PLoS ONE: Dynamiske Impacts af Hæmning af Molekylær Chaperone Hsp90 på T-Cell Proteome få konsekvenser for Anti-Cancer Therapy

Abstrakt

Den molekylære chaperone Hsp90-afhængige proteom repræsenterer et komplekst protein netværk af kritisk biologisk og medicinsk relevans. Kendt at associere med proteiner med en bred vifte af funktioner betegnes klienter, Hsp90 opretholder vigtige essentielle og onkogene signalveje. Derfor er Hsp90-inhibitorer, der testes som anticancerlægemidler. Ved hjælp af en integreret systematisk tilgang til at analysere effekterne af Hsp90 hæmning i T-celler, vi kvantificeret differentielle ændringer i Hsp90-afhængige proteom, Hsp90 interactome, og et udvalg af transkriptomet. Kinetiske adfærd i Hsp90-afhængige proteom blev vurderet ved anvendelse af en hidtil ukendt puls-chase-strategi (Fierro-Monti et al., Ledsagende artikel), detektering virkninger på både proteinstabilitet og syntese. Globale og specifikke dynamiske påvirkninger, herunder proteostatic reaktioner, skyldes direkte hæmning af Hsp90 og indirekte effekter. Som et resultat blev et fald detekteret i de fleste proteiner, der ændrede deres niveauer, herunder kendte Hsp90 klienter. Mest sandsynligt, konsekvenser af den rolle, Hsp90 i genekspression bestemmes en global reduktion af netto

de novo

proteinsyntese. Dette fald viste sig at være større i størrelsesorden end en samtidig observerede globale stigning i protein henfaldskurverne. Flere nye formodede Hsp90 klienter blev valideret, og interessant nok protein familier med kritiske funktioner, især Hsp90 familien og cofaktorer selv samt proteinkinaser, de viste stærkt forøget henfald satser på grund af Hsp90 hæmmer behandling. Bemærkelsesværdigt, en stigning i overlevelse veje, der involverer molekylære chaperoner og flere oncoproteiner, og nedsatte niveauer af visse tumor undertrykkere, har konsekvenser for anti-cancer behandling med Hsp90-hæmmere. Mangfoldigheden af ​​globale virkninger kan repræsentere et paradigme af mekanismer, der opererer at beskytte celler fra proteotoxic stress, ved at fremme pro-overlevelse og anti-proliferative funktioner. Data er tilgængelige via ProteomeXchange med identifier PXD000537

Henvisning:. Fierro-Monti I, Echeverria P, Racle J, Hernandez C, Picard D, Quadroni M (2013) Dynamiske Påvirkninger af Hæmning af Molekylær Chaperone Hsp90 på T-Cell Proteome få konsekvenser for Anti-Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (11): e80425. doi: 10,1371 /journal.pone.0080425

Redaktør: Lennart Martens, UGent /VIB, Belgien

Modtaget: April 30, 2013; Accepteret: 2 oktober 2013; Udgivet: 27 november, 2013 |

Copyright: © 2013 Fierro-Monti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud nummer 31003A_127256 fra den schweiziske National Science Foundation (www.snf.ch) samt egenfinansiering fra University of Lausanne. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Molekylære chaperoner er centrale for cellulær proteostasis. De er tæt involveret i vigtige biologiske processer såsom oversættelse, foldning, kompleks montering og demontering, translokation over membraner og protein nedbrydning [1], [2]. Den funktionelle betydning af molekylære chaperoner og deres konsekvenser i sygdomstilstande har identificeret dem som vigtige lægemiddelkandidater i kræft [3], [4]. I eukaryoter, varme shock protein 90 (Hsp90) spiller en markant rolle midt chaperoner ved at lette foldningen af ​​transkriptionsfaktorer, der regulerer aktiveringen af ​​kinaser [5], [6] og steroidhormonreceptorer [7], der bistår i dannelsen af proteinkomplekser [8], [9], og spille en rolle i protein omsætning og handel. For at opnå alle disse funktioner, Hsp90 forbinder med co-chaperoner, Hsp90 substrater, og deres interagerende partnere [2], [6], [10]. Hsp90 klienter er defineret som proteiner, som er afhængige af Hsp90. Netto mængderne af mange, men ikke alle Hsp90 klienter, fald på Hsp90 hæmning, mest sandsynligt på grund af proteasomalaktivitet nedbrydning. Klienter med en bred vifte af funktioner kræver Hsp90 at erhverve den korrekte konformation, for aktivering, og /eller for stabilitet. Overekspression af Hsp90 som en aktiveret multi-chaperone-kompleks er hyppige i maligne celler [11], [12], og mange Hsp90 klienter deltager i signalveje med onkogen relevans [13], [14]. Hæmning af Hsp90 kan blokere vigtige veje for kræft, hvilket er grunden til Hsp90 har vakt stor interesse som et mål for anti-cancer stof udvikling [12], [14], [15]. Hsp90-inhibitorer, såsom geldanamycin (GA) er kompetitive inhibitorer af ATP-binding. Disse hæmmer chaperone-funktion, og som følge heraf kan de udøve antitumoraktivitet ved at formindske niveauerne af onkogene klienter [12] – [14]. I øjeblikket er der omkring 20 inhibitorer i kliniske forsøg [13], [15].

er blevet rettet Nylige bestræbelser på at identificere og kvantificere den del af proteom som er afhængig af Hsp90, mest almindeligt ved hjælp af standard SILAC (Stable Isotope Mærkning af aminosyrerne i cellekultur stSILAC) -baseret kvantitative proteomics [11], [16] – [19]. Resultater fra disse og tidligere undersøgelser ved hjælp af forskellige proteom tilgange har forbedret vores forståelse af den rolle, Hsp90 i kræft, samt et mål af lovende lægemidler mod cancer [20]. Proteinprofilering blev anvendt sammen med proteomisk screening for at identificere bestanddele af inhibitoren bundet Hsp90 komplekser [11]. Kvantitative og kinase målrettet kemo-proteomiske analyser [17], [19] af Hsp90-afhængige proteom fremhævet Hsp90 klienter, der er direkte berørt af dens hæmning, og proteiner, der er indirekte påvirket. Hsp90-inhibering fandtes at specielt påvirke proteom-dækkende overflod (stSILAC) af proteiner, der deltager i proteinfoldning maskiner, DNA beskadigelse respons, såvel som protein-phosphorylering og signalering ved kinaser [18], [19]. For at udvide vores viden om Hsp90-afhængige proteom og effekten af ​​GA-medieret Hsp90 hæmning i T-celler, vi anvendte en roman integreret systematisk tilgang. Først, vi analyserede den dynamiske (over tid) ændringer i stSILAC mængderne under kort (op til 6 timer) og lang sigt (op til 20 timer) GA-behandling, detektere ændringer i protein grupper med forskellige adfærd. Da Hsp90 hæmning menes at påvirke store dele af proteom (1-10%) gennem ændringer i både forfald og syntese, vi anvendte en ny puls-chase SILAC (pcSILAC) strategi, forudsat indsigt i, hvordan ændringer i protein overflod genereres ( Fierro-Monti et al., ledsagende artikel). Differential og dynamiske ændringer i

de novo

syntese og forfald blev identificeret i proteiner i form af forfald hastighedskonstanter [k

d] og satser for syntese [V

s]. Vi har registreret en større global nedgang i proteinsyntese end protein stabilitet, mens mange vigtige protein familier faldt deres halveringstider på grund af Hsp90 hæmning. Modellering af vores kvantitative datasæt på en Hsp90 interaktion database [21] var med til at skelne og vurdere mere specifikke dynamiske ændringer validering potentielt nye Hsp90 klienter inden for Hsp90 interactome. Som protein overflod kan påvirkes af ændringer på transkriptionsniveauet, blev mRNA-niveauer derfor fastlagt for et udvalg af proteiner med stigende eller faldende netto stSILAC mængderne upon GA-behandling. Alt i alt, vores analyse af Hsp90 hæmning tilladt en integreret vurdering af dynamikken i T-celle Hsp90-afhængige proteom, der giver yderligere indsigt i virkningsmekanismen af ​​en inhibitor af Hsp90.

Eksperimentelle Procedurer

Celler

Jurkat T-lymfocytter klon J77.20 var en slags gave fra Dr. Oreste Acuto, University of Oxford og er blevet beskrevet tidligere [22], [23]. Celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Cell Culture Technologies, Gravesano, Schweiz) med 10% (v /v) dialyseret kalvefosterserum (FBS) (Invitrogen), mens der udføres stSILAC eller pcSILAC eksperimenter.

stSILAC eksperimenter

Isotopteknik-mærkede aminosyrer (

13C

6-L-lysin,

13C

6

15N

4-L- arginin, Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Andover, MA) blev inkluderet i den tunge-stSILAC medium “ved 100 mg /l, mens prolin blev leveret ved 180 mg /l (en 9-ganges overskud over dets normale koncentration i RPMI medium) i alle stSILAC og pcSILAC medier. Tung eller let-stSILAC mærkning (samme som heavy-stSILAC medium, men indeholdende standard lysin og arginin) blev opnået ved at dyrke cellerne i 2 uger for at tillade mindst 5 celledelinger. Før starten af ​​forsøgene, blev der udført tests for at kontrollere, at tunge mærkning var 98%, og Arg til Pro omdannelse var lavere end 5%. Heavy-stSILAC mærkede celler blev behandlet med 1 uM Geldanamycin (GA) (Cell Signalling, Danvers, MA) i dimethylsulfoxid (DMSO) til 6 eller 20 timer, og lys-stSILAC-mærkede celler blev behandlet med det samme volumen DMSO og anvendt som en kontrol. Tre uafhængige biologiske gentagelser af behandlede (tunge-mærket) eller ubehandlede (lys, kontrol) celler blev udført parallelt. En ud af de tre gentagelser blev vendt ved hjælp af lys-etiket til den behandlede, og tunge-label for de ubehandlede celler.

Celler blev lyseret i 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mM Tris /HCI pH 7,5, 100 mM dithiothreitol (DTT), efterfulgt af opvarmning ved 95 ° C. Efter centrifugering og protein koncentrationsmålinger blev ækvimolære uddrag fra lette /tung eller tunge /mellemstore mærkede celler kombineret, alkyleret med iodacetamid og fordøjet som beskrevet [24]. De opnåede peptidblandinger (200 pg total materiale) blev afsaltet på SepPak C18 patroner (Waters Corp., Milford, MA), tørret, opløst i 4M Urea med 0,1% amfolytter pH 3-10 (GE Healthcare) og fraktioneret ved off-gel fokusering som beskrevet [25]. De 24 opnåede fraktioner blev afsaltet på en microC18 plade med 96 brønde (Waters Corp., Milford, MA), tørret og resuspenderet i 0,1% myresyre, 3% (vol /vol) acetonitril i LC-MS-analyse. Prøver blev analyseret på en hybrid lineær fælde LTQ-Orbitrap Velos massespektrometer (Thermo Fisher, Bremen, Tyskland) sammenkoblet via en nanospray kilde til en Dionex RSLC 3000 nanoHPLC systemet (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Peptider blev separeret på en omvendt fase Acclaim Pepmap nanocolumn (75 um ID × 15 cm, 2,0 um, 100 pi, Dionex) med en gradient fra 5 til 85% acetonitril i 0,1% myresyre (Samlet tid: 120 min). Fuld MS undersøgelsen scanninger blev udført ved 60’000 opløsning. I data-afhængig erhvervelse styret af Xcalibur 2.0.7 software (Thermo Fisher), blev de tyve mest intense formere ladede precursor ioner detekteres i den fulde MS undersøgelsen scan udvalgt til Collision-dissociation (CID) fragmentering i LTQ lineære fælde med en isolation vindue på 3,0 m /z og derefter dynamisk udelukket fra yderligere udvælgelse under 120s. De massespektrometri proteomics data er deponeret til ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) via PRIDE partner repository [26] med datasættet identifier PXD000537

MS dataanalyse:. Identifikation og kvantificering

MS-data blev analyseret og kvantificeret ved hjælp MaxQuant-version 1.0.13.13 [27], kombineret med Mascot (Matrix Science, London, UK) version 2.3. Peaklists blev genereret med MaxQuant med standard parametre. Database søgninger blev udført på IPI menneskelige v3.68 database, filtreret for at holde kun de poster Kortlægning af et UniProtKB /Swiss-Prot identifikator (34743 poster faktisk søgt) for at maksimere sekvens og annotation kvalitet i yderligere analyse trin. Spaltning specificitet var trypsin (spaltning efter K, R, ingen spaltning i KP, RP) med to ubesvarede spaltninger. Masse tolerancer var af 7 ppm for precursoren og 0,5 Da for CID tandem massespektre. Den iodacetamid derivat af cystein blev angivet som en fast modifikation, og oxidation af methionin og protein N-terminal acetylering blev angivet som variable modifikationer. Protein identifikationer blev filtreret ved 1% falsk opdagelse sats (FDR) oprettet ved MaxQuant mod en omvendt sekvens database. Mindst én unik peptid var nødvendig for at diskriminere sekvenser, som delte peptider. Sæt af protein sekvenser, som ikke kunne blive diskrimineret baseret på identificerede peptider blev opført sammen som protein grupper og er fuldt rapporteret i tabellerne. Nærmere oplysninger om peak kvantificering og protein-forhold beregning af MaxQuant er beskrevet andetsteds [27]. Alle proteiner med kvantificerede værdier (minimum beviser tæller = 1) blev bibeholdt i starten, men filtreres i efterfølgende trin (se nedenfor)

StSILAC dataanalyse:. Kvalitet filtrering af datasættet

Alle filtreringen trin blev udført med skræddersyede Perl scripts (Perl v5.10.1, scripts til rådighed som supplerende data). Protein gruppe tabeller fra MaxQuant blev yderligere behandlet for at fjerne forureninger kommenteret i databasen og matcher at vende sekvenser. Yderligere 63 proteiner fra en intern lab liste over 65 miljøbelastende stoffer blev også fjernet. Yderligere om, blev nøgletal fjernet, når beregnet på baggrund af enkelte beviser, samt, for hvert tidspunkt, proteiner, hvis de blev kun identificeret i én gentagelse. Outlier protein grupper, defineret som proteiner med et forhold afviger mere end en faktor 1,41 blandt to gentagelser på ethvert tidspunkt, blev fjernet (28 proteiner). Outlier definition blev gjort ved at plotte data og vælge punkter med softwaren Perseus. Dette resulterede i “Kvalitet-filtrerede SILAC datasæt”, som indeholder 4050 proteiner (tabel S2), hver påvises og kvantificeres i ikke mindre end to gentagelser, i det mindste på et tidspunkt.

T-test og klyngedannelse

Fra og med den “Kvalitet-filtrerede SILAC datasæt”, blev der kun protein grupper kvantificeret i alle tre gentagelser (3333 proteiner) (tabel S3) holdes. For hvert tidspunkt, log

2 af kvantificerede nøgletal blev udsat for en to-tailed Welch t-test for én prøve (nulhypotesen H

0: μ = 0) efterfulgt af korrektion for multiple test (Benjamini-Hochberg ). Alle proteiner med på p 0,05 (efter korrektion), blev betragtet som signifikante. Protein-grupper signifikante mindst ét ​​tidspunkt blev underkastet standardsammenligningstabel Clustering at detektere adfærdsmønstre som funktion af tiden. T-test og klyngedannelse blev udført med R softwareversion 2.12.1 (2010-12-16). Efter tilsætning af en (0,0) henvisning tidspunkt blev data monteret ved at beregne Pearson korrelationskoefficient til ad hoc definerede modeller overvejer i en forenklet kvalitativ formular (0 = ingen ændring, 1 = log

2 (H /L) 0, -1 = log

2 (H /L) 0) alle mulige ændringer i de to tidspunkter. At skelne ændrer sig som funktion af tiden fire mere adfærd blev anset når et protein havde to værdier med samme fortegn. Dette resulterede i følgende 13 mønstre: [0,2,1] [0,1,2] [0,1,1] [0,1,0] [0,1, -1] [0,0,1 ] [0,0, -1] [0, -1,1] [0, -1,0] [0, -1, -1] [0, -1, -2] [0, -2, – 1] [0,0,0]. Protein grupper med t-test p 0,05 på alle tidspunkter blev tildelt klynge 13. Proteiner først opdages på et tidspunkt blev tildelt klynge 14.

Annotation analyse: fjernelse af delmængder og opdatering af protein annotation

for at forenkle post-MaxQuant sammenligninger af datasæt, blev undergruppe proteiner (identificeret med en delmængde af peptider) fjernet fra protein grupper. For at sikre at UniProt, GO, Kegg og Pfam anmærkninger var helt up-to-date, en Perl script automatiseret REST (rest) anmoder om til UniProt (https://www.uniprot.org/uniprot/) og EBI hjemmesider (https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GAnnotation) og Simple Object Access Protocol (SOAP) anmoder til Kegg (Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer) hjemmeside (https://soap.genome.jp/KEGG.wsdl), samt genindførsel af disse data til det resultat tabellen på grundlag af de forenklede protein grupper. Tildelingen af ​​hver indføring sigt til hver identifikator i et protein gruppe blev kortlagt, og er rapporteret i tabel S4. Gene Ontology (GO) sigt berigelse analyse blev udført med online-værktøjet Gorilla (https://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/) [28], ved hjælp af protein gener i hver klynge som forespørgsel, at være sammenlignet med hele sættet af identificerede proteiner

netværk-baserede data organisation og opdagelse

Integration af eksperimentelle data i protein-protein interaktion (PPI) netværk til at bygge explorable kort ved hjælp Cytoscape (http.: //www.cytoscape.org) tidligere er blevet beskrevet [29], [30]. Vi antog, at statistisk signifikans er mindre vigtigt i en netværksanalyse, som privilegier sammenhænge og mønstre, og dermed har vi brugt en mindre stringent filtreret datasæt som input. Anvendelse af den humane-centreret PPI database [21], var det muligt at udtrække en netværksforbindelse med de 1263-proteiner, overføres t-testen (p 0,05) før korrektion gentagen afprøvning ved mindst en af ​​de to tidspunkter (6h eller 20 timer). One “node” i dette netværk, svarer til et protein, og forbindelsen mellem dem kaldes “kant” og det henviser til PPI mellem disse to knudepunkter. De normaliserede H /L-forhold for stSILAC 6h og 20T datasæt blev derefter sat på dette netværk. Knuder blev farvet med en rød-til-blå gradient (zonekort termogram) i henhold til deres log

2 nøgletal /fold-ændre værdier, således at rød og blå repræsenterer berigelse og udtynding, hhv. Information til de forskellige medlemmer af netværket blev også indlæses fra forskellige databaser (UniProt, Gene ontologi, OMIM) for at få det til rådighed i grafen som metadata. Baseret på netværket organisation, stSILAC integration af data og information om proteinfunktion, den Cytoscape plugin Mcode [31] tillod påvisningen af ​​tæt forbundne grupper af knudepunkter (subgraphs), der kan betragtes som protein-komplekser og funktionelle moduler til forskellige processer af interesse. Når en funktionel modul af interesse (med lignende funktioner og lignende adfærd i stSILAC data) blev opdaget, blev denne sub-netværk undersøges yderligere for at finde andre tilsluttede moduler (til stede i hovednettet) er involveret i beslægtede biologiske processer i sundhed eller sygdom. Disse bestræbelser blev derefter suppleret med litteratur minedrift at forbedre vores forståelse af den biologiske relevans af disse tilsluttede moduler.

Tilpasning af datasæt

Protein grupper i analyserede datasæt fra pcSILAC og stSILAC blev matchet af IPI identifikatorer . Først når alle IPI identifikatorer i et protein gruppe var identiske i to datasæt, blev protein grupper og kvantitative værdier matchede og tilpasset i en fælles tabel.

Antistoffer

polyklonale anti-OGT antiserum blev en gave fra Winship Herr, CIG, University of Lausanne. Polyklonalt anti-BRAT1, anti-ITK, anti-eIF2α og anti-phospho-eIF2α antisera blev opnået fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, US). Salg

Immunopræcipitation

Celler blev lyseret i 15 minutter på is i lysepuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM KCI, 0,2 mM MgCl

2, 1 mM dithiothreitol, 2% Triton X-100). Ekstrakter blev sonikeret og klaret ved centrifugering ved 12’000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. 1 mg proteiner fra supernatanten (i 1 ml) blev inkuberet med hvert antistof natten over ved 4 ° C. Efter vask af immunpræcipitater med Tris-bufret saltvand blev proteiner elueret i SDS-PAGE-prøvebuffer uden DTT ved kogning. 50 mM DTT blev tilsat til supernatanterne og proteiner separeret ved SDS-PAGE og behandles i immunblotting. Til re-sondering blots med en anden antistof, blev de frataget i 2 timer ved 65 ° C med Tris-saltopløsning indeholdende 0,2% Tween-20.

Cell cyklus analyse

Celler ( 2 × 10

6) blev fikseret med 2% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, og blev gjort permeable efter behandling med phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,5% saponin (Sigma), 2% FCS og 2 mM EDTA, i 5 minutter ved stuetemperatur. De blev derefter inkuberet med Hoechst 33342 (20 ug /ml; Invitrogen) i 5 minutter ved stuetemperatur. Data blev erhvervet på et LSR II (Becton Dickinson) og blev analyseret med FlowJo software (TreeStar)

RNA:. NanoString NCounter kvantitativ analyse

Fra hver biologiske replikere (3 for stSILAC og 2 for pcSILAC) og tidspunkt blev to uafhængige celleprøver taget og behandles separat. RNA blev oprenset fra celleekstrakter under anvendelse mini spin-søjler (RNeasyPlus Mini Kit fra Qiagen, Hilden, Tyskland). 200 ng af total RNA blev hybridiseret med multipleksede Nanostring prober og prøver blev bearbejdet ifølge publiceret procedure [32]. Stregkoder blev talt for 1150 synsfelter per prøve. Baggrund korrektion blev udført ved at subtrahere middelværdien plus to standardafvigelser af de negative kontroller for hver prøve. Værdier 1 blev fastsat til 1. Positive kontroller blev brugt som kvalitetsvurdering. Dette blev gjort ved at kontrollere, at forholdet mellem den højeste og laveste positive kontroller gennemsnit blandt prøver var under 3. Derefter tæller for målgener blev normaliseret med det geometriske gennemsnit af de 12 reference- generne (gen liste) valgt som den mest stabile hjælp den geNorm algoritme [33]. Fold-ændringer blev beregnet som forholdene mellem det geometriske gennemsnit af tællingerne i eksperimentelle betingelser (GA) over, at kontrollen betingelse (DMSO) og blev udtrykt som log

2 værdier.

Resultater

Eksperimentel systemet

Jurkat T-lymfocyt-cellelinie er tidligere blevet brugt som model til at definere mekanismer modtagelighed af kræft til narkotika [34], og at analysere virkningen af ​​Hsp90-inhibitorer på individuelle proteiner eller cellulære funktioner [35] – [39]. Hsp90 familiemedlemmer i eukaryote celler er repræsenteret ved cytosolisk Hsp90β (konstitutiv, kodet af HSP90AB1) og Hsp90α (inducerbar, der kodes af HSP90AA1), endoplasmatisk reticulum (ER) Grp94 (endoplasmin) og mitokondrie isoform Trap1. Behandling af celler med GA er blevet vist at inhibere Hsp90β, Hsp90α, og Grp94, mens Trap1 er muligvis mindre eller ikke påvirkes af GA i intakte celler [40].

Først udførte vi en standard SILAC (stSILAC) global analyse af virkningerne af Hsp90-inhibering i løbet af behandlingen, udtrykt som ændringer i relative mængder i GA-behandlede versus kontrol DMSO-celler. Vi brugte en sub-dødbringende stof koncentration [1 pM] i mediet (under forventet intracellulært protein koncentration af Hsp90). Koncentrationen af ​​GA anvendte viste sig at reducere celletallet ved t = 20h efter behandling. Dette var mest sandsynligt ved at inducere en cellecyklusstandsning, som blev påvist ved en flowcytometri-analyse som en berigelse af celler blokeret enten i G1 eller G2 /M-fase (fig. S1A-B), og var ledsaget af en depletering af celler i S-fase. Vi vurderede induktion af apoptose ved immunoblotting, at detektere spaltning af caspase substrat poly (ADP-ribose) polymerase (PARP1), men ikke observeret nogen stærk induktion af apoptose ved assaybetingelserne (fig. S1c). Dynamikken i virkningerne af Hsp90 inhibitor på protein mængderne blev overvåget ved prøveudtagning celledelprøver og ekstraktion proteiner på tidspunkter t = 6h og t = 20h efter tilsætning af medikamentet. Prøver blev også opsamlet ved t = 5h og t = 19h til totalt mRNA oprensning til bestemmelse transkriptniveauer (figur 1A). Data fra stSILAC blev integreret med protein-protein interaktioner at opbygge et netværk og med syntese og henfald satser fra pcSILAC og mRNA data for en multi-parameter analyse af systemet (figur 1B).

A) Mærkning og prøve forberedelse ordningen. Geldanamycin eller DMSO blev tilsat ved t = 0. Total proteinekstrakter blev indsamlet ved t = 6h og 20h, mens totalt mRNA blev taget ved t = 5h og t = 19h. B) Dataanalyse og tolkning kombineret data om protein overflod ændringer (stSILAC) med protein-protein interaktioner (PPI) analyseres som et netværk, syntese og forfald værdier for proteiner i de to betingelser og transcript niveauer. Berigelse af Gene ontologi annotation udtryk blev brugt til at udtrække funktionel information om protein kategorier med fælles adfærd.

Globale funktioner i stSILAC datasæt

Analyse af MS-data med MaxQuant med standard parametre identificerede 5707 protein (tabel S1) før filtrering. Sæt af identificerede proteiner var meget ens blandt gentagelser, med 73% af den samlede protein grupper identificeret i alle tre gentagelser på hvert tidspunkt. Den Pearsons korrelation af behandlede /kontrol forhold mellem replikater på 20h var større end 0,85 (fig. S2A-B), hvilket indikerer god reproducerbarhed. Forskelle mellem GA-behandlede og kontrolceller øget med tiden, som vist ved udvidelsen af ​​fordelingen af ​​nøgletal i går fra 6 timer til 20 h (Fig. 2A). Korrelationen mellem median forhold på 6 timer og 20 timer var kun delvis (r = 0,59, Fig. S2C), hvilket antyder, at selv om i de fleste tilfælde proteinniveauer ændret i samme retning, mere komplekse mønstre af ændringer i tid kunne observeres.

A) Histogrammer af normaliseret behandlet /kontrol nøgletal for stSILAC 6h (gul), og 20h (grøn) datasæt (4050 proteiner). B) Tolv mulige mønstre af forandringer på GA behandling blev defineret (små parceller) som modeller for sammenhængen klyngedannelse. Yderligere klynger (ikke vist) indeholdt proteiner med ingen signifikante ændringer (klynge 13) og proteiner med kun data på én gang punkt (klynge 14). Antallet af gener (koder proteiner) identificeret i hver klynge er angivet i kassen.

Analyse og gruppering af stSILAC data

Til analysen af ​​hele proteom data, er stSILAC datasæt blev filtreret at der kun er proteiner påvises i alle tre gentagelser (tabel S3) og underkastes derefter en t-test til identifikation af proteiner, der varierede betydeligt mellem kontrol og inhibitor-behandlede prøver. 565 proteiner (17%) bestået t-test (p 0,05 med Benjamini-Hochberg korrektion) ved mindst en af ​​de to tidspunkter og således viste statistisk signifikante ændringer efter GA behandling. Dette datasæt blev monteret på

ad hoc Salg definerede mønstre resulterer i 12 klynger, der hver repræsenterer kvalitativt distinkte mønstre af udsving i mængderne, eller adfærd ved 6 og 20h (Fig. 2B) (fig. S3, tabel S3). Proteiner ikke signifikant berørt af GA blev udeladt fra klyngeanalyse. Fordelen ved denne fremgangsmåde i forhold ukontrollerede klyngedannelse fremgangsmåder er, at en almindelig adfærd af proteiner i hver klynge let kunne udledes. Interessant, de fire største grupper (klynger 2, 6, 7, og 11) indeholdt hver mere end 80 proteiner og sammen udgjorde 94,3% af alle klynger proteiner. Disse 4 klynger svarede henholdsvis til proteiner stigende eller faldende kontinuerligt fra 6 til 20 h (henholdsvis klynger 2 [0: 1: 2] og 11 [0: 1: -2]), eller til proteiner betydeligt varierende kun på 20h (klynge 6 [0: 0: 1] og 7 [0: 0: -1]) (. figur 2B). Alle andre klynger indeholdt mindre antal proteiner, med et maksimum på 10 for cluster 5.

Effekter af Hsp90 hæmning baseret på GO vilkår beriget med klyngerne og på yderligere eksperimenter

For at afgøre, om funktionelt eller strukturelt beslægtede proteiner blev fluktuerende på samme måde ved lægemiddelbehandling, udførte vi en anmærkning berigelse analyse på hver af de 12 klynger (tabel S4, et udvalg af klynger og nogle af deres tilknyttede GO vilkår er vist i tabel 1). Globalt mild (max. 4 gange stigning til maks. 5 gange formindskelse) virkninger på proteiner og proteinkomplekser involveret i en lang række forskellige processer og signalveje blev påvist.

Klynger med stigende niveauer upon hsp90 hæmning

ved tidlige stadier af hsp90 hæmning af GA (cluster 2), identificerede vi en bølge af proteiner involveret i besvarelsen folde stress i cytosolen, men også i ER, i aftale med tidligere resultater i myelom celler behandlet med Hsp90-inhibitorer [41], [42]. Mange proteiner placeret i vesikel rum blev også forøget. Den samme eller beslægtede GO vilkår blev også beriget med senere stigende proteiner i klynge 6, sammen med cytoskeletale komponenter, membranbundne små GTPaser (Rab proteiner), Golgi proteiner og proteasomet. Samlet set en opregulering af foldeapparat i cytosolen og ER, sammen med en generel stress- og pro-overlevelse reaktion opstår fra sættet af øgede proteiner. I betragtning af den observerede ER stressreaktion, vurderet, phosphorylering af α-underenheden af ​​det eukaryote initieringsfaktor 2 (eIF2α), enten ved proteinkinaser, der lokaliserer til cytoplasmaet (PKR), eller i ER-membranen (PERK), da det har blevet etableret som en stressrespons mekanisme til at inhibere proteinsyntese [43]. Vi bekræftede en mild stigning i phosphorylering af eIF2α kort efter GA-behandling (fig. S4) efter aftale med tidligere undersøgelser i HeLa-celler [44].

Klynger med faldende niveauer på Hsp90 hæmning

Vi observerede et kraftigt fald (indtil 6h) af ATP-bindende proteiner og protein kinaser (klynge 11). Blandt disse proteinkinaser, bemærkede vi en kontinuerlig og progressiv reduktion af medlemmer af T-celle-receptor-signalvejen. Vi observerede et betydeligt antal proteiner forbundet med kinetochore og kondenserede kromosom funktioner. De fleste af disse proteiner var nukleare pore proteiner impliceret i nucleo-cytoplasmatisk transport. Sene effekter (klynge 7) afspejlede berigelse af flere GO vilkår knyttet til ribosom biogenese (rRNA behandling, nucleolar proteiner). Nogle faktorer er essentielle for DNA-replikation (forlængelse trin) var også faldet på sene tidspunkter. Ribosom biogenese, en af ​​de dyreste cellulære processer i form af energi, er kendt for at være korreleret til cellecyklusprogression via MDM2-p53 pathway [45]. Samlet set en nedregulering af proteinsyntese maskiner sammen med forandringer i forbindelse med cellecyklusstop synes at dukke op fra det sæt af faldende proteiner.

Netværk analyse

Drug behandling førte til en reduceret overflod af både kendte og mange potentielt nye Hsp90 klienter. Vi ræsonnerede, at udtynding kan ikke tages af sig selv således, at et protein er et Hsp90-klient, og vi udforsket andre strategier til at dissekere begivenhederne. Vi modelleret dermed kvantificeret stSILAC datasæt på den tidligere beregnede Hsp90-protein-protein-interaktion (PPI) netværk Hsp90Int [21]. Flere meget forbundne subgraphs og funktionelle moduler blev udvundet fra Hsp90Int database til at vise dynamiske ændringer baseret på stSILAC datasættet.

Komponenter i Hsp90 molekylære chaperone maskine

De molekylære chaperoner Hsp70 og Hsp40 blev påvist