PLoS ONE: Synergistisk Re-Aktivering af epigenetisk tavshed gener ved Kombinatorisk Hæmning af DNMTs og LSD1 i Cancer Cells

Abstrakt

Epigenetisk gendæmpning, medieret af afvigende promotor DNA hypermethylering og repressive histon modifikationer, er kendetegnende for kræft. Selvom arvelige, den dynamiske natur og potentielle reversibilitet gennem farmakologiske interventioner foretage sådanne aberrationer attraktive mål. Da kræft indeholde flere epigenetiske abnormiteter, kunne kombinere behandlinger, der er målrettet forskellige defekter potentielt øge deres individuelle effektiviteter. 5-Aza-2′-deoxycytidin (5-aza-CdR), FDA-godkendte lægemiddel til behandling af myelodysplastisk syndrom, kan inhibere DNA-methyltransferaser (DNMTs) efter inkorporering i DNA’et i delende celler, hvilket resulterer i global demethylering. For nylig den første histon demethylase, lysin specifik demethylase 1 (LSD1), der demethylerer både histon og ikke-histon substrater, er blevet et nyt mål for epigenetisk terapi. Brug, clorgylin, en LSD1 inhibitor (LSD1i) til behandling af cancer cellelinjer, viser vi, at clorgylin anvender to virkningsmekanismer afhængigt af celletype: det kan enten fremkalde global DNA demethylering eller hæmme LSD1-drevet H3K4me2 og H3K4me1 demethylering at etablere en aktiv kromatin konfiguration. Vi undersøger også den terapeutiske effekt af at kombinere 5-Aza-CdR med clorgylin og bestemme, at denne kombinatorisk behandling har synergistiske virkninger på reaktivering afvigende tavshed gener ved at berige H3K4me2 og H3K4me1. Mange af de reaktiveret gener er kategoriseret som kræft testis-antigener eller tilhører interferon-signalvejen, hvilket tyder på mulige konsekvenser for immunterapi. Sammen vores resultater viser, at kombinatorisk behandling bestående af en DNMT inhibitor (DNMTi) og en LSD1i har forbedret terapeutiske værdier og kunne forbedre effektiviteten af ​​epigenetisk terapi

Henvisning:. Han H, Yang X, Pandiyan K, Liang G (2013) Synergistisk Re-Aktivering af epigenetisk tavshed gener ved Kombinatorisk Hæmning af DNMTs og LSD1 i kræftceller. PLoS ONE 8 (9): e75136. doi: 10,1371 /journal.pone.0075136

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: May 7, 2013; Accepteret: August 10, 2013; Udgivet: 6. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Institutes Sundhedsstyrelsen (NIH) [RO1CA124518 og CA138794] for GL. XY og KP understøttes generøst af Stand Up til kræft [2000901485]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gene lyddæmpning medieret af afvigende promotor DNA hypermethyleringsassocierede og histon modifikationer er et af kendetegnene for kræft. Selv om sådanne ændringer er arvelige, deres dynamiske natur og reversibilitet gennem farmakologiske interventioner gør dem attraktive terapeutiske mål [1]. Gennem de seneste årtier har forskellige lægemidler, der er målrettet forskellige typer af epigenetiske ændringer er udviklet med det mål at reaktivere afvigende tavshed gener, herunder DNMTi og histondeacetylaser hæmmere (HDACi) [2], [3]. Mange af dem har vist lovende terapeutisk værdi ved behandling af forskellige maligniteter, både som enkelte midler og i kombination med andre terapier og flere er blevet godkendt af FDA.

N-terminalerne af histoner gennemgå en række post- translationelle modifikationer for at generere transkriptionelt tolerante eller refraktære kromatin konformationer afhængigt af typen og placeringen af ​​modifikationen [4], [5]. For eksempel er transkriptionelt aktive initiativtagere præget af berigelser af dimethylering og trimethylation af H3K4 og acetylering af H3 [6]. Transkriptionelt inaktive initiativtagere er præget af de berigelser af begge trimethylation af H3K9 eller trimethylation af H3K27 [5]. Den afbalancerede aktivitet af histon-modificerende enzymer, der tilføjer eller fjerner specifikke modifikationer er kritisk for normal celle fysiologi [2]. Kræftceller ofte mangler denne balance og udviser en samlet reduktion i acetylering og promotor-specifik reduktion i di- og trimethylation af H3K4, hvilket resulterer i afvigende gendæmpning [1], [7]. Histon lysin methylering blev betragtet som en relativt permanent ændring indtil opdagelsen af ​​den første histon demethylase lysin specifik demetylase 1 (LSD1 /KDM1 /BHC10 /AOF2) [8], [9]. Efter at have været investeret mange anstrengelser i at udvikle inhibitorer mod histon demethylases.

LSD1 demethylerer mono- og dimethylering af H3K4 gennem en flavinadenindinukleotid (FAD) afhængig mekanisme [9], og dermed har potentiale til at undertrykke genekspression [10]. Forud for opdagelsen af ​​dets demethylere evne blev LSD1 kendt for at associere med en række co-repressor komplekser, herunder Corest [11], CtBP [12] og en undergruppe af HDAC-komplekser [13]. Under demethylering proces en imin mellemprodukt dannet som hydrolyseres yderligere til at generere et ikke-methyleret lysin og formaldehyd som et biprodukt [9], [14], [15]. LSD1 kan også demethylate en række ikke-histon substrater, såsom DNMT1, hvilket efter sigende gør det mere stabilt [16], [17], hvilket potentielt bidrager til øget global DNA-methylering. Tilsammen LSD1 har to potentielle virkningsmekanismer at undertrykke genekspression: det kan demethylate mono- og dimethyleret H3K4 samt stabilisere DNMT1

Overekspression af LSD1 er blevet rapporteret i en række maligniteter, herunder akut myeloid. leukæmi (AML) [18], neuroblastom [19], brystcancer [20], blærecarcinom, småcellet lungecancer og colorektale carcinomer [21], hvilket antyder, at LSD1 inhibitorer kan have vigtige terapeutiske fordele i talrige tumorer. LSD1 er blevet identificeret til at blokere differentiering i MLL [22] og regulere epitel-mesenchymale overgange (EMT) for at aktivere motilitet gener [23]. LSD1 hæmmere kan fremme differentiering af høj kvalitet prostatacancerceller [24], undertrykke blærekræft celledeling [25], og genaktivere afvigende tavshed gener [26]. De katalytiske domæner af LSD1 og monoaminoxidaser deler strukturel homologi og gøre brug af den samme katalytiske mekanisme [9]. Derfor er mange monoaminooxidasehæmmere er også LSDi. En sådan monoaminoxidaseinhibitor, clorgylin, kan også hæmme lysin specifikke demethylases [19], [20], [27], [28].

På grund af tilstedeværelsen af ​​multiple epigenetiske abnormiteter i cancerceller, undersøgte vi den kombinerede terapeutiske værdi af 5-Aza-CdR og clorgylin at hæmme DNMTs og LSD1, i blærekræft (T24), leukæmi (HL60) og kolorektal cancer (HCT116) cellelinjer. Vi observerer, at clorgylin anvender to forskellige virkningsmekanismer i de tre cellelinier vi studerede. I T24 og HL60-celler, clorgylin alene frembringer minimale virkninger på reaktivering af aberrerende tavshed gener i sammenligning med den ubehandlede kontrol. Men kombinatorisk behandling inducerer synergistiske virkninger på reaktivering af epigenetisk tavshed gener. Desuden kun de kombinatoriske behandlingsresultater i berigelser af H3K4me2, H3K4me1 og H3K9 /14 acetylering på initiativtagerne til up-regulerede gener. På den anden side, i HCT116-celler, clorgylin alene inducerer global DNA demethylering og gen reaktivering. Men det kombinatoriske behandling ikke fremkalder synergistiske virkninger på gen-reaktivering. Trods viser forskellige mekanismer for aktioner i cellelinjer, kollektivt, vores undersøgelse viser, at kombinatorisk behandling har forbedret terapeutiske værdier, og der indføres en ny tilgang i kræftbehandlingen.

Materialer og metoder

Drug behandling og dyrkningsbetingelser

T24, HCT116 og HL60 celler, købt fra ATCC, blev udpladet ved 2 × 10

5 celler /100 mm skål, 3 × 10

5 celler /100 mm skål og 5 × 10

5/25 cm

2 kolbe, hhv. De blev behandlet næste dag med 1 pM, 0,3 pM eller 0,1 uM 5-aza-CdR (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), henholdsvis i 24 timer. Efter fjernelse af 5-aza-CdR blev celler behandlet med 10 pM clorgylin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) hverdagen for 21 dage. Multiple doser af clorgylin blev testet: 1 pM, 10 pM og 100 pM. Clorgylin forringet cellevækst på en dosisafhængig måde, og den optimale dosis for clorgylin (10 uM) blev bestemt ved at overvåge dosisresponskurven.

kolonidannelse

Celler blev podet i plader med 6 brønde ved 1.000 celler pr brønd med eller med indicerede behandling. Dyrkningsmediet blev skiftet hver 3. dag. Efter 10 dages inkubation ved 37 ° C blev cellerne vasket med PBS, fikseret med methanol og farvet med 0,5% krystalviolet. Kolonier indeholdende mere end 50 celler blev talt under et mikroskop.

chromatin immunoprecipitation (chip) Assay

chip assays blev udført som beskrevet tidligere under anvendelse af 4 × 10

6 celler pr IP [6 ]. Ti ug af følgende antistoffer blev anvendt: H3 og H3K4me2antibodies blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, MA). Acetyleret H3, og IgG-antistoffer blev anskaffet fra Millipore (Billerica, MA). H3K4me3 og H3K4me1 antistoffer blev indkøbt fra Active Motif (Carlsbad, CA). PCR primere er tilgængelige efter anmodning.

Real-time RT-PCR

Total RNA blev isoleret fra celler med Trizol reagens (Invitrogen) ved de angivne tidspunkter. Et ug RNA revers transkriberet under anvendelse og M-MLV (Invitrogen) vilkårlige hexamerer (Invitrogen). PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af KAPA SYBR® FAST Universal 2X qPCR Master Mix og på Bio-Rad CFX

© 96 Real time PCR påvisning systerm. Sekvenserne af gen-specifikke primere er tilgængelige efter anmodning. Med hvert sæt af PCR-primere, blev titreringer af kendte mængder DNA indbefattet som en standard til kvantificering.

Infinium

Infinium DNA-methylering assay blev udført ved USC epigenome center ifølge producentens specifikationer (Illumina, San Diego, CA). Den Illumina Infinium DNA methylering assay (Infinium HumanMethylation450 BeadChip) undersøger DNA methylering status 485.000 CpG sites, som dækker 99% af RefSeq Gener og intergeniske regioner udvalgt af methylering eksperter. Downstream forarbejdning og beta værdi beregninger blev udført som beskrevet tidligere [29].

Expression Microarray

Expression analyse blev udført ved Sanford-Burnham Medical Institution (La Jolla, CA) ved hjælp af Illumina genom- brede udtryk BeadChip (HumanHT-12_V4_0_R1) (Illumina). Genekspression data blev behandlet ved hjælp af lumi pakke i R. Data blev log2 transformeret og normaliseret ved hjælp Robust Spline Normalisering (RSN) som gennemført i lumi pakken. Sammenligninger mellem kontrol og behandlede prøver for alle tre cellelinier blev udført ved hjælp af R-pakken limma. Gener (transkripter) med en p-værdi under 0,01 og en fold-change større end 2 i forhold til kontrollen blev betragtet som signifikante. Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI) blev anvendt til analyse og visualisering af offentligt tilgængelige genekspression data. Downstream netværk og ontologi analyse blev udført ved hjælp MetaCore fra GeneGo Inc.

Statistisk Analyse

Alle statistiske tests blev udført ved hjælp af R-software (R-version 2.15.2, R Development Core Team, 2012). ‘Lumi-pakke blev anvendt til at normalisere og proces genekspression data. Annotation og visualisering af DNA methylering sonder blev gjort ved hjælp pakker tilgængelige gennem BioConductor ( “TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene”, “rtracklayer”, “Gviz” og “IlluminaHumanMethylation450kprobe”). Følgende KRAN pakker blev anvendt til at generere parceller: “ggplot2”, “gplots” og “Venn-diagram”. Gene ontologi analyser blev udført ved hjælp af DAVID Funktionel Annotation Tool (Huang da et al. 2009). Chip blev analyseret ved hjælp af Student t test på GraphPad Prism-version 5 (GraphPad Software).

GEO tiltrædelse Antal

Alle genom-dækkende data udnyttes i undersøgelsen er blevet deponeret i GEO under tiltrædelse nummer GSE41754.

resultater

kombinatorisk behandling af en DNMTi og en LSDi resulterer i mere hæmning af cellevækst og kolonidannelse end nogen af ​​de enkelte agenter

On analyse af gen ekspressionsdata tilgængelige via Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI), observerede vi, at LSD1 er overudtrykt i blærecancer, leukæmi og colon-adenokarcinomer i forhold til deres normale modstykker (figur 1A), hvilket antyder, at overekspression af LSD1 kan spille en rolle i tumorigenese. Desuden er det blevet fastslået, at aberrerende DNA-methylering er involveret i initiering samt udviklingen af ​​forskellige maligniteter, herunder i de tre cancere ovennævnte [30]. Derfor er en blærecancer-cellelinie, T-24, en leukæmicellelinje, HL60 og en coloncancer cellelinie blev HCT116 valgt at undersøge virkningerne af inhibering LSD1 samt at vurdere den terapeutiske effektivitet af et kombinatorisk behandling bestående af en LSD1i og en DNMTi.

a. Ekspressionsniveauerne af LSD1 i blære kræft, T-celle akut lymfoblastisk leukæmi, colonadenom og deres normale modstykker blev opnået fra ONCOMINE. Numrene i parentes angiver antallet af prøver, der anvendes til at generere kassediagrammer. B-D. Befolkning fordobling tider for kontrol (sort), clorgylin behandlet (gul), 5-Aza-CdR behandlet (rød) og kombinatorisk behandling behandlet (grøn) i T24, HL60 og HCT116 celler. De tilsvarende antal timer er angivet i nedenstående tabel hver graf. E. Kvantificering af antal kolonier produceret af kolonidannelse analyser i T24 og HCT116 celler efter indikeret behandlinger

Alle cellelinjer blev behandlet som følger:. Clorgylin alene, 5-Aza-CdR alene, og kombinatorisk behandling af clorgylin og 5-aza-CdR. Celler blev behandlet med 5-aza-CdR i 24 timer før ændre mediet. I modsætning hertil celler modtog en frisk dosis af clorgylin hverdagen for 21 dage. I alle tre celletyper undersøgte både 5-Aza-CdR og clorgylin behandling alene forlænget cellepopulation fordoblingstid mellem 3 og 10 timer, med den kombinatoriske behandlingen yderligere forøgelse fordoblingstid, op til 16 timer (figur 1B, C, D).

for at vurdere den terapeutiske effektivitet af clorgylin, 5-aza-CdR og kombinatorisk behandling på overlevelsen og proliferationen af ​​celler, udførte vi kolonidannelse assays af de to adhærente cellelinjer, T-24 og HCT116-celler. Clorgylin viste en moderat effekt til undertrykkelse evne T24 og HCT116-celler til at danne kolonier. 5-Aza-CdR væsentlige undertrykt kolonidannelse og det kombinatoriske behandlingen yderligere reduceret antallet af kolonier (fig S1 og 1E). Vore data viser, at både clorgylin og 5-aza-CdR inhiberer cellevækst og undertrykke kolonidannelse. Derudover kombinatorisk behandlingen yderligere forsinker population fordoblingstid og reducerer evnen af ​​cellerne til at proliferere.

Kombinatorisk behandling af en DNMTi og en LSDi opregulerer flere gener end nogen af ​​de enkelte midler i T24 og HL60-celler signifikant

for at undersøge globale ændringer i genekspression profil efter clorgylin, 5-Aza-CdR og kombinatorisk behandling, vi gennemførte genom-dækkende udtryk undersøgelser på dag 18 efter behandling (D18), ved hjælp af Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip i T24 og HL60-celler. Det er blevet veldokumenteret, at 5-aza-CdR inducerer øjeblikkelig demethylering og efterfølgende gen reaktivering [31], [32]. Det er også blevet fastslået, at methylering rebounds og gener bliver igen bragt til tavshed ved narkotika tilbagetrækning [33], da DNMT niveauer få genopfyldes. Derfor valgte vi et relativt sent tidspunkt at vurdere, om den kombinatoriske behandling kan fremkalde vedvarende gen reaktivering. Genekspression ændringer i alle transkripter efter angivne behandlinger er vist som vulkan plots (figur 2A). På dag 18, i T24 celler, clorgylin alene gjorde ikke signifikant opregulere eventuelle udskrifter, mens 5-Aza-CdR behandling forøget ekspression af 30 udskrifter. Bemærkelsesværdigt, det kombinatoriske behandling inducerede væsentligt mere transkripter (108 transkripter), som markant opreguleret (Figur 2A). For at undersøge overlapningen mellem opregulerede transkripter på de forskellige behandlinger vi genereret en Venn-diagram, som viser, at alle transkripter induceret af 5-aza-CdR også blev induceret ved den kombinatoriske behandling (figur 2B). Derefter foretages en sammenligning den globale genekspression induktion forskel mellem 5-Aza-CdR og den kombinatoriske behandling, vi plottet den observerede log2 gange ændring for alle de interrogerede transkripter på platformen. Størstedelen af ​​disse transkripter er synergistisk opreguleret ved kombinatorisk behandling (figur S2), hvilket viser, at clorgylin supplerer evnen af ​​5-aza-CdR at genaktivere gener i T24-celler. Ud over at supplere 5-Aza-CdR kan kombinatorisk behandling også genaktivere gener, der har undladt at være opreguleret med 5-Aza-CdR alene. Otteoghalvfjerds gener blev kun opreguleret ved kombinatorisk behandling (figur 2B), hvilket antyder, at den kombinatoriske behandling kan anvende en anden virkningsmekanisme end behandlingen af ​​5-aza-CdR alene. Interessant er de gener, som er synergistisk opreguleret ved kombinatorisk behandling beriget for specifikke funktioner, såsom immunrespons, cytoskelet remodeling og cellecyklusregulering (figur 2C, fig S3). En detaljeret analyse blev udført på gener, der er en del af IFN-alfa og IFN-beta signalvej. Analysen afslørede, at den kombinatoriske behandling stimulerer ekspressionen af ​​flere gener, der er essentielle for effektivt immunrespons til virusinfektioner (figur 2C).

. A. genekspression log2 forskel er afbildet på x-aksen, og den -log10 (p-værdi) er afbildet på y-aksen. Prober, der identificeres som signifikant forskellig mellem to grupper er farvet røde. B. Venn skærer i antallet af gener, der opreguleres ved den angivne behandling. C. Network berigelse diagram indeholder gener, som er synergistisk opreguleret ved kombinatorisk behandling. Synergistisk opreguleres gener er markeret med røde bjælker. De andre symboler, der anvendes er som set på Metacore hjemmeside.

Vi har også udført genom-dækkende udtryk studier i HL60 celler. Genekspression ændringer i alle transkripter efter den angivne behandling er vist som vulkan plots. Brug tidligere etablerede cutoffs, vi identificerede differentielt udtrykte udskrifter, der er fremhævet med rødt (figur 3A). Vi fandt, at mens alle tre behandlinger inducerer genet opregulering den kombinatoriske behandling inducerer ekspressionen af ​​flere transkripter, der udviser en lignende ekspressionsprofil til T24-celler. Clorgylin, 5-aza-CdR og den kombinatoriske behandling opreguleres 43, 200 og 346 transkripter, henholdsvis (figur 3B). Selv om der var en betydelig overlapning mellem 5-Aza-CdR og kombinatorisk behandling, den kombinatoriske behandling var mere effektiv til gen-induktion ved, at den opreguleres 180 transkripter, der ikke opreguleres af 5-aza-CdR (figur 3B) .

A. Genekspression log2 forskel er afbildet på x-aksen, og den -log10 (p-værdi) er afbildet på y-aksen. Prober, der identificeres som signifikant forskellig mellem to grupper er farvet røde. B. Venn skærer af antallet af gener, der er opreguleret efter den angivne behandling. C. Expression status opnået fra ONCOMINE af 20 gener, hvis udtryk blev synergistisk reaktiveret i HL60 celler, i mononukleære perifert blod og kronisk lymfatisk leukæmi.

For at vurdere den funktionelle betydning af generne synergistisk opreguleret af den kombinatoriske behandling vi undersøgte den Oncomine ™ databasen (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). På at studere genekspression for kronisk lymfatisk leukæmi prøver sammenlignet med normale perifere blod-mononukleære prøver, bemærkede vi, at talrige gener i disse kategorier blev nedreguleret i leukæmier sammenlignet med de normale celler (figur 3C), hvilket antyder, at disse gener er potentielle tumorsuppressorer i leukæmi. Kollektivt, vores data viser, at ændringer i genekspression er forbundet med ændringer i cellevækst hæmning og at kombinatorisk behandling har mere en mere dybtgående indvirkning på at hæmme celle vækst sammenlignet med behandling med enkelte midler, resultater, der er i overensstemmelse med vores globale udtryk undersøgelser . Desuden kombinatorisk behandling fremkalder en synergistisk virkning i op-regulering af genekspression i både T24 og HL60-celler. Desuden er mange af disse gener har potentielle konsekvenser for immunterapi, såsom cancer testis antigen gener og gener i interferon-vejen, hvilket antyder muligheden for at kombinere epigenetisk terapi og immunterapi til behandling af maligniteter. Især vores data indikerer også, at ændringer i genekspression er i overensstemmelse med cellevækstinhiberingen; de kombinatoriske behandlinger opregulerer væsentligt flere gener, der er potentielt tumor undertrykkende, hvilket resulterer i den største indvirkning på cellevækst blandt alle behandlingerne.

Gene opregulering induceret af kombinatorisk behandling skyldes ændret histon modifikationer, der ikke demethylering i T24 celler

for at undersøge om DNA demethylering var ansvarlig for opregulering af flere gener upon kombinatorisk behandling, vi gennemførte globale DNA methylering studier med Illumina Infinium HumanMethylation450 platform, der omfatter mere end 450.000 CpG sites , der dækker promotorområder, 5’UTR, 3’UTR, gen krop og første exon. Da både T24 og HL60 viste synergistisk gen opregulering på grund af kombinationsbehandling, valgte vi T24 som repræsentant cellelinie at studere årsagen til gen-induktion. DNA methylering for hver forespurgt CpG site er rapporteret som en beta-værdi, der spænder fra 0 (ikke methyleret) til 1 (fuldt methylerede). En tæthed plot, som omfatter alle proberne på arrayet, blev genereret for at vise de globale DNA methylering profiler for hver behandling (figur 4A). Proberne kan groft opdeles i to grupper i kontrollen baseret på bimodal fordeling af beta værdier: en hypomethylated gruppe (beta værdi 0,2) og en hypermethyleret gruppe (beta værdi 0,8) (figur 4A). De kontrol- og clorgylin behandlede celler udviste meget lignende methylering profiler. Efter, 5-aza-CdR behandling blev spids, der repræsenterer hypermethyleret prober forskudt mod lavere beta værdier, der illustrerer, at 5-aza-CdR inducerer global demethylering. T24 celler udsat for 5-aza-CdR behandling viste en meget lignende methylering profil som de celler udsat for kombinatorisk behandling (figur 4A). Selv DNMT1 er blevet rapporteret som en potentiel substrat for LSD1 [16], vores data viser, at clorgylin ikke inducerer demethylering i T24-celler.

A. Massefylde grunde til hver behandling på tværs af alle 450.000 CpG sites. X-aksen repræsenterer beta værdier fra 0 (ikke methyleret) til 1 (stærkt methylerede). B. Heatmap af CpG prober tilhører gener, der er synergistisk opreguleret ved kombinatorisk behandling. Niveauet af methylering af DNA for hver probe i hver prøve er repræsenteret ved hjælp af farveskalaen vist i forklaringen. C. chip resultater af histon ændringer efter normalisering til input. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse fra 3 uafhængige forsøg.

Næste, vi undersøgte methylering niveauer af gener, der var betydeligt opreguleret på kombinatorisk behandling. En Heatmap blev genereret for at illustrere methylering niveauer af prober, som er placeret inden for de promotorområder (prober beliggende inden 1500 bps transkriptionsstartstedet) af dem signifikant ændrede gener efter hver behandling (figur 4B). Styringen og clorgylin behandlede celler viste meget lignende methylering profiler med få sonder, som enten vundet eller tabt methylering efter clorgylin behandling (delta betaværdi 0,2). Men kombinatorisk behandling fremprovokere yderligere demethylering af disse sonder, som blev hypermethyleret oprindeligt. Sammenligning 5-Aza-CdR behandling med kombinatorisk behandling, 0 prober havde en delta beta værdi større end 0,2, hvilket bekræfter, at der ikke var nogen væsentlig ændring i methylering grund af den kombinatoriske behandling (figur 4B). I en saglig måde valgte vi to gener, IFI27 og PAGE2B, som synergistisk blev reaktiveres ved kombinatorisk behandling, for at studere ændringer i DNA-methylering efter hver behandling (figur S4 A og B). Begge gener har flere sonder på Infinium platformen. Initiativtageren til IFI27 er umethyleret; på den anden side, promotoren for PAGE2B er methyleret. Da dataene viser, udviste disse to gener lignende DNA methylering niveauer efter enten kombinatorisk behandling eller 5-aza-CdR behandling. Tilsammen vore data viser, at gener, der er betydeligt opreguleret ved kombinatorisk behandling mangler den tilsvarende demethylering ændringer i forhold til celler behandlet med 5-aza-CdR alene, tyder det aktiverer gener er uafhængige af DNA-methylering ændringer i T24-celler.

at udforske andre potentielle mekanisme for yderligere gen reaktivering induceret af den kombinatoriske behandling, besluttede vi at undersøge ændringer i histon mærker, der kunne være forbundet med de observerede udtryk ændringer. Vi først tilfældigt udvalgt 8 gener, uanset methylering status i kontrol, (CT45A4, GTSF1, TKTL1, PAGE2B, IFI6, IFI27, IFIT1 og HIST1H2BK) fra puljen af ​​92 gener, som var betydeligt opreguleret på kombinatorisk behandling, og . valideret vores udtryk array-resultater ved RT-PCR på angivne dage (figur S5)

efter bekræftelse af array-resultater, valgte vi 6 ud af de 8 gener og undersøgte ændringer i specifikke histon mærker: H3K4me1, H3K4me2 og H3K4me3 ved at udføre chip assays på initiativtagerne til disse gener. Både H3K4me1 og H3K4me2 er blevet rapporteret som direkte substrater af LSD1 [9]. Blandt de gener, vi valgte, initiativtagere til tre af disse gener, CT45A4, GTSF1 og PAGE2B, er denatureret i T-24 celler og resten er umethyleret. Sammenlignet med kontrolgruppen, blev der ikke berigelser af H3K4me1 og H3K4me2, LSD1 mål, observeret ved initiativtagerne til alle valgte gener upon clorgylin behandling (figur 4C). Både 5-Aza-CdR behandling og kombinatorisk behandling inducerede berigelser af H3K4me1 og H3K4me2 på initiativtagerne til methylerede gener (figur 4C). De berigelse niveauer var væsentligt højere på kombinatorisk behandling, hvilket tyder clorgylin kosttilskud 5-Aza-CdR at etablere en aktiv kromatin struktur på methylerede gener.

Ved initiativtagerne til methylerede gener, hverken 5-Aza-CdR heller clorgylin alene øget berigelsen af ​​aktive kromatin mærker; Men det kombinatoriske behandling yderligere inducerede de berigelser af H3K4me2 og H3K4me1. Vi undersøgte også niveauet af H3K4me3, hvilket ikke er et direkte mål for LSD1, men er en aktiv histon mærke, beriget ved initiativtagerne til methylerede gener. Clorgylin induceret mest dramatiske berigelse af H3K4me3 for IFI27 sammenlignet med kontrollen. 5-Aza-CdR behandling og kombinatorisk behandling viste sammenlignelige berigelser af H3K4me3 for alle udvalgte gener, styrke, at gen-reaktivering blev induceret af berigelser af H3K4me2 og H3K4me1, de to direkte mål for LSD1. Derudover undersøgte vi berigelser af H3K9 /14 acetylering, fordi de tæt korrelerer med genekspression [34]. Vi observerede, clorgylin behandling ikke ændrede graden af ​​acetylering som det ses i kontrolgruppen, i overensstemmelse med observerede ekspressionsniveauer. 5-Aza-CdR inducerede berigelse af acetylering og kombinatorisk behandling yderligere øget berigelse niveau ved initiativtagerne til methylerede gener samt IFI27 (figur 4C). Tilsammen vores resultater viser, at i T-24-celler, det kombinatoriske behandling inducerer yderligere gen reaktivering ikke gennem DNA demethylering. Af interesse er det berigelser af H3K4me2 og H3K4me1 er de vigtigste aktiverende ændringer, som resulterer i gen reaktivering.

clorgylin inducerer DNA demethylering i HCT116 celler

Vi har udført genom-dækkende udtryk analyse på dag 20 indlæg behandling i HCT116-celler for at undersøge ændringerne i den globale genekspression efter hver behandling. Interessant, alle tre behandlinger: clorgylin, 5-Aza-CdR og kombinatorisk behandling, inducerede betydelig gen opregulering samt nedregulering (figur S6). Der er en betydelig overlapning (348 transkripter) blandt alle tre behandlinger (figur 5A), hvilket antyder, at alle behandlinger kan anvende lignende virkningsmekanismer i reaktivering lyddæmpede gener. Dette kan også forklare den manglende synergistisk respons i HCT116 celler.

A. Venn skærer af de gener, der er opreguleret efter den angivne behandling. B. Density grunde til hver behandling på tværs af alle 450.000 CpG sites. X-aksen repræsenterer beta værdier fra 0 (ikke methyleret) til 1 (stærkt methylerede). C. Venn skærer af proberne, der er demethylerede på det angivne behandling. Overlappet af to cirkler repræsenterer de fælles sonder, der er demethylerede af begge behandlinger.

Selvom clorgylin ikke inducerer DNA demethylering i T24 celler, vi undersøgt, om den betydelige gen opregulering observeret ved alle tre behandlinger i HCT116 blev tilskrevet DNA demethylering ved at udføre global DNA-methylering analyse på dag 20 efter behandling. Densiteten plot viser, at både 5-Aza-CdR behandling og den kombinatoriske behandling inducerede betydelig demethylering, udviser lignende globale methylering profiler (figur 5B). I modsætning til T24-celler, clorgylin inducerede moderat DNA demethylering i HCT116. På dag 20 blev 21,049 sonder demethyleres ved clorgylin behandling, mens 59,834 sonder forblev demethyleres efter 5-Aza-CdR behandling. Der er en betydelig overlapning mellem demethylerede prober mellem disse to behandlinger (figur 5C). Clorgylin demethylerer primært ikke-CpG øområder (Figur S7A). Da HCT116 celler har højere methylering niveauer i ikke-CpG øområder end i T24-celler (Figur S7B), kan dette give en forklaring på dens effektivitet i HCT116. Det er blevet vist, at DNMT1 er et substrat for LSD1 og LSD1 inhibitorer har potentiale til at destabilisere DNMT1, hvilket resulterer i global demethylering [16]. Vores laboratorium har tidligere vist, at DNMT1 er mere fremtrædende i at opretholde ikke-CpG ø methylering [35], styrker vores hypotese, at clorgylin inducerer demethylering ved at destabilisere DNMT1.