PLoS ONE: Tab af p19Arf Letter den angiogene Switch og Tumor Initiation i en Multi-Stage Cancer Model via p53-afhængige og uafhængige mekanismer

abstrakt

ARF tumor suppressor virker som en sensor af onkogene signaler, modvirke afvigende proliferation i stor del via aktivering af p53 transcriptional program, selvom en række p53-uafhængig funktioner beskrevet. Montering tyder på, at ud over at fremme tumorgenese via forstyrrelser i den homeostatiske balance mellem celleproliferation og apoptose af åbenlyse cancerceller, genetiske ændringer, der fører til tumor suppressor tab af funktion eller onkogen gevinst på funktion kan også tilskynde tumorudvikling via virkninger på tumor mikromiljø. I en transgen musemodel for etapevis pancreatisk neuroendokrine carcinogenese (PNET) drevet af inhibering af den kanoniske p53 og Rb tumorsuppressorer med SV40 stort T-antigen (Tag), stokastisk progression til tumorer er begrænset delvist af et krav om initiering af en angiogen switch. Trods inhibering af p53 by Tag i denne mus PNET model, samtidig afbrydelse af ARF via genetisk knockout resulterede i en signifikant fremskyndet vej til tumordannelse blev overraskende ikke drevet af ændringer i tumorcelleproliferation eller apoptose, men snarere via tidligere aktivering af den angiogene kontakt. Ved fastsættelsen af ​​en forfatningsmæssig p53-gen knockout, tab af ARF accelererede også tumor udvikling, om end i mindre grad. Disse resultater viser, at ARF tab af funktion kan fremme tumorigenese via lette angiogenese, i det mindste delvis gennem p53-uafhængige mekanismer

Henvisning:. Ulanet DB, Hanahan D (2010) Tab af p19

Arf Letter den angiogene Switch og Tumor Initiation i en Multi-Stage Cancer Model via p53-afhængige og uafhængige mekanismer. PLoS ONE 5 (8): e12454. doi: 10,1371 /journal.pone.0012454

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: Juni 2, 2010; Accepteret: August 3, 2010; Udgivet: 27 august, 2010

Copyright: © 2010 Ulanet, Hanahan. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra National Cancer Institute (DH, R01CA45234) og AP Giannini Foundation for Medicinsk Forskning (DBU, https://www.apgianninifoundation.org/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ARF (alternativ læseramme; p14

ARF i menneskelig, p19

Arf i mus) tumor suppressor fungerer som en sensor af hyper-proliferative signaler, hvilket resulterer i p53-afhængig vækst anholdelse og apoptose [1], [2], [3]. Mens ARF ikke udtrykkes ved betydelige niveauer i de fleste normale væv, onkogen aktivering udløser dets ekspression [4], hvilket resulterer i inhibering af MDM2 ubiquitin ligase og stabilisering af p53 [5]. Hæmning af p53 pathway, oftest via mutationer i

p53

selv, inaktivering af

ARF

eller forstærkning af

MDM2

menes at være et afgørende skridt i patogenesen de fleste humane cancere [6]. Selvom mutation af

p53

ARF

i tumorer er for det meste gensidigt eksklusive arrangementer [7], montering tyder på, at forholdet mellem p53 og ARF er ikke strengt lineær og peger på p53 -uafhængige tumor suppressor funktioner af ARF [8], [9]. Indledende in vivo beviser for en potentiel modsætning mellem ARF og p53 kom fra den konstatering, at kombineret

P19

ARF

og

p53

mangel i mus resulterer i fremkomsten af ​​en tumor spektrum bestående af en bredere vifte af tumortyper end i mus, som mangler enten gen alene [9]. Efterfølgende en undersøgelse i DMBA /TPA totrins mus hudkræft model afslørede en accelereret vækst af papillomer i en

P19

ARF

deficiente i forhold til en

p53

deficiente genetisk baggrund [10]. Tilsvarende

P19

ARF

men ikke

p53

mangel lettet melanom udvikling i en transgen musemodel gennem lindring af en p53-uafhængig ældning vej [11]. En nyere undersøgelse foreslog en kontekst-afhængighed til resultatet af

P19

ARF

tab under onkogenese i fastsættelsen af ​​

PTEN

-deficiency, idet

P19

Arf

tab bibringes en delvis hæmmende funktion under prostata carcinogenese, men afskaffede ældning og fremmet hyperproliferation og transformation af mus embryo fibroblaster. I begge indstillinger forskellen resultatet af

P19

ARF

tab sket uden effekt på p53 aktivitet [12].

I en transgen musemodel for etapevis bugspytkirtlen neuroendokrine carcinogenese (PNET) , RIP-tag2, ekspression af SV-40 T-antigen (Tag) i pankreatiske p-celler fører til inhibering af tumorsuppressorer p53 og Rb, fremme en tidsmæssigt defineret endnu stokastisk etapevis vej til tumorigenese. Trods onkogen udtryk i alle ~400 mus pancreas-øer, er sekundære begivenheder kræves for progression til hvert trin af vejen til tumorer [13], [14]. Størstedelen, men ikke alle normale øer udvikle sig til hyperplastiske /dysplastiske læsioner i hele det omtrentlige 14 uger levetid RIP-tag2-mus. Tilsvarende kun en delmængde (~15-20%) af hyperplastiske ø læsioner underkastes en angiogen switch, og kun en brøkdel (-25%) af disse angiogene øer efterfølgende udvikle sig til faste tumorer. Fremme af hyperplastiske kontakten menes at være delvist medieret af væksten /overlevelsesfaktor, IGF-II, som dens ekspression induceres samtidig med begyndelsen af ​​β-celle hyper-proliferation [15]. En nyere undersøgelse har identificeret en sammenhæng mellem microRNA udtryk signaturer og de forskellige RIP-tag2 tumorigenese etaper, hvilket indebar, at ændringer i ekspressionen af ​​disse miRNA kunne spille en rolle som drivkraft disse “switches” [16].

Vi søgte i denne undersøgelse at fastslå, om ARF havde p53-uafhængige funktioner i at undertrykke tumor progression i RIP-tag2 PNET model via kors til mus, der bærer en genetisk knock-out af

Arf.

en tidligere undersøgelsen viste, at genetisk knockout af

p53

i denne model ikke resulterede i en accelereret vej til tumordannelse, og faktisk var beta tumorcelleproliferation reduceret, sandsynligvis en konsekvens af destabilisering af SV-40 store T antigen onkogen, hvortil det binder [17]. I modsætning hertil viser vi her, at tabet af

Arf

betydeligt accelererer tumordannelse via lette angiogene switch. Disse undersøgelser giver

in vivo

evidens for p53-uafhængige funktioner ARF og foreslå en ny rolle for ARF som suppressor af tumor angiogenese.

Resultater

Knockout af

ARF

accelererer RIP-tAG2 tumor progression uden væsentlig indvirkning på tumor celle apoptose /spredning

i overensstemmelse med den kendte induktion af p19

Arf som reaktion på onkogene signaler [4],

ARF

mRNA-ekspression viste sig at blive induceret i SV-40 Tag udtrykker hyperproliferative øer sammenlignet med normale øer, med en yderligere stigning med progression til angiogene læsioner og faste tumorer i RIP-tag2-mus (figur 1). For at bestemme om ARF kunne undertrykke tumorigenese i fastsættelsen af ​​p53 hæmning, vi vurderet virkningerne af genetisk knockout af

ARF

på denne vej. Bemærkelsesværdigt, tab af ARF resulterede i en meget betydelig, næsten 5 gange stigning i tumorbyrde (figur 2A, s 0,0001); der var desuden en 1,8-gange stigning i tumor nummer (figur 2B, p = 0,002). Heterozygot tab af ARF resulterede også i en signifikant stigning i tumorbyrde (p 0,001) og tumor nummer (p = 0,02) sammenlignet med

ARF

vildtype RIP-tag2-mus. Tab af vildtype

Arf

allel ikke forekomme i nogen af ​​de

ARF

+/-

tumorer undersøgte (Figur S1).

mRNA-niveauer af

ARF

blev vurderet ved brug af kvantitativ RT-PCR på cDNA frembragt fra RNA puljer af normale ikke-transgene øer, og hyperplastiske øer, angiogene øer (isolerede øer fra 5-10 mus blev poolet) og tumorer (lig mængder RNA isoleret fra 10 tumorer fra mindst 5 mus poolet) fra RIP-tag2-mus. Genekspression normaliseret og plottet i forhold til MGUS udtryk

(A, B) Virkninger af heterozygote og homozygote knockout af

ARF

på tumor byrde (A;. * P 0,001, * * p 0,0001 sammenlignet med

Arf + /+

; forskellen mellem

ARF +/-

og

Arf – /-

mus var ikke statistisk signifikant) og tumor nummer (B ; * p = 0,02, ** p = 0,002) i 12 uger gamle RIP-tag2-mus. Middelværdier +/- SEM fra 15 (

Arf + /+

), 17 (

Arf +/-

), eller 20 (

Arf – /-

) mus /gruppe er vist. Mann-Whitney-test for statistisk signifikans. (C) Apoptose, bestemt ved TUNEL mærkning i hyperplastiske øer (Hyp), angiogene øer (Ang), og tumorer (Tum) fra

ARF

+ /+

eller

Arf

– /-

RIP-tAG2 mus. Middelværdier +/- SEM fra graduerede læsioner af 6-7 individuelle mus af hver genotype er angivet. Det samlede antal læsioner analyseret for hver genotype /læsion fase er følgende:

Arf + /+

(Hyp: n = 27; Ang: n = 33; Tum: n = 14);

Arf – /-

(Hyp: n = 18; Ang: n = 25: Tum: n = 22). (D) spredning, som målt ved% af celler med BrdU inkorporering i de forskellige faser af ø-læsioner fra 4 individuelle

Arf + /+ Hotel (Hyp: n = 21; Ang: n = 24; Tum: n = 12) og

Arf – /-

(Hyp: n = 18; Ang:. n = 22; Tum: n = 24) RIP-tAG2 mus

i betragtning af den tidligere demonstreret evne ARF at fremkalde cellecyklusstop og apoptose uafhængigt af p53 [9], [18], [19], [20], [21], vi undersøgt for ændringer i apoptose og proliferation som vurderet af TUNEL mærkning og BrdU inkorporering henholdsvis i præ-neoplastiske og tumor læsioner fra

RIP-tAG2; Arf

+ /+

ARF

– /-

mus. Overraskende, vi var ude af stand til at opdage nogen væsentlig effekt af tab af ARF på hver af disse parametre på nogen af ​​de RIP-tag2 stadier (Figur 2C, D). For at sikre, at vi ikke overse subtile virkninger på cellecyklusregulering /proliferation, foruden den BrdU inkorporering assay, der måler procentdelen af ​​celler i S-fase, vi vurderede også proliferative indeks ved immunofarvning for phospho-histon H3, en markør for celler i M-fase. Efter aftale med BrdU-inkorporering assay blev ingen signifikant forskel i procentdelen af ​​celler i M-fase observeret ved tab af ARF (figur S2). Endvidere stabil knockdown af

Arf

anvendelse af en

Arf

målretning shRNA i en cellelinie afledt fra en vildtype RIP-tag2 tumor havde ingen virkning på væksten af ​​cancerceller in vitro (figur 3).

Tumorceller stabilt transduceret med en ikke-dæmpning (NS) eller

Arf

lyddæmpende shRNA. (A) Knockdown af ARF protein-ekspression af

ARF

målrettet shRNA. β-actin proteinniveauer angivet som kontrol for proteinmængde. (B) Effekt af

Arf

knockdown på tumorcellevækst

in vitro

. Middelværdier +/- SEM fra tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer er angivet.

Tab af ARF letter angiogene switch

For at undersøge, hvordan knockout af

Arf

kan accelerere tumorvækst uden ændringer i β-celle-proliferation eller apoptose, vi vurderet om tab af ARF kunne påvirke nogen af ​​de iboende barrierer, der begrænser overgang onkogen ekspression p-celler i pancreas-øer gennem de forskellige trin til tumordannelse. Trods ekspression af Tag onkogen i udviklingslandene bugspytkirtlen begynder ved embryonisk dag 9, er der en forsinkelse i sporadiske initiering af ø-hyperproliferation af flere uger. For at bestemme hvorvidt tabet af ARF kunne fremme en tidligere initiering af hyperplastiske switch, undersøgte vi procentdelen af ​​hyperproliferative ø læsioner (som bestemt ved farvning med Ki67 proliferationsmarkør) på både 3- og 5-uger gamle i

RIP -Tag2; Arf

+ /+

ARF

– /-

mus. Ingen signifikant forskel i procentdelen af ​​hyperproliferative øer blev observeret ved en af ​​disse faser (figur 4A), om end i 5-ugers alderen, holme fra

RIP-tag2

;

ARF

– /-

mus var i gennemsnit større i størrelse (figur S3A 1.5-dobling; p = 0,007). Den øgede læsion størrelse ikke var et resultat af øget cellestørrelse som antallet af celler /område var næsten identisk mellem de to grupper (Figur S3B).

(A) Virkninger på hyperplastiske switch. Islets fra Ki67-farvede sektioner fra 3- eller 5 uger gamle mus blev scoret som “normal” (ingen hyperproliferation) eller hyperplastisk. Værdier repræsenterer fordelingen af ​​de forskellige ø-underklasser inden for de angivne genotyper. For 3-ugers mus, 60 (

Arf + /+

) og 58 (

Arf – /-

) ø-læsioner blev scoret på strækninger fra 3 mus /gruppe; for 5 uger gamle mus, 166 (

Arf + /+

) og 231 (

Arf – /-

) ø-læsioner blev scoret på strækninger 3-4 mus /gruppe. Fordelingen af ​​ø typer var ikke signifikant forskellig mellem de to genotyper ved hver tidspunkt (Fishers eksakte test; 5 uger tidspunkterne: p = 0,06). Repræsentative Ki67-farvet hyperplastiske læsioner (fra 3 uger gamle RIP-TAG2 mus) af det angivne

ARF

genotyper er afbildet til højre. (B, C) Virkninger på den angiogene kontakt og tumor initiering. Antallet af røde, angiogene læsioner (B) og tumorer (C) blev beregnet ud fra 11 (

Arf + /+

) eller 15 (

Arf – /-

) 8 uger gamle RIP- tag2 mus af de angivne genotyper. Middelværdier ± SEM er angivet. Mann-Whitney-test for statistisk signifikans; * P = 0,01, ** p. 0,0001

Vi næste vurderet virkningerne af

ARF

knockout af hyppigheden af ​​angiogene skift. I modsætning til den ubetydelig indvirkning på forekomsten af ​​ø Hyperplasier, blev antallet af røde, hæmoragisk angiogene holme steget betydeligt (med ca. 30%) i 8 uger gamle

RIP-tag2

;

ARF

– /-

mus sammenlignet med

RIP-tag2

;

ARF

+ /+

søskende (figur 4B; p = 0,01). Derudover, medens forekomsten af ​​faste tumorer var meget sjældne på 8 uger i

RIP-tag2

;

ARF

+ /+

mus (tumorer til stede i 4/11 mus, gennemsnit af 1 tumor /mus), små tumorer blev fundet i næsten alle

RIP-tag2

;

ARF

– /- iBooked.dk mus analyseret i denne alder (gennemsnit af ~2.5 tumorer /mus; figur 4C, s 0,0001). Notatet i scoring for hyperplastiske læsioner på 5 uger tidspunkt, lejlighedsvise holme udstiller de typiske blødende funktioner /blod øer af angiogene holme [22], [23] blev der observeret, med en tendens til en højere forekomst i

Arf

– /-

forhold til

ARF

+ /+

mus; men denne forskel var ikke statistisk signifikant på nuværende tidspunkt (fig S3C). Således i denne flertrinsmodel, tab af ARF accelererer tumordannelse i det mindste delvist, via lette angiogene switch.

Arf knockout resulterer ikke i væsentlige ændringer i det vaskulære fænotype

for yderligere at undersøge karakteren af ​​den øgede angiogene fænotype i

RIP-tag2

;

Arf

– /- Restaurant mus, vi næste vurderet fænotypen af ​​den angiogene vaskulatur. Trods det øgede antal angiogene læsioner i

RIP-tag2

;

Arf

– /- Salg mus, de resulterende læsioner afveg ikke signifikant i vaskulær tæthed eller morfologi (tykkelse fartøj, graden af ​​forgrening) (figur 5A og data ikke vist), eller i graden af ​​pericyt dækning (figur 5B). Givet tidligere resultater demonstrerer en rolle for MMP-9 udtrykke neutrofiler i at fremme den angiogene kontakt [24], vi undersøgte også, om tab af ARF udtryk resulterede i ændringer i forekomsten af ​​neutrofil rekruttering til “pre-angiogene” hyperplastiske læsioner. I begge

RIP-tag2

;

ARF

+ /+

RIP-tag2

;

ARF

– /-

mus, dobbelt-immunfarvning for Ki67 proliferationsmarkør og 7/4 neutrofil markør viste, at ca. 25% af hyperplastiske læsioner undersøgte (ved 5 ugers alderen) indeholdt infiltrerende neutrofiler ( i de fleste tilfælde ikke mere end en 7/4 + celle /ø, data ikke vist). Derudover blev der ikke observeret nogen væsentlige ændringer i antallet af infiltrerende MMP-9 og 7/4 dobbelt positive celler i angiogene læsioner fra 8-uger gammel

RIP-tag2

;

ARF

+ /+

RIP-tag2

;

Arf

– /-

mus (data ikke vist)

(A) Visualisering af vaskulaturen i angiogene læsioner fra 8 uger gamle RIP-tag2 mus af de angivne genotyper ved. immunfarvning for Meca32 (rød). Repræsentant Meca32 /DAPI (blå) fusionerede billeder vises. Vessel tæthed blev beregnet ved at måle arealet Meca32 + fartøjer; værdier repræsenterer middelværdien ± SEM beregnet ud fra en analyse af 16-20 angiogene læsioner fra 4 individuelle mus af hver genotype. (B) Dobbelt immunfarvning for Meca32 (endotelceller, rød) og NG2 (pericyter, grøn) blev udført for at undersøge, hvorvidt pericyt dækning inden den angiogene vaskulatur fra 8-ugers RIP-tag2 mus af de angivne genotyper. Barer, 20 um.

Selektiv

ARF

knockout i stromale rum ikke væsentligt øge tumor udvikling

Tidligere undersøgelser har vist, at

Arf

– /- Restaurant mus er blinde skyldes en defekt i involution af hyaloide vaskulatur i øjet under udvikling, som er resultatet af en ophobning af Pdgrfrβ + perivaskulære celler [25], [26]. Data, impliceret både celle selvstændige og ikke-selvstændige effekter af tab af ARF på denne fænotype [27]. Da

RIP-tag2

;

ARF

– /-

mus mangler ARF udtryk i hele kroppen og ikke kun i tumorceller, vi spørgsmålstegn ved, om tab af ARF i en ikke-β-celle type kunne delvist være lette angiogene kontakt og tumordannelse. For at begynde at udforske denne mulighed, vi først undersøgt, om vi kunne opdage

Arf

udtryk i det stromale rum af vildtype

RIP-TAG2

tumorer. Real-time kvantitativ RT-PCR-analyse på sorterede cellerum fra

RIP-tag2

tumorer demonstreret

Arf

udtryk, som forventet, i tumoren cellekammer, men ikke i endotelceller (CD31 +) , immunceller (CD45 +) eller pericytes (Pdgfrβ +) (Figur 6A og S4). Disse resultater er i overensstemmelse med den opfattelse, at induktion af ARF udtryk er, for det meste begrænset til reaktion på onkogene signaler [4]; Men dette analyse ikke udelukke muligheden af ​​forbigående induktion af ARF ekspression i de stromale celletyper analyseret, eller ekspression i andre klasser af tumorinfiltrerende celler [fx Pdgfrβ-negative pericytter [28]].

(A) Angivelse af

ARF

i de forskellige konstituerende RIP-TAG2 tumor celletyper. Real-time kvantitativ RT-PCR blev udført på mRNA isoleret fra FACS sorteret celler fra RIP-tag2 tumorer [EC’er (endotelceller), ICS (immunceller), T /anvendelsesforhold (tumor /andre celler)]. Ekspressionsniveauer afbildet i forhold til L19 ekspression. (B) Effekt af

ARF

knockout på tumor udvikling af orthotopisk transplanterede tumorceller. 1 × 10

5 tumorceller afledt af en

RIP-tag2

;

ARF

+ /+

tumor blev injiceret i bugspytkirtlen af ​​

Arf

+ /+

eller

ARF

– /-

mus og tilladt at vokse i 4 uger. Værdierne repræsenterer den gennemsnitlige tumorvolumen (+ SEM), beregnet i tumorer isoleret fra 12 individuelle mus i hver af de angivne genotyper. Forskellen mellem de værdier, opnåede ikke statistisk signifikans (Mann-Whitney test, p = 0,1).

For at direkte vurdere den potentielle rolle for

ARF

knockout i den ikke-tumor celle rum påvirke tumorudvikling, udførte vi ortotopisk eksperimenter hvori tumorceller afledt fra en

RIP-tag2

;

ARF

+ /+

tumor blev injiceret i bugspytkirtlen af ​​immunkompetente

ARF

+ /+

eller

ARF

– /-

mus og tumorstørrelse blev målt fire uger senere. Der var ingen signifikant forskel i den gennemsnitlige tumorstørrelse mellem tumorer dannet i

Arf

+ /+

versus

ARF

– /-

mus (figur 6B). Kombineret med vores manglende evne til at opdage

Arf

udtryk i en tumor stromale celletype, disse resultater tyder på, at knockout af

ARF

i tumoren stromale rum er ikke sandsynligt, at være den fremherskende føreren af ​​skyndte tumorvækst observeret ved

ARF

knockout i RIP-tAG2 mus. Da det er uklart, om den mekanisme af angiogenese induktion i orthotopisk injicerede tumorceller følger en lignende vej som angiogenese induceret i endogene præneoplastiske forandringer, det ikke udelukkes, at den manglende observerede effekt kunne delvist være afspejler disse forskelle.

Knockout af

ARF

accelererer tumordannelse via både p53-afhængige og uafhængige mekanismer

Da p53 har vist sig at være kvantitativt sequestered af SV-40 Tag og dens transaktiveringsaktivitet er bevisligt hæmmet i p-celler af RIP-tAG2 mus [17], vi mistænkes størstedelen af ​​effekter observeret ved knockout af

ARF

at være p53-uafhængig. Ikke desto mindre, vi fortsatte med at kontrollere p53-uafhængighed

Arf

knockout fænotype ved at analysere effekterne af

ARF

knockout i en p53-nul-genetiske baggrund. Som i p53-vildtype-baggrund,

ARF

knockout i

RIP-tag2; p53

– /-

mus resulterede i en signifikant øget (2,4 gange) tumor byrde ved 12 ugers alderen sammenlignet med

ARF

+ /+

kuld (Figur 7A; p 0,001), såvel som en betydelig stigning i antallet af angiogene læsioner (Figur 7C 30%, p = 0,04) og små tumorer (figur 7D; p = 0,002) ved 8 ugers alderen, hvilket bekræfter, at disse virkninger er i det mindste i del p53-uafhængig. Imidlertid bør det bemærkes, at størrelsen af ​​virkningen af ​​

Arf

knockout på tumorbelastning (efter 12 uger) og tumor nummer (ved 8 uger) var ikke så dramatisk som i

RIP-tag2

;

p53

-Wild-type mus (Figur 2). Hertil kommer, selvom tumor initiering forekom tidligere i

RIP-TAG2; p53

– /-; Arf

– /-

forhold til

RIP-TAG2; p53

– /-; Arf

+ /+

mus, med 12 uger gamle, blev ingen forskel i tumor nummer detekteret mellem mus af disse genotyper (Figur 7B), hvilket tyder på, at begge p53-afhængige og uafhængige funktioner ARF samarbejde for at undertrykke angiogene kontakt og tumor progression i dette etapevis carcinogenese model

(A, B)

ARF

knockout i

RIP-tAG2.; p53

– /-

mus resulterer i en øget tumorbelastning (A; p 0,0001) uden at påvirke tumor nummer (B) ved 12 ugers alderen. Middelværdier +/- SEM fra 19 (

p53 – /-; Arf + /+

), eller 14 (

p53 – /-; Arf – /-

) mus /gruppe er angivet. Mann-Whitney-test for statistisk signifikans. (C, D) Øget angiogene ø tal (C; p = 0,04) og tumorer (D; p = 0,002) i

RIP-TAG2; p53

– /-

;

P19

ARF – /-

mus ved 8 ugers alderen. Middelværdier +/- SEM fra 15 (

p53 – /-; Arf + /+

), eller 13 (

p53 – /-; Arf – /-

) mus /gruppe er angivet. Mann-Whitney-test for statistisk signifikans.

I et forsøg på at identificere en molekylær mekanisme for den øgede angiogene switching frekvens i

Arf-

null RIP-tag2 mus, vi analyserede udtryk for et array af angiogenese-relaterede gener ved real-time PCR. Vi imidlertid ikke, identificere eventuelle angiogene regulatoriske gener, der blev overbevisende ændret på transkriptionsniveauet i hele tumorer eller angiogene holme ved tab af ARF (data ikke vist og figur S5A). I lyset af de seneste undersøgelser, som viser en rolle for ARF i ribosom biogenese [29] og i post-transkriptionel kontrol af VEGF udtryk [30], vurderede vi mulige ændringer i VEGF-ekspression på proteinniveauet ved tab af Arf. Selvom VEGF protein niveauer beskedent blev forhøjet i RIP-TAG2 tumorer i

p53

-null genetiske baggrund (35% stigning; p = 0,02), fandt vi, at i denne genetiske sammenhæng, tab af

Arf

resulterede ikke i ændrede niveauer af total VEGF-proteinet (figur S5B). Desuden immunfarvning for VEGF viste ingen tydelige ændringer i VEGF-ekspression /lokalisering i de forskellige præneoplastiske ø læsioner i

ARF

-null RIP-TAG2 mus (Figur S5C). Således er der ingen tegn på, at den fremskyndede angiogenese som følge af tab af ARF indebærer ændring i VEGF biosyntese.

Diskussion

Inaktivering af ARF /p53 pathway er en kritisk begivenhed i de fleste menneskelige kræftformer, der tjener til at løfte begrænsninger på onkogen signalering [31]. Ud over de kanoniske tumor suppressor aktiviteter af p53 i mediering cellecyklusstop, apoptose og senescens, kan p53 også fungere i opretholdelse tumor hviletilstand via suppression af angiogenese [32]. I en etapevis carcinogenese model, hvor p53 er funktionelt inhiberet af SV-40 Tag, viser vi, at p19

Arf kan også modulere angiogenese program, i det mindste delvist via p53-uafhængige mekanismer. Genetisk ablation af

Arf i

RIP-TAG2 mus resulterede i en betydelig acceleration af tumorigenese vej, der var forbundet med en øget hyppighed af holme, der gennemgår en angiogen switch og tidligere tumordannelse. Især blev den hyperproliferative switch ikke påvirket, og heller ikke var spredning /apoptose indeks på noget tidspunkt af vejen til tumordannelse.

På trods af den øgede hyppighed af angiogen switching, vaskulaturen inden de resulterende angiogene læsioner afveg ikke signifikant fænotypisk mellem

RIP-tAG2; Arf

+ /+

ARF

– /- iBooked.dk mus, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser i denne model, hvor ændrede angiogene switchfrekvenser sket uden samtidige ændringer i fartøj morfologi eller tumor celle apoptose /proliferation ved genetisk knockout af MMP-9 [33] eller neutrofil ablation [24]. Fraværet af globale forskelle i graden af ​​neutrofil rekruttering til at pre-angiogene læsioner i

RIP-TAG2; Arf

– /-

forhold til

ARF

+ /+

mus tyder på, at ARF kan modulere angiogenese via en alternativ mekanisme. Men på grund af den multi-fokale og stokastiske natur denne tumormodel, hvor kun ca. 15-20% (baseret på i alt 400 øvævsceller /mus) af hyperplastiske læsioner vil blive “angiogen” (denne frekvens forøges ved blot et par% i

ARF

– /-.

mus) muligheden er, at uopdagede forbigående ændringer i neutrofiler i en lille delmængde af læsioner kunne tegner sig for den øgede forekomst af angiogene skift

Selv om det er i øjeblikket uklart, hvilke specifikke signal (er) driver den indledende rekruttering af inflammatoriske celler og indledningen af ​​angiogene switch, den nuværende paradigme tyder på, at en afbrydelse i balancen mellem endogene pro- og anti-angiogene faktorer er afgørende [34] . Især af de mange p53-uafhængig funktioner af ARF der er blevet beskrevet til dato [8], flere kan forudses at potentielt påvirke den angiogene switch. Især NF-KB og c-myc, som begge har været impliceret i reguleringen af ​​angiogenese via deres virkninger på ekspression af proinflammatoriske mediatorer [35], [36], [37], er blevet identificeret som p53-uafhængig mål af ARF [38], [39]. Derudover nucleolar beslaglæggelse af større inducer af angiogenese, HIF-1α af ARF er blevet påvist at regulere transkriptionelle aktivitet [40]. Endvidere en nylig supplerende undersøgelse af Kawagishi et al. foreslog en p53-uafhængig rolle for ARF i at undertrykke tumorangiogenese via post-transkriptionel kontrol af VEGF-A-ekspression [30]; dog i RIP-tag2 PNET tumorer, VEGF protein niveauer blev ikke signifikant ændret ved tab af Arf. Således har vi udlede, at øget ekspressionsniveauer af VEGF ikke lå til grund for tidligere angiogene skift, selv om vi ikke kan udelukke mulige ændringer i VEGF biotilgængelighed, medieret for eksempel ved øget matrix nedværdigende proteolytisk aktivitet.

En potentiel rolle for ARF i processen med vaskulogenese og /eller angiogenese var tidligere blevet postuleret [8], der hidrører fra påvisningen af, at ARF kan regulere vaskulær udvikling i muse øjne [25], en af ​​de eneste beskrevne funktioner af ARF bort fra tumor suppression. En mekanisme, hvorved tab af ARF forbedrer PDGF signalering, hvilket resulterer i en for stor spredning og akkumulering af Pdgfrβ + perivaskulære celler blev foreslået at forklare den vaskulære defekt resulterer i blindhed i

ARF

– /-

mus. Mens der var ingen målelige ændringer i pericyt akkumulering i vaskulaturen af ​​

RIP-tag2; Arf

– /-

angiogene læsioner, det ikke udelukkes, at den indledende rekruttering af Pdgrβ + perivaskulære celler til neovaskulatur kunne stimuleres enten direkte eller indirekte (fx via sekretion af en endnu at blive identificeret pro-angiogene faktor fra ARF-null præneoplastiske /tumorceller) ved tab af ARF.

Ekspansiv tumor udvikling /vækst kræver ikke blot deregulering af cellevækst og overlevelse signaler, men også indebærer betydelige ændringer i den begyndende tumor mikromiljø. Især dannelsen af ​​en blodforsyning er kritisk for tumorvækst og metastase. Nye beviser tyder på, at onkogener og tumor undertrykkere kan påvirke tumor udvikling, ikke blot via celle-autonome funktioner i reguleringen proliferation /apoptose, men også via direkte modulation af angiogenese regulatorer. Myc oncogen har vist sig at regulere angiogenese via direkte induktion af pro-inflammatoriske mediator, IL-1β, der fremmer MMP aktivering og frigivelse af afsondret VEGF fra den ekstracellulære matrix [41]. Ras, via aktivering af Myc kan aktivere angiogenese via undertrykkelse af angiogenese-inhibitor, thrombospondin-1 [42]. Tilsvarende har tumor suppressor p53 vist sig at have en positiv regulering thrombospondin-1-ekspression [43], [44], samt fremstillingen af ​​de antiangiogene collagen-afledte fragmenter endostatin og tumstatin [45]. Vi heri afdække en rolle for p19

Arf begrænse tumoren angiogene switch, hvilket viser, at tabet af ARF udtryk fremmer angiogene kontakt og fremskynder tumor udvikling via både p53-afhængige og uafhængige mekanismer, i en model for etapevis carcinogenese .