]. Desuden har ekspressionen af ​​CCR7 blevet rapporteret at fremme cancercelle metastase til lymfeknuder i ikke-småcellet lungecancer [7], brystcancer [8], pladecellecarcinom i hoved og hals cancer [9], colorectal cancer [10] , prostatacancer [11], esophageal pladecellekræft [12] og gastrisk cancer [13]. Derfor kan CCR7 og dens ligand (er) deltager i proliferationen, progression, og metastase af cancerceller af forskellige organsystemer oprindelser [7-13]. Vi fandt også, at CCR7 var involveret i udviklingen og progressionen af ​​blærekræft (upublicerede data).

Fysiologisk CCL21 /CCR7 spiller vigtige roller i homing af immunceller, lymfe-knude homing og positionering, immunitet og perifere tolerance, udvikling og funktion af T regulerende celler, og autoimmunitet og lymfoid neogensis [5]. Forskellige undersøgelser har bekræftet roller CCL21 /CCR7 i tumor udvikling og progression [14-17]. F.eks CCL21 /CCR7 fremmer G2 /M-fase progression og forhindrer apoptose via ERK-vejen i human ikke-småcellet lungekræft [15, 16], letter progression af pancreascancer via induktion af angiogenese og lymfangiogenese [14], regulerer matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) i human coloncancer metastase [18], og opregulerer MMP-9 i kronisk lymfatisk leukæmi celle migration og invasion [17]. Desuden blev også fundet CCL21 /CCR7 at fremme kræft celle migration til microlymphatic fartøjer i brystkræft [19], pancreas tumor [20], lunge adenocarcinom [21], og esophageal pladecellekræft [22]. Men fortsat uklart, mulige rolle CCL21 /CCR7 i blærekræft udvikling og progression. T24-celler er afledt fra overgangs- cellecarcinom i human urinblære og er blevet omfattende anvendt til studiet af blærecancer [23].

Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge virkningerne af CCL21 /CCR7 på spredning, migration og invasion af T24 celler og de mulige tilknyttede mekanismer:. ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9, og regulering af BCL-2 og BAX proteiner

Materialer og metoder

Denne undersøgelse opnåede etik godkendelse fra den etiske komité på Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan-provinsen, Kina.

Reagenser og cellelinje

CCL21 rekombinant humant protein blev købt fra Perprotech (Rocky Hill, NJ, USA) og polyklonale kanin anti-human CCR7 antistof blev købt fra Wuhan Boster biologiske Engineering Co, Ltd (Wuhan, Kina). Proteaseinhibitor phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) blev indkøbt fra Roche Diagnostics (Indianapolis, IN, USA). MTT og Dimethylsulfoxid (DMSO) blev købt fra Hufeng Chemical Co., Ltd (Shanghai, Kina). Annexin V-FITC apoptose afsløring kit blev købt fra Beyotime Bioteknologi (Shanghai, Kina).

Den menneskelige blærekræft T24 cellelinje blev købt fra Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina ). Cellerne blev dyrket ved 37 ° C, 5% CO

2, i medium DMEM (GIBCO, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin.

Celledyrkning og behandling

T24-celler blev behandlet i 48 timer før MTT-assay, migration og invasion-assays, og Western blot-analyse og 24 timer før flowcytometri undersøgelse. For hvert forsøg var der fem grupper bestående af gruppe 1 (kontrolgruppe), som blev behandlet med serumfrit DMEM-medium, gruppe 2 (antistof gruppe), som først modtagne forbehandling af 20 ng /ml polyklonalt kanin-anti-humant CCR7-antistof til 4 h derefter 50 ng /ml CCL21, gruppe 3, der modtog 50 ng /ml CCL21, Gruppe 4, som modtog 100 ng /ml CCL21, og gruppe 5, der modtog 200 ng /ml CCL21. Eksperimenterne af MTT-assayet, flowcytometri, og Western blot blev gentaget tre gange (n = 3), og cellemigration og invasion blev gentaget fire gange (n = 4).

MTT assay for proliferation af T24 celler

Proliferation af T24-celler blev vurderet ved MTT-assayet. Kort fortalt blev celler behandlet tilsvarende i hver gruppe i 48 timer. Efter behandling blev mediet fjernet, og cellerne blev inkuberet med 5 mg /ml MTT-opløsning (20 pi). Efter inkubation i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2, blev supernatanten fjernet og dannelse af formazan blev målt ved 490 nm med Gel Documentation Analyse System sæt (Liuyi Factory, Beijing, Kina).

Migration og invasion analyser

Cell migration og invasion blev analyseret ved hjælp af en transwell kammer (EMD, Millipore, USA). For invasionen assayet blev en transwell kammer anbragt i en 24-brønds plade og blev belagt med 30 pi Matrigel (Franklin Lakes, USA) og blev inkuberet i en time ved 37 ° C. I begge transwell assays celler, efter 48 timers tilsvarende behandling, blev trypsinbehandlet og podet i afdelinger med en densitet på 8 x 10

4 celler per brønd, og 500 pi serumfrit DMEM-medium blev tilsat til det nederste kammer. Migrerede celler blev fikseret med 100% Matrigel (BD, Franklin Lakes, USA) methanol i 30 min efter 24 timer, og ikke-migrerede celler blev fjernet ved vatpinde. Endelig blev cellerne på bundoverfladen af ​​membranen farvet med hematoxylin og eosin i 20 min. Optisk mikroskop (200X, Olympus, Tokyo, Japan) blev anvendt til at tælle antallet af celler i fem tilfældige synsfelter; betyde celleantallet blev beregnet for hver gruppe.

Flowcytometri for apoptose

Cell apoptose blev induceret ved Adiamycin (ADM). Hastigheden af ​​apoptose af T24-celler blev undersøgt ved flowcytometri under anvendelse annexin V-FITC /PI-farvning. Kort fortalt blev T24-celler behandlet som ovenfor i hver gruppe i 24 timer; Cellerne blev derefter inkuberet med ADM (0,1 mg /ml) i yderligere 48 timer. Derefter blev cellerne høstet, vasket og resuspenderet i PBS. Apoptotisk celledød blev målt ved dobbelt-farvning annexin V-FITC og PI hjælp af annexin V-FITC apoptosis afsløring kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina) i henhold til fabrikantens anvisninger. Flowcytometrisk analyse blev udført umiddelbart efter farvning. Dataindsamling og -analyse blev udført ved flowcytometri under anvendelse af Cell Quest-software.

Western blot-analyse

T24-celler blev anbragt i 75 ml kultur hætteglas og blev inkuberet ved 37 ° C i 24 timer og derefter behandlet tilsvarende i hver gruppe i 48 timer inkubation. Suspensioner blev vasket med kold PBS. Cellerne blev derefter inkuberet i iskold RIPA buffer [1 M Tris (pH 7,4), 5 M NaCl, 0,5 M EDTA (pH 8,0), 10% SDS, 10% DOS, og 10% NP40] med frisk protease inhibitor PMSF over is i 20 minutter. Cellerne blev skrabet, og lysatet blev opsamlet i en Eppendorff-rør og centrifugeret ved 10.000 rpm ved 4 ° C i 10 minutter, og supernatanterne blev opsamlet, opdelt i prøver og opbevaret ved -20 ° C til senere brug.

Fortyndinger af BCL-2 /BAX (12%) og MMP-2 /MMP-9 (7,5%) blev anvendt til undersøgelsen. Proteiner (20 ug) blev fyldt i 5-15% SDS-PAGE geler og overført til en nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, USA). Membranerne blev gennemvædet i blokeringsbuffer (5% skummetmælk) under stuetemperatur i 2 timer. Blottene blev vasket med PBS (med 0,1% BSA). At probe for MMP-2, MMP-9, BCL-2, Bax og β-actin, blev membranerne inkuberet 2 timer ved stuetemperatur med relevante antistoffer, efterfulgt af passende HRP konjugeret sekundære antistoffer og ECL-detektion. Gel Dokumentation Analyse System sæt (Liuyi Factory, Beijing, Kina) blev anvendt til billedoptagelse og analyse af optiske densitet (OD) værdier (490 nm).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 18,0 statistisk software. Kvantitative data blev udtrykt som middelværdien ± SD. Envejs variansanalyse med Fishers LSD test blev anvendt for gruppe sammenligninger. Betydningen niveau blev sat til p-værdi mindre end 0,05.

Resultater

Virkninger af CCL21 /CCR7 om spredning af T24 celler

Virkningerne af CCL21 /CCR7 om T24-celler som repræsenteret ved OD-værdier er vist i tabel 1. OD værdier var 0,211 ± 0,013 i kontrolgruppen, 0,216 ± 0,011 i antistoffet (p 0,05 sammenlignet med kontrol), 0,248 ± 0,006 i 50 ng /ml CCRL21 (P 0,05 sammenlignet med kontrol), 0,290 ± 0,004 for 100 ng /ml CCRL21 (P 0,01 sammenlignet med kontrol), og 0,341 ± 0,012 for 200 ng /ml CCRL21 (P 0,001 som sammenlignet med kontrol). CCL21 forfremmet T24 celledeling i koncentrationsafhængig måde med 200 ng /mL inducerede den største mængde spredning.

Virkninger af CCL21 /CCR7 om migration og invasion af T24 celler

resultaterne af CCL21 /CCR7 om migrations- og invasion af T24 celler er vist i fig. 1. Cell tæller for undersøgelser migrations- og invasion er som følgende: 45,5 ± 11,6 og 28,6 ± 15,0 til kontrolgruppen, 42,5 ± 13,6 og 30,5 ± 15,2 for antistoffet gruppen, 72,9 ± 22,4 og 55,5 ± 13,6 til CCRL21 100 ng /mL gruppe, 115,7 ± 18,8 og 102,1 ± 18,0 til CCRL21 150 ng /mL gruppe og 178,9 ± 8,4 og 143,7 ± 24,4 til CCRL21 200 ng /mL gruppe. blev fundet signifikante forskelle i celle migration mellem nogen af ​​de tre CCL21treatment grupper og kontrolgruppen i begge undersøgelserne migration og invasion (P 0,001 for alle); men ingen forskel blev fundet mellem kontrolgruppen og antistoffet gruppen i migrationen enten studier eller invasionen undersøgelse (P 0,05 for begge). Virkningen af ​​CCL21 /CCR7 behandling på T24 cellemigrering er koncentrationsafhængig med den højeste koncentration af CCL21 (200 ng /ml) producerede det største antal celler af migration /invasion. Generelt blev mindre antal T24-celler fundet i invasionen undersøgelse end den tilsvarende migration undersøgelsen.

Assayet blev udført under anvendelse af et transwell kammer belagt med 30 pi Matrigel blandingsopløsning med fem forskellige grupper bestående af vehikelkontrol, CCR7-antistof 20 ng /ml plus CCL21 50 ng /ml, CCL21 50 ng /ml, CCL21 100 ng /ml og CCL21 200 ng /ml. De nuværende data Mean ± SD fra fire uafhængige forsøg.

Virkninger af CCL21 /CCR7 på ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 i T24 celler

Western blot er præsenteret i fig. 2; kvantitative målinger af MMP-2 og MMP-9 er vist i tabel 2. Væsentlige forskelle blev fundet i ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 blandt de fem grupper (p 0,05). Sammenlignet med kontrolgruppen, blev udtrykkene for MMP-2 og MMP-9-proteiner steg betydeligt efter tre forskellige koncentrationer af CCL21 behandling (p 0,05 for alle). Der var imidlertid ingen forskel i MMP-2 eller MMP-9 mellem kontrolgruppen og antistoffet (p 0,05 for begge)

Bane 1:. T24-celler behandlet med vehikelkontrol; Bane 2: T24-celler behandlet med CCR7 antistof 20 ng /ml plus CCL21 50 ng /ml; Bane 3: T24 celler behandlet med 50 ng /ml CCL21; Bane 4: T24-celler behandlet med 100 ng /ml CCL21; og Bane 5: T24-celler behandlet med 200 ng /ml CCL21. Cellelysater blev fremstillet og kørt på 5-15% SDS-PAGE geler efterfulgt af en Western blot-analyse. Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol. De viste blots er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Virkninger af CCL21 /CCR7 om apoptose i T24 celler

Virkninger af CCL21 /CCR7 om udtrykkene for Bcl-2 og Bax ved Western blot er vist i fig. 2 og OD-værdierne er vist i fig. 3. Protein ekspression af Bcl-21 følger en stigende tendens, mens ekspressionen af ​​Bax følger en nedadgående tendens som den koncentration af CCL21 stiger. Signifikante forskelle blev fundet i udtrykkene for Bcl-2 og Bax mellem CCL21 50 ng /ml gruppen og CCL21 100 ng /ml (p 0,05 for begge) og mellem CCL21 50 ng /ml gruppen og CCL21 200 ng /ml (p lt 0,05 for begge), men ikke mellem CCL21 100 ng /ml gruppen og CCL21 200 ng /ml (p = 0,545 for Bcl-2 og p = 0,191 for Bax). Igen blev ingen forskel mellem kontrolgruppen og antistoffet gruppen til enten Bcl-2 eller Bax (p 0,05 for begge).

T24 celler blev behandlet med kontrol køretøj, CCR7 antistof 20 ng /ml plus CCL21 50 ng /ml, CCL21 50 ng /ml, CCL21 100 ng /ml, og CCL21 200 ng /ml. Værdierne (OD) nuværende gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg.

Tidlig og sen apoptose satser og samlede celle dødelighed efter behandlinger er vist i tabel 3. Satserne for tidlig apoptose, sen apoptose og samlede celle dødelighed i kontrolgruppen er 26,4 ± 5,0%, 37,5 ± 2,4%, og 63,9 ± 7,1%, henholdsvis; mens det i antistof-gruppen er 25,2 ± 3,8%, 35,6 ± 5,5%, og 60,8 ± 9,3%, hhv. Ingen forskel i apoptose satser blev fundet i hvert trin mellem de to grupper (p 0,05 for alle). Satserne for tidlig apoptose, sen apoptose og total celledød faldt efter CCL21 behandlinger på 50, 100, og 200 ng /ml. Sammenlignet med kontrolgruppen, blev signifikante fald i total celle apoptose fundet i CCL21 behandlingsgrupper (p 0,001 for alle tre behandlingsgrupper); blev imidlertid ingen signifikant forskel findes blandt de tre CCL21 behandlingsgrupper i alt celle apoptose (p 0,05 for alle). Sammenlignet med kontrolgruppen, blev signifikante fald også fundet i tidlig celle apoptose i CCL21 behandlingsgrupper (p = 0,008 for 200 ng /ml, 0,001 for 100 ng /ml, og 0,027 til 50 ng /ml); Men igen, var ingen signifikant forskel findes blandt de tre CCL21 behandlingsgrupper i tidlig apoptose (p 0,05 for alle).

Diskussion

Potentialet af kræftceller til at metastasere afhænger af dets interaktioner med homeostatiske faktorer, herunder kemokiner, som ikke blot fremmer væksten af ​​cancerceller og overlevelse, men også migration og invasion eller metastase. Tidligere undersøgelser har vist, at kemokiner er involveret i udvikling og metastaser af forskellige kræftformer [2, 4, 5]. CCR7 er involveret i cancermetastase til lymfeknuder i forskellige kræftformer [7-13]. CCL21 deltager i proliferationen af ​​CD4 T-celler, nyre mesangialceller og forskellige cancerceller [19, 24-27]. Vores undersøgelse viste for det første, at CCL21 /CCR7 kunne øge T24-celleproliferation (tabel 1), migration og invasion (fig. 1).

kemokinkoncentrationen kan være mindst delvist ansvarlig for cancerudvikling og metastase [ ,,,0],19, 26]. Som et resultat, vi anvendt tre forskellige koncentrationer af CCL21 i den foreliggende undersøgelse og fandt en koncentrationsafhængig måde i CCL21 virkninger på T24-celleproliferation, migration og invasion. CCL21 kan kraftigt forøge T24 cellemigration og invasion ved høje koncentrationer og dermed lette blærekræft metastase. Vores resultater er i overensstemmelse med disse tidligere rapporter.

Samspillet mellem kemokiner og deres receptorer tjene som fundament for tumorcellemotilitet og migration via udløse intracellulær actinpolymerisation at skabe pseudopodia [28, 29]. Muller et al fandt, at CCL21 AT100 nM inducerede en transient 1,6 gange stigning i intracellulær flamentous actin (F-actin) i humane brystcancerceller inden for 20 sekunder og observeret tydelig pseudopodia dannelse efter 20 minutters stimulering med CCL21 [19]. Resultaterne af denne undersøgelse med T24 celle migration og invasion er consistent0020with disse tidligere rapporter. Signifikant fald i T24 celletal blev observeret, når CCR7 antistof blev anvendt sammen med CCL21 og det indikerer, at virkningen af ​​CCL21 afhænger af aktiviteten af ​​CCR7. På den anden ord, kan CCL21 aktivere CCR7 først og derefter påvirke T24 cellemigration og invasion.

Molekyler såsom chemokin CCL21 er involveret i metastase af cancere, ikke blot via mediering af migration og invasion af cancerceller i væv, men også levere de nødvendige støttende mikromiljøer. In vivo er migrationen af ​​cancerceller ofte bremset med masser af modstande, såsom basalmembran og omgivende bindevæv [29, 30]. Derfor, for at efterligne virkelige in vivo tilstand, vi udnyttet transwell kammer overtrukket med matrigel som en fysisk barriere for den foreliggende undersøgelse. MMP-2 og MMP-9 er to proteiner, der er nært forbundet med blærecancer metastase [31-33]. Cancercelleinvasion kan kræve sekretionen af ​​MMP’er, såsom MMP-2 og MMP-9 at nedbryde matrigel. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at CCL21 kunne øge ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 og dermed forbedre celleinvasion (fig. 2 og tabel 2). MMP spiller en vigtig rolle i kræft celle invasion; men andre faktorer såsom interleukiner og E-cadherin kan også bidrage til tumorudvikling og invasion [34-37]. Ikke desto mindre CCL21 /CCR7 kan lette cancercelleinvasion via stigende MMP-sekretion og øge cellemotilitet.

med radiomærket teknikker, har forskere fundet kun en lille del af radioaktivt mærket cancerceller i microcirculations har potentiale til at metastasere [38] . Overlevelsen af ​​cancerceller afhænger af deres antiapoptotiske evner. Når tumorceller forlader sin oprindelige væv, vil de miste nogle, hvis ikke alle de homeostatiske faktorer, som omfatter chemokiner til vedhæftning og støtte; således at cellerne er tilbøjelige til apoptose. I den foreliggende undersøgelse blev den antiapoptotisk evne CCL21 INT24 celler undersøgt ved anvendelse af flowcytometri ved annexin V-FITC /PI-farvning via ADM induceret apoptose. Phosphatidylserin (PS) specifikt kan binde annexin-V. PI, en nuklear farvning agent, kan ikke krydse den normale cellemembran. I den tidlige fase af apoptose, kan ikke registreres PI kernefarvning som cellemembranen er intakt. Men som celle undergår apoptose i midten til slutningen af ​​faser, cell bleb’er og er ikke længere intakt; således kerne kan detekteres via PI-farvning

Resultatet af flowcytometri kan opdeles i fire kvadranter:. den nederste venstre kvadrant med normale levende celler [Annexin-V (-), PI (-)], øverste højre kvadrant [Annexin-V (+), PI (+)] med sen apoptotiske eller nekrotiske celler, nederste højre kvadrant [Annexin-V (+), PI (-)] med tidlige apoptotiske celler, og det øverste venstre kvadrant [Annexin-V (-), PI (+)] med små portioner af cellerester grund af mekaniske skader og apoptose. En analyse af apoptose afhænger hovedsagelig af tidlig apoptose (nederste højre kvadrant) og total celledød (øverste højre + nederste højre kvadranter) i den foreliggende undersøgelse. Vores resultater viste signifikant fald i apoptose og celledød med CCL21 behandling sammenlignet med kontrollen (p 0,01); blev dog ingen forskel mellem CCR7 antistof plus CCL21 behandling og kontrol fundet (p 0,05). Resultaterne indikerer, at CCR7-antistof kunne modvirke effekten af ​​CCL21 på apoptose og celledød og således bekræfte antiapoptotisk funktion af CCL21 /CCR7. Imidlertid påvistes ingen forskel af apoptose blandt de tre behandlingsgrupper (p 0,05). Den mulige årsag kunne være, at CCL21 ved 50 ng /mL nåede mætte tilstand dermed højere koncentrationer kunne ikke øge det effekt.

Bcl-2-familien viser sig at være nært beslægtet til celle apoptose [39-41]. Bcl-2 og Bax er de to vigtigste proteiner i Bcl-2-familien med bcl-2 inhiberende apoptose mens Bax fremmer apoptose. Disse to proteiner er til stede i dimerer, såsom Bcl-2 /Bcl-2 og Bax /Bax. Opregulering af Bcl-2-ekspression vil føre til yderligere Bcl-2 til at kombinere med Bax danner Bcl2 /Bax inhiberer således celleapoptose; hvorimod med nedregulering af ekspressionen af ​​Bcl-2, vil mængden af ​​den kombinerede form af Bcl2 /Bax falde, og derved fremme celleapoptose. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​bcl-2 og Bax proteiner i T24-celler i alle forsøgsgrupper, herunder kontrol. CCL21 kunne øge Bcl-2-protein-ekspression, men formindske Bax proteinekspression og virkningerne udviste en CCL21 koncentrationsafhængig måde mellem 50 ng /ml og 100 ng /ml. Interessant nok blev ingen signifikant forskel i Bcl-2 og Bax udtryk mellem CCL21 ved 100 ng /ml og 200 ng /ml CCL21 (Bcl-2: p = 0,545; Bax: p = 0,191); årsagen kan være, at CCL21 nået til en vis koncentration ikke er højere end 100 ng /mL for sine maksimale anti-apoptotiske virkninger (fig. 3). Forbehandling af CCR7-antistof kunne næsten fuldstændigt vende effekten af ​​CCL21 på udtrykkene for Bcl-2 og Bax og apoptose (fig. 3 og tabel 3). Dette bekræfter yderligere den afgørende rolle, CCR7 om virkningerne af CCL21 på T24 celler

Konklusion

CCL21 /CCR7 forfremmet T24 proliferation på en koncentrationsafhængig mønster og styrket sin migration og invasion.; disse virkninger kan være relateret til den forøgede ekspression af MMP-2 og MMP-9. CCL21 /CCR7 havde antiapoptotiske aktiviteter på T24-celler; disse funktioner kan være relateret til reguleringen af ​​bcl-2 og Bax proteiner. Vores resultater viser, at CCL21 /CCR7 kan fremme blærekræft udvikling og metastase.