PLoS ONE: Generering af en Predictive Melphalan Resistance Index ved Drug Screen of B-celle kræft cellelinjer

Abstrakt

Baggrund

Seneste rapporter viser, at

in vitro

narkotika skærme kombineret med genekspressionsprofiler (GEP) af kræft cellelinjer kan generere informative signaturer forudsige den kliniske resultatet af kemoterapi. I myelomatose (MM) er der indført en række nye lægemidler og nu udfordrer konventionel behandling inklusive højdosis melphalan. Følgelig kan dannelsen af ​​prædiktive signaturer til reaktion på melphalan have en klinisk virkning. Hypotesen er, at melphalan skærme og GEPs af B-celle kræft cellelinjer kombineret med multivariat statistik kan give prædiktiv kliniske oplysninger.

Materialer og metoder

Microarray baseret GEPs og en melphalan væksthæmning skærm 59 cancer cellelinjer blev hentet fra National Cancer Institute-database. Ækvivalente data blev genereret for 18 B-celle cancercellelinjer. Lineære diskriminant analyser (LDA), blev sparse partielle mindste kvadrater (SPLS) og parvise sammenligninger af cellelinje data anvendes til at opbygge modstand signaturer fra begge cellelinje paneler. En melphalan modstand indeks blev defineret og estimeret for hver MM patient i et offentligt tilgængelige kliniske data, der er og evalueres efterfølgende af Cox proportionel risiko og Kaplan-Meier overlevelsesanalyse.

vigtigste resultater

Begge cellelinje paneler klaret sig godt med hensyn til intern validering af SPLS tilgang, men kun B-celle panel var i stand til at forudsige en betydeligt højere risiko for recidiv og død med stigende modstand indeks i de kliniske datasæt. De mest følsomme og resistente cellelinier, MOLP-2 og RPMI-8226 LR5 henholdsvis havde høj gearing, hvilket tyder på deres differentielt udtrykte gener til at besidde vigtige prædiktiv værdi.

Konklusion

Den nuværende undersøgelsen viser en melphalan modstand indeks genereret ved analyse af en B-celle panel af cancercellelinjer. Det er imidlertid nødvendigt, at modstanden indeks, der skal funktionelt valideret og korreleret til kendte MM biomarkører i uafhængige datasæt med henblik på bedre at forstå den mekanisme ligger til grund for beredskab til melphalan modstand

Henvisning:. Boegsted M, Holst JM, Fogd K , Falgreen S, Sørensen S, Schmitz A, et al. (2011) Generering af en Predictive Melphalan Resistance Index ved Drug Screen of B-celle kræft cellelinjer. PLoS ONE 6 (4): e19322. doi: 10,1371 /journal.pone.0019322

Redaktør: Venugopalan Cheriyath, Cleveland Clinic, USA

Modtaget: Juli 2, 2010; Accepteret: April 1, 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Boegsted et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen understøttes af MSCNET, en translationel program studere cancer stamceller i myelomatose støttet af EU FP6, og CHEPRE, et program studerer kemosensitivitet i malignt lymfom af genomiske signaturer støttet af dansk Styrelsen for Videnskab, Teknologi og Udvikling, samt det Obelske Familiefond og Karen Elise Jensen Fonden. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

alkylerende middel, melphalan, er rygraden i nuværende terapi i MM. Siden 1990’erne har melphalan blevet brugt i høj dosis terapi (HDT) efterfulgt af autolog stamcelletransplantation (ASCT) [1] og har som sådan forbedret svarprocenten, samt forlænget begivenhed overlevelse (EFS) og samlet overlevelse ( OS) [2]. Selvom de sidste år har der været betydelige forbedringer, den samlede overlevelse forbliver dystre og sygdommen anses uhelbredelig – primært som følge af en indledende refraktær sygdom eller induceret resistens resulterer i sygdom tilbagefald. Refraktær sygdom og tidlig tilbagefald betragtes forbundet med udviklingen af ​​melphalan modstand, som er et komplekst fænomen forstås ikke fuldstændigt [3]. En mulig strategi til forbedring af viden om resistens er den kombinerede anvendelse af nye teknologier, herunder GEP og lægemiddel skærm i et præklinisk maligne B-celle kræft cellelinje model [4].

Den grundlæggende idé om de seneste undersøgelser på resistens har været at kategorisere cellelinjer i følsomme, resistente og mellemliggende grupper baseret på narkotika dosis-respons eksperimenter og efterfølgende at generere en genetisk sorterer eller signatur baseret på microarray analyse. Offentligt tilgængelige data fra NCI60 cellelinje panel genereret af National Cancer Institute (NCI) er blevet udbredt i sådanne undersøgelser for forskellige cancertyper og behandlingsregimer. Men tilgangen er stadig kontroversielt, [5], [6]. Flere forfattere har hævdet, at udførelsen kan forbedres ved en specifik cellelinie panel. En sådan tilgang blev anvendt af Lee et al. [7] og Liedtke et al. [8] for blære og brystkræft tumorer, hhv. Den vellykkede tilgang Lee et al. [7] var baseret på udvælgelsen af ​​gen udtryk for orgel specifikke cellelinier, der korrelerer med gen udtryk i patientens materiale, før udvikle deres klassificeringen af ​​en fejlklassificering-straffet posterior algoritme. Imidlertid Liedtke et al. [8] var ude af stand til at forudsige udfaldet af kemoterapi respons med en tilgang baseret på diagonal lineær diskriminant analyse (DLDA) for klassificering.

Begrebet nærværende undersøgelse er, at kan studeres melphalan modstand i MM i en præklinisk model af maligne B-celle-cancercellelinjer ved at kombinere narkotika skærme og GEPs og generere et gen signatur for resistens, som klinisk kan valideres ved at forudsige resultatet for tumorer analyseret før højdosis melphalan og ASCT. En sådan strategi indebærer intensiv datagenerering i laboratoriet og efterfølges af brug af data management og avancerede statistiske analyser [5], [6]. I den foreliggende undersøgelse, har vi implementeret reproducerbarhed ved at scripte hele dataanalyse flow i R og BioConductor.

Sammenfattende de specifikke mål for denne undersøgelse var at udvikle en melphalan resistensgen indeks ved anvendelse af 1) den offentligt tilgængelig cellelinie panel NCI60 eller 2) et panel af B-celle-cancercellelinier og 3) at understøtte konceptet om tilgængelige microarrays og kliniske data “on-line”, der fra MM patienter behandlet med dobbelt høj dosis melphalan [9].

Materialer og metoder

Den NCI60 cellelinje Panel

Den NCI60 cellelinje skærm metode er udviklet af NCI og tjener til at screene et stort antal stoffer til cytotoksisk aktivitet. Panelet består af 59 cellelinjer afledt forskellige cancertyper [10], [11]. De genekspression data og kemoterapi følsomhed data er offentligt tilgængelige. For mere information, se Online Information Sektion nedenfor. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi GI

50 værdi som defineret af NCI [12].

B-celle kræft cellelinjer og dyrkningsbetingelser

BCell Panelet bestod af 13 mm celle linjer, 1 plasmacytoma (PC) cellelinje og 4 diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) cellelinier. Cellelinierne blev dyrket under standardbetingelser ved 37 ° C; i en fugtig atmosfære af 95% luft /5% CO

2 med det passende medium, føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin tilsætning. Se tabel S1. De cellelinier blev opretholdt i maksimalt 20 passager for at minimere eventuelle langsigtede dyrkning effekter. Penicillin /streptomycin 1%, RPMI1640, IMDM og FBS blev købt hos Invitrogen. De cellelinier KMM-1 og KMS-11 blev opnået fra JCRB (japansk Indsamling af Research Bioressourcer), og KMS-12-PE, KMS-12-BM, LP-1, MM1S, MOLP-2, MOLP-8, NCI -H929, OPM-2, RPMI-8226, U-266, AMO-1, DB, HT og SU-DHL-4 fra DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen). Cellelinjen MM1S blev leveret af Steven T. Rosen [13], RPMI-8226 LR5 af William S. Dalton [14] og OCI-Ly7 af Hans Messner [15].

Melphalan Dose Respons Eksperimenter

celleantal i kulturen blev bestemt ved absorbansmålinger (CellTiter 96 Aqueous One Solution-reagens Promega) som beskrevet af producenten. Det lineære forhold mellem absorbans og celleantal blev opnået ved at pode celler i 96-brønds plader med den passende medium ved koncentrationer på mellem 15-60000 celler /brønd. De 18 cellelinier blev inkuberet i 24 timer før tilsætning af 18 stigende koncentrationer af melphalan i triplikater. Alle brønde blev podet med celler, men grænserne blev omgået ved at inkludere kun ikke-grænserne brønde til analyse. Den melphalan blev løst i ethanol giver en endelig ethanol-koncentration på 0,06% i mediet. Det relative celleantal blev målt 48 timer efter tilsætningen af ​​melphalan hjælp af CellTiter reagens og Optima-Fluostar (BMG LABTECH) ved 492 nm. For at opnå høj reproducerbarhed, blev hele forsøget gentages mindst to gange ved anvendelse af nye freeze lagrene af de enkelte cellelinjer.

RNA microarray analyse

Alle GEPs blev udført under anvendelse af Affymetrix microarray platform og standardprocedurer . Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse Invitrogen TRIzol Reagent kombineret med Qiagen RNeasy Mini kit. Kvaliteten blev kontrolleret af Agilent 2100 Bioanalyzer. Prøverne blev forberedt til hybridisering til Affymetrix GeneChip HG-U133 Plus 2,0 arrays efter fabrikantens anvisninger og .CEL-filer blev genereret af Affymetrix GeneChip kommandokonsollen Software (AGCC) og deponeret på NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) repository. Dataene opfylder kravene om at være MIAME kompatibel. For mere information, se Online Information Sektion.

Arkansas og Hummel kohorter af MM og DLBCL Patienter

Gene udtryk data, EFS, og OS data for 565 patienter diagnosticeret med progressiv eller symptomatisk MM er offentligt tilgængelige. For mere information, se Online Information Sektion. Datasættet er kendt som “Arkansas data” [16]. Patienterne blev inkluderet ved myelom Institut for Forskning og Terapi, University of Arkansas, School of Medical Sciences, og de var en del af en større undersøgelse med det formål at undersøge, om thalidomid i kombination med HDT kan forlænge overlevelsen blandt patienter med MM [9 ]. De 565 patienter blev behandlet ifølge den samlede terapi to (TT2) eller total terapi tre (TT3) protokol herunder dobbelt høj dosis melphalan og ASCT.

Datasættet kendt som “Hummel data” [17] var anvendes i den foreliggende undersøgelse at teste specificiteten af ​​det identificerede resistens indeks. De 87 patienter blev diagnosticeret med DLBCL og modtog en CHOP-lignende (cyclophosphamid, doxorubicin, vincristin, og prednison) induktion behandling. Genekspression og OS data er offentligt tilgængelige samt (for mere information, se Online Information Section).

Statistisk analyse

Fuld dokumentation af den statistiske analyse leveres af en Sweave dokument, se tekst S1. Sweave er en funktion i det statistiske programmeringssprog R, der gør det muligt at integrere R kode i latex og dermed det giver reproducerbare dataanalyse og forskning [18]. Alle statistiske analyser blev udført med R [19] udgave 2.12.1 og en række BioConductor [20] pakker. Nærmere session oplysninger er indeholdt i tekst S1.

Melphalan Dose Respons Analyse.

De absorbansværdier oprindelse fra dosis-respons forsøg blev baggrund korrigeret og gennemsnit over gentagelser. Eventuelle outliers blandt de triplikerede celle koncentrationer blev fjernet af Grubbs ‘test [21] (ca. 0,5%, se tekst S1). Relative vækst inhiberingskurver blev beregnet for hver koncentration i forhold til den ubehandlede kontrol, hvorefter en kurve stykvis lineær vækst blev modelleret. Gennem visuel inspektion blev fem ekstreme værdier fjernes (Figur S1). GI

50 værdier af cellelinier i BCell panelet blev defineret som det første punkt, hvor vækstkurven falder til under 50% niveau. Data blev gennemsnit for de replikerede celle line målinger til at udføre denne analyse. Usikkerheden på GI

50 værdier blev vurderet ved sub-sampling de replikerede brønde med udskiftning og en ny beregning af alle de GI

50 værdier 200 gange. Den 10-fold logaritme af GI

50 værdier blev omdannet til log

10 uM-skala for begge cellelinje paneler og anvendes som en melphalan modstand index – i det følgende betegnet den NCI60 indekset og BCell indeks henholdsvis . Som et middel til at skelne mellem følsomme, mellemliggende og resistente fag (cellelinjer eller enkeltpersoner) i en population, valgte vi kriteriet Havaleshko et al. [22], hvor et individ er resistent, hvis dens modstand overstiger den 75 percentil af befolkningen. Ligeledes defineres vi et individ at være følsomme, hvis dens modstand indeks var mindre end 25 percentil af befolkningen. De resterende forsøgspersoner blev karakteriseret som havende mellemliggende modstand.

Microarray Pre-behandling.

BCell .CEL-filer og de downloadede NCI60 .CEL-filer blev baggrund korrigeret og normaliseret ved bare. RMA funktion fra affy pakke. Alle RMA-normaliseret arrays bestået statistisk kvalitetskontrol, som funktionen arrayQualityMetrics i R-pakke arrayQualityMetrics [23]. Da NCI60 panel blev analyseret på HG-U133a array og BCell på HG-U133 Plus 2.0 array, fokus på sonder kun til stede på HG-U133A array. De Arkansas data blev også baggrund korrigeret og normaliseret med just.rma.

Differential Expressions.

Efter uspecifik filtrering af genekspression data blev cellelinjer rangeret som resistente, intermediære eller følsomme efter deres GI

50 værdier. Udskrifter, der udtrykte signifikante forskelle mellem de grupper af de mest følsomme og mest resistente cellelinier blev bestemt ved hjælp modereret F-tests som implementeret i BioConductor pakken limma [24]. Gener med en P-værdi på under 0,05 blev anset for at have prædiktiv værdi. P-værdier blev bevidst valgt i stedet for falske opdagelse satser som formålet var at konstruere en modstand klassificeringen og ikke at opdage differentielt udtrykte gener. De differentielt udtrykte gener blev skaleret til at have nul middelværdi og standardafvigelse én. En klassifikatør blev bygget af skalerede gener og lineær diskriminant analyse (LDA) som gennemført i den R-pakken sda [25]. For at undgå vanskeligheder invertere store kovariansmatrixer blev et maksimum på 400 gener i sda valgt.

Multivariate regression.

Generne blev filtreret efter sikker uafhængighed screening (SIS), dvs. alle gener var rangordnet efter Pearson korrelationskoefficienten mellem dens genekspression og resistens indeks. Alle gener, for hvilke P-værdien af ​​testen for nul korrelation var over 0,05, blev anset for reduktion dimensionalitet af SPLS [26]. For at opnå sparsity, SPLS straffer de transformerede input vektorer ved at tvinge små koefficienter at være nul. Den rene SPLS formuleringen indeholder fire tuning parametre, men ifølge Chun et al. [26], en simpel SPLS regression formulering, som kun afhænger af én parameter

η

, styrer sparsitet af opløsningen og antallet af skjulte komponenter

K

. Til særlige valg af legalisering parameteren

η

de skjulte komponenter

K

forestillingen blev evalueret ved leave-one-out cross-valideringer. Den optimale konfiguration af parametrene blev valgt til at være det sæt minimere middelværdien kvadrerede forudsigelsesfejl (MSPE). Når de optimale parametre er blevet valgt internt fra cellelinierne, kan modstanden indeks forudsiges for emnerne via en lineær kombination af de skalerede genekspressioner med koefficienterne anslået af SPLS [27]. Den SPLS analyse og forudsigelser udføres med R-pakke SPL værdier, som Chun et al. [26].

Independent Filtrering.

Det er velkendt, at uafhængige filtrering øger afsløring strøm til high-throughput eksperimenter [28]. For at undersøge om uafhængig filtrering ville øge nøjagtigheden og forudsigelse fejl, en uspecifik filtrering, udelader gener med lav variation over NCI60 og BCell genekspressioner, blev udført med den funktion nsFilter fra BioConductor pakken genefilter. De afskæringsværdier varierede mellem 0% og 100% og vi valgte cut-off værdi, der klarede sig bedst i forhold til cross-valideret nøjagtighed for LDA og MSPE for SPLS. For at undersøge, om en forudsigende magt tilbage efter filtrering, blev krydsvalidering udført for de valgte parametre.

Survival Analysis.

Kaplan-Meier overlevelse analyse, logrank test og Cox proportionel risiko modeller blev beregnet med funktioner fra R-pakken survfit. En ikke-lineær sammenhæng mellem den forudsagte respons på behandling og modstanden indekset blev bemærket og forholdet blev estimeret ved begrænsede kubiske splines (RCS) ved hjælp af R-pakken Design [29]. Betydningen er indstillet til 0,05 og hazard ratio (HR) er givet med 95% konfidensintervaller.

Online Information

detaljer om de nødvendige og deponeret på online-information er beskrevet nedenfor.

Den BCell Gene Expression data.

.CEL filer til de 18 cellelinje microarrays er deponeret på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under GEO tiltrædelse nummer GSE22759. Dataene opfylder kravene til at være MIAME kompatibel

Den NCI60 Gene Expression data

.CEL-filer til NCI60 cellelinie mikroarrays var hentet fra http:.. //www.ncbi.nlm .nih.gov /geo /under GEO tiltrædelse nummer GSE5720 ved at vælge delmængde af data stammer fra HG-U133A array. Cellelinien IGROV1 er tilvejebragt i dublicates – i den foreliggende undersøgelse replikat A21 anvendes. Dataene opfylder kravene til at være MIAME kompatibel. Bemærk, at vi har renormalized de .CEL filerne som beskrevet i Materialer og metoder afsnit.

Den NCI60 DTP data.

DTP human tumor cellelinie screening data (august 2008 release) blev opnået ved at downloade filen cancer60gi50.lis fra hjemmesiden: https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/cancer_data.html. Dele af manuskriptet til udvinding NCI60 lægemiddelrespons er udviklet af Kevin Coombes og Keith Baggerly og kan downloades fra hjemmesiden https://bioinformatics.mdanderson.org/Supplements/ReproRsch-Chemo/.

The Arkansas Gene Expression og kliniske data.

.CEL filer for genekspression data og kliniske oplysninger findes på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under GEO tiltrædelse nummer GSE24080. Dataene opfylder kravene til at være MIAME kompatibel. De .CEL filer renormalized som beskrevet i Materialer og metoder Afsnit

Den Hummel genekspression og kliniske data

.CEL filer og kliniske oplysninger findes på http:.. //Www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/under GEO tiltrædelse nummer GSE4475. Dataene opfylder kravene til at være MIAME kompatibel. De .CEL filer renormalized som beskrevet i Materialer og metoder afsnit.

Resultater

Den NCI60 Panel Resistance Index

I kort sammendrag, dosis-respons data for melphalan blev downloadet . En afbildning af dataene er vist i figur S2. De 59 cellelinjer viste GI

50 værdier fra -5,77 til -3,99 på loggen

10 pM /ml skala -. Den mest følsomme cellelinje bliver SR og den mest modstandsdygtige cellelinje være A498

Udvikling af B-celle Resistance Index

dosisrespons blev udført, og afbildninger af data samt monteret kurver er illustreret i figur 1A. De 18 cellelinjer udviste GI

50 værdier fra -6,02 til -4,13 på loggen

10 pM /ml skala – den mest følsomme cellelinie er MOLP-2 og den mest modstandsdygtige cellelinje er RPMI-8226 LR5 . Figur 1B viser box plots af middelværdien GI

50 værdi fra endnu en prøve dosisresponskurver for alle 18 B-celle cancercellelinjer. Som det blev påvist nogen klar sondring mellem en resistent og følsom gruppe af cellelinier, 25% /50% /25% split beskrevet i Materialer og metoder afsnit blev valgt, dvs. de fem cellelinjer med den laveste GI

50 værdier blev betegnet følsomme og de fem cellelinier med den højeste GI

50 værdier blev betegnet resistente.

A) i gennemsnit dosisresponskurver for hver cellelinie. B) Box plot af 200 resamples GI

50 værdier for hver cellelinje. De cellelinjer er rangeret efter deres forventede GI

50 værdi.

Classifier Baseret på LDA

For NCI60 panel, en LDA baseret klassifikatør blev bygget som skitseret i Materialer og metoder sektion, for detaljer se tekst S1. LDA baseret klassifikator viste dårlig intern validering (fig S3). Den optimale nøjagtighed (bestemt ved leave-one-out krydsvalidering) på 0,6 blev opnået for BCell panelet ved en filtrering på 0,95, i hvilket tilfælde modereret F-testen gav 159 gener (Tabel S2). LDA blev anvendt til at kombinere de 159 gener til at udvikle en sorterer. Klassificeringen viste 60% samlet leave-one-out-krydsvalidering nøjagtighed for de cellelinier, hvorfra den blev udviklet.

Cross-Validering af SPLS Model

Efter de uspecifikke filtrering skridt var nået, blev SPLS anvendes til at opnå specifik filtrering. For at undgå over-montering og støj bidrager gener, blev antallet af skjulte komponenter og probesets valgt af leave-one-out cross-validering. Det optimale antal probesets og komponenter blev fundet på de værdier, hvor den minimale MSPE blev opnået. For NCI60 panelet, blev en rimelig intern validering observeret (figur S4). På BCell panel, to skjulte komponenter og 19 probesets forudsat den bedste MSPE (fig S5). Den gearing af en enkelt celle linje på forudsigelsen modellen blev undersøgt ved at plotte den forudsagte modstandsværdi stammer fra leave-one-out-krydsvalidering versus den målte modstand indeks (Figur S6). De mest følsomme og resistente cellelinier MOLP-2 og RPMI-8226 LR5 henholdsvis viste sig at være høje gearing point.

Stabilitet Evaluering

For at se, hvordan SPLS regression klarer støj, den BCell panel blev anvendt til at vælge 20 probesets tilfældigt blandt de 100 probesets med den højeste marginale forening (absolutte værdi af den Pearson korrelationskoefficienten) med modstanden indekset. For at holde afhængigheden struktur mellem de probesets intakte, blev disse alle tilfældigt perturbed, bortset fra de 20 probesets. Koefficienterne for de probesets er vist som en funktion af den legalisering parameteren

η

i figur S7. I dette eksempel, det optimale antal sparsomme partielle mindste kvadraters komponenter var

K =

3 og den optimale regulering parameter var

η =

0,83. Elleve probesets blev valgt, hvilket viser en gennemsnitlig sensitivitet på 55%, en specificitet på 99% og en falsk opdagelse sats på 63%. Forsøget blev gentaget 100 gange og gav i gennemsnit en følsomhed på 54%, en specificitet på 99% og en falsk opdagelse på 67%.

Sammenligning af de mest følsomme og resistente cellelinier

grund af den høje indflydelse af de mest følsomme cellelinie, MOLP-2, og de mest modstandsdygtige cellelinje, RPMI-8226 LR5, en direkte sammenligning af disse to cellelinier blev foretaget. Dette blev gjort ved at sortere generne efter deres absolutte forskel i genekspression og vælge (ganske vilkårligt) de 100 gener med de højeste absolutte differentielle udtryk. En prædiktiv modstand indeks blev bygget ved at tage forskellen i gen udtryk som vægt. Generne og deres vægte er vist i den underbyggende oplysninger (tabel S3).

Ekstern Validering på kliniske prøver

EFS og OS blev valgt som slutpunkter med den hypotese, at melphalan resistens er korreleret til disse endepunkter. For NCI60 og BCell paneler blev LDA og SPLS modeller samt den model, som består af de to indflydelsesrige cellelinier i BCell panelet anvendes til at estimere melphalan modstand indeks for hver af de Arkansas patienter.

I LDA baseret forudsigelser baseret på den NCI60 panelet ingen signifikant forskel blev observeret med hensyn til OS og EFS for de forudsagte følsomme, mellemliggende og resistente grupper af patienter (figur S8 og S9). For NCI60 og SPLS baserede forudsigelser ingen signifikant forskel blev fundet for de forudsagte følsomme, mellemliggende og resistente grupper såvel som den forudsagte log relative fare for OS og EFS til patientdata i Arkansas. Se figur 2A og C og figur 3A og C.

A) Kaplan Meier overlevelseskurver baseret på NCI60. B) Kaplan Meier overlevelseskurver baseret på BCell.