PLoS ONE: Målrettet Methylering af Epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) Arrangøren til tavshed udtryk i kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

epitelcelle adhæsionsmolekyle (EpCAM) er overudtrykt i mange kræftformer, herunder kræft i æggestokkene og EpCAM overekspression korrelerer med nedsat overlevelse af patienter. Det var formålet med denne undersøgelse at opnå en målrettet methylering af EpCAM-promotoren og stilhed EpCAM-genekspression ved anvendelse af en manipuleret zinkfinger-protein, som specifikt binder EpCAM-promotoren fusioneret til det katalytiske domæne af Dnmt3a DNA methyltransferase. Vi viser, at forbigående transfektion af denne konstruktion forøgede methylering af EpCAM-promotoren i SKOV3-celler fra 4-8% i ubehandlede celler til 30%. blev observeret op til 48% methylering i stabile cellelinjer, der udtrykker det kimære methyltransferase. Kontrolforsøg bekræftede, at methyleringen var afhængig fusion af zinkfinger og methyltransferase domæner og specifikt for målregionen. De stabile cellelinier med methyleret EpCAM-promotoren viste en reduktion 60-80% af EpCAM ekspression som bestemt ved mRNA og proteinniveauet og udviste en signifikant reduceret celleproliferation. Vores data indikerer, at målrettet methylering af EpCAM-promotoren kan være en tilgang i terapien af ​​EpCAM overudtrykker cancere

Henvisning:. Nunna S, Reinhardt R, Ragozin S, Jeltsch A (2014) Målrettet Methylering af epithelcellen vedhæftning Molecule (EpCAM) Arrangøren til tavshed udtryk i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 9 (1): e87703. doi: 10,1371 /journal.pone.0087703

Redaktør: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Frankrig

Modtaget: 29 oktober, 2013; Accepteret: 1. januar 2014 Udgivet: 29 Jan 2014

Copyright: © 2014 Nunna et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af Sander Foundation og DAAD (Deutscher Akademischer Austauschdienst). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft forekommer i det peritoneale hulrum i æggestokkene er den syvende mest almindelige cancer hos kvinder og næsthyppigste dødsårsag på verdensplan blandt gynækologisk cancer [1] – [3]. I de fleste kvinder, kræft i æggestokkene er vanskelig at behandle med en fem års overlevelse på omkring 20% ​​i kræft diagnosticeret i avanceret stadie [4] – [6]. Platinbaserede analoger, såsom cisplatin eller carboplatin er de store standard kemoterapi midler til behandling af ovariecancer i indledende stadier [7]. Imidlertid er deres anvendelse hindres af erhvervet eller indre resistens af cancercellerne for lægemidlet [8]. På trods af en øget forståelse i ætiologien af ​​kræft i æggestokkene har der været en lille ændring i overlevelsen af ​​patienter over de seneste 30 år, fordi der i de tidlige stadier af kræft i æggestokkene er asymptomatisk, og der er ingen effektiv tumor specifikke og følsomme markører til at overvåge epitelial ovariecancer [9]. Således er der et umiddelbart behov for nye strategier for behandling af ovariecancer

æggestokkene exhibit kræftceller overekspression af epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM) sammenlignet med normale ovariale celler [10] -. [14 ]. EpCAM (NCBI reference Sequence NM_002354.2, også kaldet GA733, KSA, 17-1A antigen, eller CD326) er en 40 kDa epitel celleoverfladeglykoprotein der medierer Ca

2+ uafhængig homofil celle-celle-adhæsion [10], [ ,,,0],15], [16]. Epitelet i raske individer udtrykker EpCAM, med undtagelse af skæl-epitel og af specifikke epitelceller af voksent hepatocytter og keratinocytter [17]. EpCAM er overudtrykt i varierende omfang i mange menneskelige karcinomer [18], [19], kræft-initierende celler, og stamfader og normale stamceller [20]. Det er for nylig blevet vist, at EpCAM opregulerer

c-myc, cyclin A

og

E

og den påvirker cellecyklussen og forbedrer celleproliferation [21]. Desuden er det involveret i den nukleare Wnt-signalvejen, der også fremmer celledeling og tumorigenese [20].

Selvom den præcise rolle EpCAM er undvigende i ovariecancer progression, EpCAM overekspression korrelerer signifikant med nedsat overlevelse hos patienter på trin III /IV af sygdommen og overekspression af EpCAM i bryst- og galdeblæren kræft har en stærk korrelation med dårlig prognose [22] – [24]. Anti-EpCAM-antistoffer blev anvendt til at identificere cirkulerende tumorceller i blodet hos cancerpatienter, og at tilvejebringe prognostisk information, der tillader behandling af patienter [25]. Derudover direkte associering EpCAM med progressionen af ​​ovariecancer foreslået, at det kan tjene som potentielt terapeutisk mål for behandling af ovariecancer og forskellige fremgangsmåder er blevet etableret for at målrette EpCAM [26], [27]. EpCAM antistoffer såsom MT201 effektivt eliminere kræftceller fra patienter med ovariecancer [28]. For eksempel har Catumaxomab blevet godkendt til behandling af maligne ascites og det har været anvendt til epitelial ovarie- og ikke-ovariecancere [29] – [31]. Selv anti-EpCAM monoklonale antistoffer beskytter mod kræft [32], [33], antistoffet cytotoksicitet afhængig af CH2 domæne af antistof, der varierer betydeligt fra parti til parti under antistofproduktion [34]. Desuden anti-EpCAM-antistoffer, ikke nogen klinisk beskyttelse mod kolorektal og prostatakræft grund af den store størrelse af antistof, som begrænser distribution og levering [34] – [36]. Derfor kræves bedre og mere generelle strategier for målrettet undertrykkelse af EpCAM.

Som en alternativ fremgangsmåde, den onkogene funktion af EpCAM blev inhiberet ved at reducere ekspression af dets gen. En metode til at opnå dette var anvendelsen af ​​antisense RNA, der har ført til et kraftigt fald i celleproliferation og metabolisme hos humane carcinomceller [21]. I en lignende fremgangsmåde, siRNA-medieret inaktivering af EpCAM-ekspression stærkt reduceret cellemigration og invasive potentiale brystcancerceller [23]. EpCAM-ekspression blev også bragt til tavshed af ekspressionen af ​​et Zink-finger protein, som binder til EpCAM-promotoren [37] og en fusion af en EpCAM målretning zinkfingerdomænet med en repressor domæne [38]. Men alle disse tilgange ikke føre til en vedvarende nedregulering som stimulerede forsøg på at forbinde gen undertrykkelse med epigenetiske mærker, ligesom DNA methylering. DNA-methylering spiller en vigtig rolle i epigenetisk regulering af genekspression [39] – [42]. I pattedyr DNA methylering sker ved C5 positionen af ​​cytosin hovedsagelig i forbindelse med CpG-dinukleotider. De CpG rige regioner betegnes CpG øer og forekommer ofte i gen-promotorregioner [43]. EpCAM-promotoren indeholder et CpG island, methylering af hvilket omvendt korrelerer med EpCAM-ekspression, tumorinvasion og progression i forskellige cancertyper [13], [44]. Til støtte for dette koncept, kan det vises, at DNA-methylering indført på promotoren i en ikke-orienteret måde førte til nedregulering af EpCAM-genet [45].

Det er klart, at reducere bivirkninger af en epigenetisk gendæmpning behandling, en målrettet levering af silencing epigenetiske mærker som DNA-methylering er nødvendig. Dette kræver kobling af en katalytisk del, som leverer silencing signal med en målsøgende del, der sikrer den specifikke binding af den katalytiske enhed til en defineret genomisk mål [46] – [48] (fig. 1). Forskellige molekylære enheder er i anvendelse til specifik målretning funktion sekvensen, herunder fusion af DNA methyltransferase del til en triplex dannelse oligonukleotid [49], fusion til manipuleret zinkfingerproteiner (se nedenfor), TAL effektorer [50], [51] og i fremtidige potentielt manipuleret CRISPR /CAS-systemer [52]. Da zink fingre var de første protein modulerne, som blev mulig udformning af sekvens DNA binding [53] – [58], indledende målrettet methylering undersøgelser påberåbes kunstige zink-finger proteiner målrette enhed [59]. Efter denne fremgangsmåde, undertrykkelsen af ​​virale gener [60], nedregulering af maspin og SOX2 [61] og VEGFA genet undertrykkelse [62] er blevet opnået i humane cellelinjer. I dette arbejde, fusioneret vi et zinkfinger-protein, som målretter EpCAM-promotoren [37] til DNA methyltransferase 3a (Dnmt3a) katalytiske domæne for at methylere EpCAM-promotoren, som efterfølgende skal føre til EpCAM silencing. Vi brugte SKOV3 celler, som er afledt af humane kvindelige adenocarcinomceller og er blevet brugt som model for ovariecancer [45]. Vi viser, at den målrettede methylering af promotoren fører til reduktion af EpCAM-genekspression, yderligere underbygger den antagelse, at målrettet DNA-methylering er en generel tilgang til gene silencing. Desuden viser vi, at lukke munden af ​​EpCAM fører til en reduktion i spredning af SKOV3 celler.

Den blå bar repræsenterer ZF bindingssted, ubesatte slikkepinde repræsenterer umethylerede CpG’er og fyldte slikkepinde repræsenterer methylerede CpG’er.

Materialer og metoder

Celledyrkning, transfektion og berigelse af transfektion

SKOV3 humane ovariecancerceller blev indhentet fra ATCC (American Type Culture Collection). Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (PAA) suppleret med 10% kalvefosterserum og 2 mM L-glutamin (PAA). For transient transfektion, 3,5 × 10

5-celler blev udsået i T25-flasker og cellerne blev transficeret efter én dag med 12 pi FuGENE HD transfektionsreagens (Promega) og 6 ug af tre plasmid-DNA’er, som udtrykker én de forskellige zinkfinger fusionskonstruktioner der anvendes i dette arbejde, LNGFR markering, og GFP i et forhold på 10:2.5:1 som tidligere beskrevet [62]. De transficerede celler blev beriget ved hjælp MACSelect ™ LNGFR-system (Miltenyi Biotec) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet, når celler co-transficeret med LNGFR-molekylet, udtrykkes på celleoverfladen. Efter fire dage blev cellerne inkuberet med magnetiske perler konjugeret med anti-LNGFR-antistof i 15 minutter ved 4 ° C. Transficerede celler blev ledt gennem en MACS separation kolonne anbringes i en MACS separator og vasket to gange med PBE puffer (phosphatbuffer saltvand med 0,5% bovint serumalbumin og 5 mM EDTA) for at vaske væk utransficerede celler. Efter vask kun transficerede celler bundet af magnetiske perler tilbageholdt i søjlen, og de berigede celler blev elueret i PBE og anvendes til yderligere methylering analyse.

I stabil cellelinie generation, 2 × 10

5-celler blev podet per brønd i plader med 6 brønde, og cellerne blev transficeret med 6 pi FuGENE HD transfektionsreagens og 2 ug EpCAM ZF-Dnmt3aCD plasmid-DNA. Efter 48 timer blev cellerne dyrket i medium indeholdende 800 ng /ml G418 i seks uger. Monoklonale kolonier blev opnået og yderligere udvidet i nærvær af G418 indeholdende medium og to af de stabile cellelinier blev anvendt til yderligere eksperimenter.

Methyleringsanalyse af EpCAM-promotoren og ikke-målgen methylering

Genomisk DNA blev isoleret under anvendelse QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN), og omdannelse med bisulfit blev udført som tidligere [63] beskrevne. Kort fortalt 400 ng genomisk DNA blev fordøjet med Sphl restriktionsenzym natten over ved 37 ° C. Bisulfit omdannelse blev udført i nærvær af NaOH og natriumbisulfit anvendelse af følgende betingelser: 15 min inkubering ved 99 ° C, 30 min ved 50 ° C, 5 min ved 99 ° C, 1,5 timer ved 50 ° C, 5 min ved 99 ° C og 1,5 timer ved 50 ° C. Under inkubationen med bisulfit, er ikke-methyleret cytosin omdannes til uracil, men methylerede cytosiner er uændrede. Bagefter blev DNA’et opkoncentreret og oprenset ved anvendelse af Amicon ultra centrifugal filtre (Millipore) og PCR amplificeret under anvendelse bisulfit specifikke primere. Den uracil er amplificeret som thymin i denne reaktion. PCR-produktet blev subklonet ved anvendelse StrataClone PCR-kloning kit og individuelle kloner blev sekventeret. For at analysere sin status methylering, blev 220 bp af EpCAM promotor indeholder 16 CpG’er forstærkes ved hjælp af specifikke primere (for: 5′-CTT TTT AAG GTT TTA GAG TAG-3 ‘og Rev: 5’-AAA AAA TAA ATA AAC TCC CCT CCC 3 ‘). For ikke-target-gen methylering, blev analyseret fire amplikoner fra gener (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 og WRB henholdsvis); sekvenserne af alle amplikoner og en liste over anvendte primere er angivet i supplerende oplysninger S1. Data blev analyseret ved anvendelse af BISMA software [64].

RT qPCR analyse

Totalt RNA blev isoleret fra stabile cellelinjer og styre SKOV3 celler under anvendelse Purelink ™ RNA mini kit (Ambion). I alt 1,0 ug RNA blev omdannet til komplementær DNA ved hjælp af M-MuLV revers transkriptase (NEB) med oligo dT-primere. Q-RT-PCR blev udført ved anvendelse CFXConnect ™ Real-Time-systemet (Bio-Rad). EpCAM transcript ekspressionsniveauer blev kvantificeret under anvendelse SsoFast ™ EvaGreen® Supermix (Bio-Rad) og EpCAM specifikke primere (for: 5′-GAACAATGATGGGCTTTATG-3 ‘, rev: 5′-TGAGAATTCAGGTGCTTTTT-3′) ved anvendelse af beta actin som intern kontrol (for : 5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3 ‘, rev: 5′-ACCGGAGTCCATCACGATG-3’). Den relative mængde af transkript blev målt ved tærskelcyklus amplifikation (C

T), som er omvendt korreleret med mængden af ​​RNA til stede. Den gange ændring i EpCAM RNA blev beregnet under anvendelse af ΔΔCt metode. Ct-værdier bestemmes som middelværdien af ​​triplikater og eksperimentet blev udført i to tekniske gentagelser.

Western blotting

Cellelysater blev fremstillet ud fra stabile cellelinjer og styre SKOV3 celler under anvendelse RIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40 og 1 mM PMSF), og det totale proteinindhold blev kvantificeret ved BCA ™ protein assay kit (Thermo Scientific). Fire ug totalt protein blev opløst på 10% SDS-PAGE geler og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret natten ved inkubering med 4% bovint serumalbumin i phosphatbufret saltopløsning, og probet med kanin-anti-humant EpCAM IgG i 1:4000 fortynding (Abcam Ab71916), efterfulgt af peberrodsperoxidase konjugeret gede anti-kanin IgG i 1: 4000 fortynding (GE Healthcare). Blottene blev fremkaldt under anvendelse forøget kemiluminescens western blotting opløsning (Thermo Scientific), og billeder blev indfanget på røntgenfilm, scannes og kvantificeres ved anvendelse Billede J software.

celleproliferationsassay (CCK8 assay)

celleproliferation assays blev udført under anvendelse Celletælling kit-8 (CCK8) assay (Dojindo) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev SKOV3 celler eller stabile cellelinjer CD1 og CD2 podet i en tæthed på 1,5 x 10

4-celler i 200 pi medium i en 96-brønds celledyrkningsplade og dyrket i tre dage i DMEM med 10% FCS ved 37 ° C med 5% CO

2. Efter tre dage blev cellerne behandlet med 10 pi af CCK8 reagens per brønd og inkuberet i 4 timer i CO

2 incubator. Derefter blev 100 pi supernatant fra hver brønd overført til friske plader med 96 brønde, og absorbansen blev målt ved 450 nm ved anvendelse af spektrofotometer. Den CCK8 reagens indeholder WST-8 [2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt] opløst i vand og celle dyrkningsmedium, som kan trænge ind i cellen, hvor det reduceres ved dehydrogenaser, hvilket gav en orange farvet formazanprodukt. Mængden af ​​formazan dannet, er direkte proportional med antallet af levende celler.

Celletælling assay

SKOV3 celler eller stabile cellelinjer CD1 og CD2 blev podet i en seks cellekulturplade pladen i et densitet på 2 × 10

5cells per brønd og dyrket i fire dage i DMEM med 10% FCS ved 37 ° C med 5% CO

2. Efter fire dage blev cellerne vasket to gange med phosphatbuffer saltvand, trypsiniseret og høstes separat og en enkelt cellesuspension blev fremstillet. Celler blev fortyndet i Trypan blåsplint 0,4% (Gibco) i et forhold på 1:01 og det samlede antal af levedygtige celler i hver brønd blev talt under anvendelse af et Neubauer-tællekammer eller hæmocytometer. Levende celler kan skelnes fra døde celler, fordi døde celler tage op farvestoffet og pletten mørkeblå mens membranerne i levende celler er intakte og forhindre optagelse af farvestoffet.

Resultater

Målrettet DNA-methylering af EpCAM-promotoren i ovariecancer SKOV3-celler

det var formålet med denne undersøgelse at opnå en målrettet methylering af EpCAM-promotoren og stilhed EpCAM genekspression. Vi har anvendt et konstrueret zinkfinger-protein, som specifikt binder EpCAM-promotoren [37] og sammensmeltet med det katalytiske domæne af Dnmt3a DNA methyltransferase (Dnmt3aCD), som tidligere er blevet anvendt til at indføre målrettet DNA-methylering [60], [62 ]. For målspecifikke methylering, SKOV3 cancerceller, som har et ikke-methyleret EpCAM promotor og aktiv EpCAM-ekspression [11], blev transient transficeret med det kimære zinkfinger – Dnmt3a katalytiske domæne (ZF-Dnmt3aCD) konstruktioner. Efter fire dage blev de transficerede celler beriget med MACS udvælgelse og status for methylering af EpCAM-promotoren (fig. 2) blev analyseret ved omdannelse med bisulfit og sekventering af individuelle kloner. I to uafhængige forsøg, viste utransficerede SKOV3-celler et basalt niveau på 4-8% DNA-methylering. Imidlertid methyleringen steg til 29% (± 4%) i ZF-Dnmt3aCD transficerede celler i to uafhængige forsøg (fig. 3). Vigtigere er det, vores data viser, at methylering niveauer af kunne 80% opnås på nogle specifikke CpG steder i målområdet, ligesom de steder 14-16. EpCAM-promotoren viste basalt methylering i SKOV3-celler, der blev transficeret med kontrol vektorer, enten vektorkontrol alene, zinkfinger uden Dnmt3aCD eller Dnmt3aCD uden zinkfinger henholdsvis (fig. 3). Konstateringen af, at ekspression af målrettede Dnmt3a katalytiske domæne ikke førte til en stor stigning i DNA-methylering på EpCAM promotoren er i overensstemmelse med tidligere observationer på et andet mål locus [62].

Genet vises med blåt , dets CpG ø i grønt og amplikonet i sort. Amplikonet sekvens er angivet nedenfor, er den ZF bindingsstedet sekvens skraveret med rødt. Dette billede blev genereret ved hjælp af University of California Santa Cruz genom browser (https://genome.ucsc.edu/) [66]

Følgende forkortelser blev anvendt:. SKOV3 celler, ubehandlede celler; ZF, SKOV3-celler transficeret med zinkfinger-konstruktion, ZF-Dnmt3aCD, celler transficeret med zinkfinger Dnmt3a katalytiske domæne konstrukt; VEC CNTRL, celler transficeret med tom vektor; Dnmt3aCD, celler transficeret med en Dnmt3aCD konstruere uden zinkfinger; CD1, stabil cellelinie, der udtrykker ZF-Dnmt3aCD 1; CD2, stabil cellelinje, der udtrykker ZF-Dnmt3aCD 2. De vandrette rækker angiver CpG’er i den analyserede amplikon og lodrette rækker repræsenterer individuelle kloner, der blev sekventeret. De blå og røde farver repræsenterer umethyleret CpG og methylerede CpG henholdsvis for hvide farvede steder, methylering tilstand er ukendt på grund af tekniske årsager.

Da vi forestået methylering eksperimenter i forbigående transficerede celler efter MACS udvælgelse, en baggrund af utransficerede celler var stadig til stede, som vi anslår at være i området på 20% baseret på mikroskopisk undersøgelse. At opnå en homogen celleprøve, hvor alle celler blev behandlet med det kimære methyltransferase, genereret vi to uafhængige stabile cellelinjer (kaldet CD1 og CD2), der udtrykker zinkfinger Dnmt3aCD kimære methyltransferase. Genomisk DNA blev isoleret fra begge cellelinier og status for methylering af EpCAM-promotoren blev analyseret som beskrevet ovenfor. Vores resultater viser, at methylering niveauer af EpCAM promotor blev øget til 46% i den stabile cellelinje CD1 og 48% i CD2 (fig. 3).

Off-target gen methylering

Til analysere methylering på andre loci, der kan ledsage vores målrettet methylering, vi undersøgte status methylering af fire yderligere uden for målgruppen gener (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 og WRB) som beskrevet i de materialer og metoder. De SKOV3 celler viste en methylering af 1%, 1%, 17%, og 2% i de fire amplikoner (fig. 4 og [62]). SKOV3-celler transient transficeret med ZF-Dnmt3aCD viste methylering niveauer på 1%, 1%, 22% og 1%, som er næsten identiske med resultaterne opnået med de ubehandlede SKOV3-celler (fig. 4). De stabile cellelinjer CD1 og CD2 viste også mønstre for methylering meget ligner kontrolcellerne (Fig. 4). Selv om disse resultater ikke udelukker yderligere methylering forekommer ved nogle enkelte loci, de viser, at methylering af EpCAM-promotoren ikke er ledsaget af en massiv, uspecifik og hele genomet DNA-methylering, hvilket indikerer, at målretning var mindst delvis succes.

Methylering af fire ikke-målgener blev analyseret (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 og WRB). Præsentationen af ​​data er som i fig. 3. Sekvenserne af de analyserede her regioner er givet i de supplerende oplysninger S1.

EpCAM udtryk undertrykkes ved målrettet DNA methylering af EpCAM gen promotor

For at hvis promoter methylering bestemme ført til transkriptionel silencing af EpCAM-genekspression blev totalt RNA isoleret fra SKOV3-celler og de stabile cellelinier CD1 og CD2 og EpCAM mRNA niveauer blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Som vist i fig. 5A og B, observerede vi en reduktion af EpCAM ekspression af 80% i stabil cellelinie CD1 og 60% i stabil cellelinie CD2. Den EpCAM undertrykkelse ved målrettet DNA methylering blev bekræftet på proteinniveau ved western blotting, hvor vi observerede en tilsvarende reduktion af EpCAM udtryk i de stabile cellelinier sammenlignet med SKOV3 celler (fig. 5C og D).

A ) Eksempel på RT qPCR analyse af EpCAM (venstre) og beta actin (højre) mRNA beløb i SKOV3 celler og i to uafhængige cellelinjer, som stabilt udtrykker ZF-Dnmt3a konstruktion (CD1 og CD2). B) Kvantificering af RT qPCR analyse af EpCAM udtryk som vist i panel A. Vi udførte to uafhængige RNA præparater hver analyseret i tre tekniske gentagelser. Billedet viser gennemsnittet af både resultater, fejlsøjlerne indikerer standardfejlen. C) Eksempel på Western blot analyse af EpCAM-ekspression i SKOV3-celler og CD1 og CD2 stabil cellelinjer (øvre panel). Beta actin blev anvendt som ladningskontrol (nederste panel). EpCAM og beta actin bands er markeret med pile. D) Kvantificering af Western Blot-analyse af EpCAM udtryk som vist i panel C. Figuren viser et gennemsnit af to uafhængige forsøg, fejlen søjler indikerer standardafvigelsen af ​​data.

Nedsat EpCAM udtryk associerer med en reduktion af celleproliferation

for at undersøge om den reducerede EpCAM ekspression påvirkede proliferationen af ​​SKOV3-celler, blev et tilsvarende antal ubehandlede celler samt CD1 og CD2-celler podet og en celleproliferationsassay blev udført efter tre dage. Til dette blev cellerne behandlet med CCK8 reagens opløst i cellekulturmedium og inkuberet i 4 timer i inkubatoren. I dette tidsrum kan reagenset diffundere ind i cellerne, hvor det er reduceret med cellulære dehydrogenaser for at frembringe et orange farvet formazanprodukt, som kan påvises ved absorption ved 450 nm. Eftersom mængden af ​​formazan er direkte proportional med antallet af levende celler, dette assay tillader let vurdering af antallet af levende celler i prøven. Som vist i fig. 6A, der var 60% reduktion af levende celler i CD1 og 40% i CD2 sammenlignet med SKOV3 cellekontrol, som er i en meget god korrelation med reduktionen af ​​EpCAM ekspression i begge cellelinier. For at bekræfte disse resultater, vi også gennemført levedygtig celletælling under anvendelse af Trypan blå, som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Til dette et lige antal celler blev podet og inkuberet i fire dage. Bagefter blev det totale antal levedygtige celler talt. Som vist i fig. 6B, resultaterne bekræftede den celleproliferationsassay, fordi der var en nedsættelse ca. 50% i antallet af levende celler i CD1 og ca. 40% i CD2. Vi konkluderer, at nedregulering af EpCAM fører til en betydelig reduktion af den proliferative potentiale SKOV3 celle in vitro.

A) Resultater af CCK8 celleproliferationsassays udført med CD1 og CD2 stabil cellelinjer og SKOV3 celler som reference. Resultaterne afbildede er fra fire uafhængige eksperimenter og fejlen søjler indikerer standardfejlen af ​​middelværdien. B) levedygtig celletælling udført ved trypanblåt-farvning. Grafen repræsenterer data fra to uafhængige forsøg, og fejlen søjler indikerer standardfejlen af ​​middelværdien.

Diskussion

Målrettet DNA methylering ved fusion af en DNA-methyltransferase domæne (her katalytiske domæne af Dnmt3a) og en måludpegningsindretningen (her en konstrueret zinkfinger) er en attraktiv tilgang til gendæmpning [46] – [48]. Der er nogle tidligere eksempler på vellykket anvendelse af denne metode til at opnå gene silencing i humane celler [60] – [62]. Her udviser vi det målrettede methylering og gendæmpning af EpCAM-genet, som er et lovende mål i tumorterapi. Vi viser fravær af off-target effekter på alle loci der er blevet inspiceret for dette, hvilket indikerer, at målrette var (i det mindste delvist) succes. Vores resultater støtter den opfattelse, at målrettede methylering og gendæmpning er en universel tilgang med bred anvendelighed. Endvidere viser vi, at undertrykkelse af EpCAM ekspression fører til en reduktion i det proliferative potentiale SKOV3-celler.

I en nylig papir, der Gun et al. (2013) rapporterede en ca. fordoblet silencing af EpCAM efter ekspressionen af ​​et zinkfinger fusioneret repressor Kruppel-associerede kasse (SKD) domæne, som blev leveret med en retroviral vektor [38]. Interessant, førte dette til en reduktion af spredning i brystkræftceller, men ikke i SKOV3 celler. Ligeledes har en RNAi baseret nedregulering af EpCAM i SKOV3-celler ikke reducere celleproliferation i dette arbejde. Disse resultater med SKOV3 celler ikke er i overensstemmelse med vores data, men der er stor forskel på opsætningen af ​​begge studier. Først og fremmest, van der Gun et al. (2013) anvendte en undertrykkelse domæne, mens vi ansat en DNA methylering medieret epigenetisk inaktivering mekanisme. Faktisk EpCAM silencing var lidt stærkere i vores setup, 60-80% i vores cellelinjer vs. 50% observeret af van der Gun et al. (2013), som kan påvirke resultaterne. Sekund, van der Gun et al. (2013) leverede deres lyddæmpning konstruere med retrovirusvektorer og bruge tomme vektorer som kontrol. Celleproliferation blev analyseret 4-6 dage efter transduktion. Vores undersøgelse anvendte cellelinjer, som udtrykker lyddæmpende konstruktioner i en stabil måde efter en indledende transient transfektion. Begge metoder har deres fordele og ulemper. I den retrovirale levering, er cellulære virkninger måles få dage efter en retroviral infektion, som kan kraftigt påvirke de cellulære responser. Desuden i stabil cellelinie, blev EpCAM tavshed i flere uger før celleproliferation analyse blev udført, som gav cellen lang tid at reagere på reduktionen af ​​EpCAM-ekspression. I modsætning hertil spredning test af van der Gun et al. (2013) blev udført 4 til 6 dage efter transduktion og i RNAi eksperimenter udlæsningen blev udført 1 til 3 dage efter siRNA transfektion, som kan være en anden grund til forskellen i resultater. Det er en ulempe ved den stabile cellelinje tilgang, at individuelle cellelinier undersøgt som kan have akkumuleret særlige tilpasninger. Den omstændighed, at begge stabile linjer studerede her viste lignende effekter, delvist løser dette problem. Vi konkluderer, at der vil være behov yderligere forsøg for at løse dette problem, men reduktionen af ​​proliferative potentiale af en tumor cellelinje observeret her efter epigenetisk inaktivering af EpCAM promotoren er en lovende resultat for potentielle terapeutiske anvendelser af EpCAM lyddæmpning i behandlingen af ​​kræft med EpCAM overekspression

Ved fremtidige anvendelser af målrettede gen lyddæmpning, skal effektiviteten af ​​leveringen af ​​den målrettede methyltransferase konstruktion forbedres.; flere virale levering strategier er tilgængelige til dette formål og er i øjeblikket udviklet i vores laboratorium og på andre steder [61], [65]. Efter udviklingen af ​​flere aktive og funktionelle kimære methyltransferaser, der arbejder i cellekulturmodeller, vil det være en næste kritiske milepæl af det fremtidige arbejde med at integrere disse enzymer til et effektivt leveringssystem, der tillader infektion af tumorceller i dyret (eller human) krop, og fører til hæmning af tumor udvikling i dyremodeller. Hvis dette kan opnås, vil det også være nødvendigt at bestemme den potentielle off-target methylering på en genom plan, og på en kvantitativ måde i forskellige væv. Til dette, flere genom DNA methylering analysemetoder er tilgængelige. Afhængigt af mængden af ​​off-target methylering og det berørte loci, vil en risikoanalyse det muligt at vurdere, om disse reagenser kan være sikkert for kliniske forsøg. Hvis det er nødvendigt specificiteten af ​​målretning kunne forbedres ved hjælp af Zink fingre moduler, som genkender længere sekvenser end bruges her. Til sidst andre målretningsmetoder, ligesom TAL effektor domæner eller CRISPR afledte metoder kan anvendes, selv om dem specificitet er et problem så godt.

Støtte Information

Information S1.

Primer og amplicon sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0087703.s001

(PDF)

Tak

Vi takker bidrag og hjælp af Dr. . Kirsten Liebert og Dr. Yingying Zhang i den tidlige fase af projektet.