PLoS ONE: nedregulering af IFNg i CD4 + T-celler i lungekræft gennem Hypermethylering: En mulig mekanisme af tumorinduceret Immunosuppression

Abstrakt

Tumor overlevelse er signifikant korreleret med immunresponset af patienterne. IFNg spiller en vigtig rolle i tumoren host reaktion og nedsat IFNg ekspression observeres ofte i lungekræft. Undersøgelser har vist, at CpG ø hypermethylering spiller en kritisk rolle i transkriptionel lyddæmpning af IFNg genekspression. Der er imidlertid begrænset forståelse for de molekylære mekanismer i ændret methylering, og hvorvidt tumormikromiljøet har nogen effekt på DNA-methylering og IFNg produktion. I den aktuelle undersøgelse, vi viser, at plasma og intracellulære IFNg niveauer er signifikant lavere hos patienter med lungecancer. Hypermethylering af IFNy-promotoren i CD4

+ T-celler og plasma IFNg var negativt korreleret. CD4

+ T-celler fra raske individer co-dyrket med SPC-A1-celler genereret lavere niveauer af IFNg Efter aktivering forhøjet ekspression af DNA-methyltransferaser (DNMTs), og udviste hypermethylering af IFNy-promotoren. Afslutningsvis faldt IFNg ekspression af CD4

+ T-celler co-dyrket med lungecancer celle er forbundet med IFNg promoter hypermethylering. Vores undersøgelse tyder på, at interaktionen mellem lungekræft celler og CD4

+ T-celler inducerer DNMT udtryk og IFNy promotor hypermethylering i CD4

+ T-celle, der kan tjene som en vigtig mekanisme af tumor-induceret immunosuppression.

Henvisning: Wang F, Xu J, Zhu Q, Qin X, Cao Y, Lou J, et al. (2013) nedregulering af IFNg i CD4

+ T-celler i lungekræft gennem Hypermethylering: En mulig mekanisme af tumorinduceret Immunsuppression. PLoS ONE 8 (11): e79064. doi: 10,1371 /journal.pone.0079064

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: Juli 2, 2013; Accepteret: September 24, 2013; Udgivet: 11. november 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.371.894, 81.272.324, 81.201.359, 81.101.322), Key Laboratory for Laboratory Medicine i Jiangsu-provinsen i Kina (nr XK201114), et projekt finansieret af Priority Academic Program Udvikling af Jiangsu Higher Education institutioner. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft har en kort 5-års overlevelsesrate da det er vanskeligt at diagnosticere og behandle på et tidligt stadium [1]. Selvom mekanismerne i lungekræft initiering ikke er fuldt forstået, antages det, at tumoren undslipper immunovervågning [2].

Cytokiner er en del af et kompleks immunreaktion, der kan bidrage til udviklingen af ​​cancer, såvel som fjerne det. Der er en tæt sammenhæng mellem tumorprogression og dysregulering af cytokinekspression, som ses for IFNg, TGF-β og IL-17 [3], [4]. Blandt disse cytokiner, IFNg, som blev opdaget i 1965, har ry for at hjælpe vagt over neoplastisk sygdom. IFNg hæmmer spredning, sensibiliserer tumorceller til apoptose, op regulerer MHC klasse I og klasse II-udtryk, og stimulerer antitumor immun aktivitet [5], [6]. Nedsat IFNg serumniveauer er blevet knyttet til kortere overlevelse i lungekræft [7]. Derfor belyse de molekylære mekanismer i IFNg i tumorigenese er kritisk at have en mere klar forståelse af tumor patogenese.

Epigenetisk ændringer såsom histon modifikationer, DNA-methylering og variationer i chromatinstruktur er blevet vist at være vigtigt for den selektive transkription af cytokin-gener i T-celle delmængder. Blandt disse er DNA-methylering blevet undersøgt i vid udstrækning i forhold til cytokin-genekspression [8] – [10]. I denne undersøgelse betragtede vi den inverse korrelation af IFNg ekspression og DNA-methylering i lunge patienter. Endnu vigtigere er, at evaluere, om lungecancerceller kan påvirke status for methylering af immunceller ved nedregulering IFNg ekspression etablerede vi et in vitro trans-brønd dyrkningssystem og derefter undersøgt CpG methylering af IFNy-promotoren i CD4

+ T-celler.

Resultater

IFNg niveauer af raske kontrolpersoner og lungekræftpatienter

ELISA blev anvendt til at påvise plasma IFNg niveauer (fig. 1A). De IFNg niveauer i patienter med lungecancer var signifikant lavere (69,30 ± 38,56 pg /ml) end hos raske kontroller (92,62 ± 34,75 pg /ml,

P

= 0,017).

(A) Sammenligning af plasma IFNg niveauer i studiegrupper. ELISA blev anvendt til måling plasma IFNg niveauer i 30 patienter med lungecancer og 30 raske kontroller. Plasma-IFNg niveauer i patienter og raske kontrolpersoner var 69,30 ± 38,56 pg /ml og 92,62 ± 34,75 pg /ml (*

P

= 0,017). (B) Repræsentative resultater af IFNg ekspression af CD4

+ T-celler fra patienter med lungecancer (n = 2) og raske kontroller (n = 2). (C) Flow cytometri af IFNg niveauer i studiegrupper. Dataene er den enkelte frekvens fra lungecancerpatienter (n = 9) og raske kontroller (n = 9). Vandrette søjler indikerer gruppen betyder. Uafhængige t tests blev anvendt til at beregne

P

værdier (***,

P

0,001).

IFNg primært produceret af CD4

+ -T-celler, men også af NK-celler og CD8

+ T-celler. For at afspejle IFNg ekspression i CD4

+ T-celler, evaluerede vi CD4

+ T-celler ved flowcytometrisk analyse. PBMC’er af 9 patienter med lungecancer og 9 raske kontrolpersoner blev indsamlet og IFNg blev påvist. En lavere hyppighed af IFNg producerer CD4

+ T-celler blev påvist i lungekræftpatienter sammenlignet med raske kontroller (Fig 1B-C, P. 0,001).

IFNy Gene Promotor Methylering er negativt korreleret med IFNg niveauer

CD4

+ T-celler blev isoleret fra PBMC’er fra 11 patienter og 10 kontroller. IFNg gen promotorregioner 526 bp langt blev undersøgt ved bisulfit sekventering PCR. 15 reverse streng-sekvenser af hver prøve blev bedømt for deres methylering profil på CpG sites -295, -186, -54, +122, +128 og 171 i forhold til transkriptionsstartsitet (fig. 2A).

(A) En 526-bp region af IFNy-promotoren blev PCR-amplificeret fra bisulfit behandlede revers streng. Methylerede cytosiner er resistente over for behandling med bisulfit blev scoret fra 15 klonede PCR-sekvenser for den enkelte og er betegnet på genkortet som CpG (firkanter). (B) Gene kort over den methylerede IFNy promotoren i CD4

+ T-celler fra ti raske kontroller. Graden af ​​methylering på hvert CpG websted er afbildet af styrken af ​​skygge. (C), Gene kort over den methylerede IFNy promotoren i CD4

+ T-celler fra 11 forskellige patienter med lungecancer. Graden af ​​methylering på hvert CpG websted er afbildet som beskrevet i B. (D) IFNg methylering af CpG sites i IFNy promotor af CD4

+ T-celler var signifikant forskellig mellem patienter med lungecancer og raske kontrolpersoner. De viste data er procent methylering for hver IFNg promoter CpG site. En Chi-square test kontingenstabel blev brugt til at tildele

P

værdier for patienter med lungecancer vs raske kontrolpersoner. Sammenligninger efter at udføre de nominelle variabler for lungekræftpatienter /raske kontroller og methyleret /methyleret i kontinuerte data for hver CpG websted (fejl barer, SD, *,

P

0,05, **,

P

0,01, ***,

P

0,001). (E) Korrelation analyse for det samlede procent methylering med IFNg plasmakoncentrationer hos patienter med lungecancer. Korrelationen blev analyseret ved Spearmans koefficient.

bisulfit sekvens af IFNy-promotoren fra lungecancerpatienter (n = 165 kloner) viste en signifikant højere grad af methylering på bindingssteder for CpG i forhold til dem i raske kontroller ( n = 150 kloner). Samlet methylering på CpG steder i patienter med lungecancer og raske kontrolpersoner var 85,4% og 71,4%, henholdsvis (

P

0,001) (Tabel 1). Vi sammenlignede den procentdel af specifikke CpG methylering for hver prøve. Det IFNg promotoren af ​​CD4

+ T-celler viste hypermethylering ved 6 bindingssteder for CpG i patienter sammenlignet med raske kontroller (fig. 2B, 2C). Især CpG-methylering ved IFNy-promotoren fra patient CD4

var signifikant højere i positionerne -186, -54, +122, +128 og +171 (p 0,01) + T-celler ved Pearson Chi-square test (Fig . 2D). Blandt disse positioner, opstår transkriptionsfaktorbindingssites på -186, -54, med websteder på 122, 128 proksimalt for transskription startstedet.

For yderligere at vurdere effekten af ​​methylering på IFNg udtryk , vi beregnet korrelationen mellem plasma IFNg koncentration og methylering hos patienter. Plasma IFNg koncentrationer blev negativt korreleret med procent af IFNg promotor methylering i patient CD4

+ T-celler (r = -0,797,

P

= 0,004, Fig. 2E).

Undertrykt IFNg ekspression af CD4

+ T-celle i SPC-A1 Transwell Culture System

Et transwell dyrkningssystem blev anvendt til at undersøge effekten af ​​lungekræft cellelinien SPC-A1 på IFNg ekspression af CD4

+ T-celler (fig. 3A). CD4

+ T-celler isoleret fra Transwell dyrkningssystem med SPC-A1 udviste ringe IFNg produktion efter anti-CD3 stimulering i 6 timer eller 24 timer. I modsætning hertil CD4

+ T-celler dyrket i fravær af SPC-A1 viste en kraftig IFNy respons efter anti-CD3 stimulering i 6 timer eller 24 timer. (

P

0,05;

P

0,05, figur 3B.). Resultater af kvantitativ RT-PCR-analyse viste også, at CD4

+ T celler dyrket i fravær af SPC-A1 viste en kraftig IFNg mRNA ekspression efter anti-CD3 stimulering i 6 timer eller 24 timer, sammenlignet med CD4

+ T-celler co-dyrket med SPC-A1 (

Fold = 2,37, P

0,05;

Fold = 2,37, P.

0,05, figur 3C).

( A) CD4

+ T-celler co-dyrket med SPC-A1. CD4

+ T-celler (6 x 10

5 celler /brønd) og SPC-A1 (2 × 10

5 celler /brønd) blev dyrket adskilt af en 0,4 um porestørrelse insert i 24-brønds dyrkningsplader . SPC-A1-celler blev dyrket i de ydre brønde og CD4

+ T-celler blev dyrket i suspension i de indre brønde. (B) Produktion af IFNg i CD4

+ T-celler dyrket med eller uden SPC-A1. Supernatanter blev opsamlet efter anti-CD3 eller CD28 stimulation for 6 eller 24 timer, og IFNg detekteret ved ELISA. Resultaterne er fra forsøg udført på CD4

+ T-celler fra 6 raske frivillige (fejlmargener, SD). (C) Kvantitativ RT-PCR-analyse af IFNg transkripter fra CD4

+ T-celler dyrket med eller uden SPC-A1. RNA blev isoleret efter anti-CD3 eller CD28-stimulering i 6 eller 24 timer. Resultaterne er fra forsøg udført på CD4

+ T-celler fra 6 raske frivillige. IFNg niveauer steg 2,37 gange når stimuleres i 6 timer i CD4

+ T-celler dyrket uden SPC-A1 sammenlignet med CD4

+ T celler dyrket med SPC-A1.

Hypermethylering status den IFNg promotor i CD4

+ T-celler co-dyrket med SPC-A1

status methylering af IFNy promotor i CD4

+ T-celler dyrket med og uden SPC-A1 celler blev evalueret. Promotoren viste hypermethylering efter co-dyrket med SPC-A1-celler (n = 90 kloner), viste en skarp kontrast til CD4

+ T-celler dyrket uden SPC-A1-celler (n = 90 kloner). Procentdelen af ​​bindingssteder for CpG i CD4

+ T-celler dyrket med eller uden SPC-A1 var 85,4% og 70,9%, henholdsvis. Antallet af methylerede og ikke-methylerede sites blev scoret og Chi-square-analyse blev anvendt til at evaluere p-værdier (***,

P

0,001) (tabel 2). Vi derefter sammenlignet procenten af ​​specifikke CpG methylering for hver gruppe (fig. 4A, B). Procentdelen methylering ved IFNy-promotoren var 80,0% -95,5% og 64,4% -78,9%, med og uden SPC-A1 co-kultur, hhv. CpG sites ved positionerne -295, -186, -54, +128 og +171, i særdeleshed vises signifikante forskelle (fig. 4C).

(A), Gene kort over den methylerede IFNy promotoren i CD4

+ T-celler dyrket uden SPC-A1 fra 6 raske frivillige. Graden af ​​methylering på hvert CpG websted er afbildet af styrken af ​​skygge. (B) Gene kort over hypermethyleret IFNy promotoren i CD4

+ T-celler dyrket med SPC-A1 fra 6 raske frivillige. Graden af ​​methylering på hvert CpG websted er afbildet af styrken af ​​skygge. (C) Methylering af CpG sites i IFNy-promotoren var signifikant forskellig mellem CD4

+ T-celler dyrket med eller uden SPC-A1-celler. Graf sammenfatter procent af methylerede CpG websted observeret ved hvert analyseret position. IFNg promotor viser hypermethylering blandt CD4

+ T-celler dyrket med SPC-A1 celler sammenlignet med CD4

+ T-celler dyrket uden SPC-A1 celler. Chi-square test kontingenstabel blev brugt til at tildele

P

værdier. Sammenligning af CD4

+ T-celler dyrket med SPC-A1 celler vs CD4

+ T-celler dyrket uden SPC-A1-celler (fejl barer, SD,

*

P

0,05;

**

P

0,01). (D) Total RNA-ekstraktion og kvantitativ RT-PCR blev udført for at kvantificere DNMT1 og DNMT3b mRNA-niveauer. MRNA-niveauerne blev normaliseret for p-actin. De blev vist at være forholdet mellem CD4

+ T-celler dyrket med eller uden SPC-A1 celler, fra tre uafhængige forsøg, udtrykt som middelværdi ± SD.

DNMT1 og DNMT3b mRNA-niveauer i CD4

+ T-celler dyrket med SPC-A1 celler op reguleret i forhold til CD4

+ T-celler dyrket alene (DNMT1 fold = 2,7,

P

0,05; DNMT3b fold = 2.2,

P

. 0,05)

diskussion

Et klarere billede af det dynamiske forhold mellem værtens immunsystem og tumorvækst fremstår som cellerne og molekyler, deltage i den naturlige anti-tumor immunrespons bliver identificeret [11], [12]. Host immunsystem aktivering ved IFNg er afgørende for et anti-tumor respons. Nylig undersøgelse viste, at IFNg er afgørende for tumor overvågning af immunsystemet, og at der var en høj korrelation mellem IFNg produktion og tumorregression under immunterapi [5]. Mus, som mangler eller mangelfuld i IFNg receptorer eller STAT1 udviklede tumorer hurtigere, og havde en højere tumor frekvens end vildtypemus efter en udfordring med methylcholanthren [13], [14].

Det er velkendt, at cytokinekspression styres via et netværk af transkriptionsfaktorer og epigenetiske modifikationer [15] – [18]. Humane undersøgelser har vist, at IFNy produktion i voksen perifert blod og navlestrengsblod er reguleret af CpG methylering på steder inden eller ved siden af ​​IFNy promotor i CD4

+ /CD45RO

– T-celler [19], [20]. Derudover er blevet foreslået en rolle for IFNg promotor-methylering i atopisk syndrom [21], som pegede på methylering som en mekanisme til styring af ekspression. Bronkial astma patienter udviser hypermethylering af IFNy-genet i CD4

+ T-celler efter udsættelse for allergen, som korreleret med aftagende IFNg ekspression [22], [23]. Lignende fund er også blevet rapporteret i PBMC’er fra akut-on-kronisk hepatitis B leversvigt og kolon kræftpatienter [24], [25]. Alle disse observationer tyder DNA methylering er en vigtig epigenetisk mekanisme, der involverer i IFNg udtryk regulering.

I vores undersøgelse, vi observerede nedsat niveau af plasma IFNg og intracellulær IFNy i CD4

+ T-celler af lungekræft patienter. Disse resultater antyder, at IFNg udtrykte lavere i lungekræft. En akkumulerende mængde beviser har impliceret CpG methylering af IFNy promotor som en vigtig negativ transkriptionel regulator af IFNg produktion i humane T-celler [26], [27]. I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt bisulfit sekventering for at bestemme status for methylering CpG for IFNg promotoren. En signifikant negativ korrelation mellem IFNg plasmaniveauer og total IFNy promotor methylering i CD4

+ T-celler af lungekræftpatienter blev observeret. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse tyder på, at IFNy-promotor-methylering kan påvirke IFNg ekspression i lungekræft. Vores resultater er i overensstemmelse med resultaterne, at epigenetisk methylering status IFNg den kan spille en afgørende rolle i at modulere slimhinde cytokinsekretion [28] og i bronchiale astmapatienter [22].

Vi sammenlignede også status methylering af flere CpG websteder. I lungekræftpatienter, fem af seks CpG sites (-295, -186, -54, 122, 128, 171) analyserede var signifikant hypermethyleret (den eneste undtagelse var websted -295). Især graden af ​​methylering steget fremtrædende på 122, og 128, hvilket tyder på et tæt forhold til IFNg udtryk. Vi fandt en fremtrædende stigning i graden af ​​methylering ved positionerne -295, -186, -54, +128 og 171 (uden at ændre på sted +122) i CD4

+ T-celler co-dyrket med den lungeadenocarcinom celle line SPC-A1. Især graden af ​​methylering steg tydeligt ved positionerne -54, 128, og 171. Dette resultat viste en lille forskel fra den observeret hos patienter med lungecancer resultat, som eksistensen af ​​miljø varians mellem in vitro og in vivo tilstand.

Der er stor interesse i bedre forståelse af det molekylære mekanismer, der fører til ændret methylering af den IFNg genpromotoren under tumorigenese [29], [30]. Indtil for nylig var der få data om hvorvidt lungecancerceller virker direkte på immunceller at inducere hypermethylering af IFNy-promotoren. I vores forskning, hypermethyleringen status i CD4

+ T-celler i patienter med lungecancer antyder, at tilstedeværelsen af ​​kræftceller kan bidrage til en ændret ekspression profil. Salg

mikromiljøer spiller en kritisk rolle i tumorudvikling hvor immun resistente tumor varianter er valgt [31]. Tumorafledte opløselige faktorer IMPEL forskellige mekanismer for at undslippe immunangreb i tumormikromiljøet [32], [33]. I transwell dyrkning anvendte system her, fandt vi tydelige forskelle i epigenetisk regulering af IFNy promotor mellem CD4

+ T-celler fra raske individer dyrket med og uden SPC-A1. Resultatet af IFNg promotor methylering af CpG sites demonstrerede hypermethylering lignede den, der observeres i CD4

+ T-celler fra patienter med lungecancer (85,4% vs. 85,4%), hvilket frembragte lavere niveauer af IFNg ved aktivering. Interessant, Janson et al havde rapporteret, at tumor-infiltrerende CD4

+ T-celler blev uhensigtsmæssigt hypermethyleret hos patienter med tyktarmskræft [34].

SPC-A1 celler kunne fungere på CD4

+ T celler raske frivillige at inducere hypermethylering uden direkte kontakt, hvilket antyder tilstedeværelsen af ​​en opløselig, ikke-kontakt afhængige mikro-faktor (er). Undersøgelser har vist, at DNA-methylering katalyseres af DNMTs, herunder bevarelse methyltransferase DNMT1 der virker på hemi-methylerede substrater at opretholde methyleringsmønstre efter DNA-replikation [35], [36]. Derudover er der de de novo methyltransferaser DNMT3a og DNMT3b som katalyserer methylering af umethyleret DNA [37], [38]. Ændringer i DNMT ekspression korrelerer med ændringer i genomisk DNA-methylering, og er godt beskrevet i mange cancere [39] – [44]. Ved undersøgelse af DNMT udtryk mønstre i vores model, observerede vi en markant stigning i DNMT1 og DNMT3b mRNA-ekspression i CD4

+ T-celler dyrket med SPC-A1 celler. Derfor vi spekuleret på, at opløselige, lysmønstre afhængige faktorer kan inducere hypermethylering af IFNy-promotoren ved at stimulere DNA methyltransferase aktivitet, som derefter nedregulere IFNg sekretion. Disse faktorer kan være cytokiner, nukleinsyrer eller microRNA’er udskilles eller afledt af lungekræft celler [45] – [47]. Dog vil der være behov, yderligere forskning bekræfter denne hypotese. Disse in vitro resultater antyder, at promotor-methylering kan påvirke IFNg ekspression i patienter med lungecancer. Methylering medieret IFNg fald kan drage fordel tumor overlevelse og ændre balancen af ​​tumor-immunitet i retning tumorprogression.

Vi har tidligere vist, at nedsat ekspression af tumorsuppressorgener er forbundet med afvigende CpG ø metylering i gen-promotorregioner i lungen kræftpatienter, og dette udtryk kunne genoprettes ved demethylering [48]. Dette antydede, at demethylering som medieres af 5-aza-dC kan tjene som en nyttig fremgangsmåde til behandling af lungecancer [48] – [50]. Derfor behandling af lungekræft gennem demethylering, hvilket øger ekspression af ikke blot tumorsuppressorgener, men også af cytokin-gener, såsom IFNg, hjælpe med at beskytte mod tumorer.

Afslutningsvis IFNg promotor methylering er forbundet med nedsat IFNg ekspression i patienter med lungecancer. Samspillet mellem lungekræft celler og CD4

+ T-celler inducerer hypermethylering af IFNy promotor i CD4

+ T-celler, der tjener som en mekanisme af tumor-induceret immunosuppression.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Udvalget for den etiske af Behandling af personmotiver af First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University (Permit nummer: 20A6-2869), og en skriftlig informeret samtykke blev også opnået fra hver deltager.

Udvælgelse af lungekræftpatienter og raske kontrolpersoner

lungekræftpatienter (N = 30) og raske voksne (N = 30), var fra den første tilknyttede hospital af Nanjing Medical University (Nanjing, Kina). Lungekræftpatienter blev diagnosticeret som karcinom ved patologisk diagnose. Patienter, der fik præoperativ kemoterapi, strålebehandling eller operation før indsamlingen blodprøve var blevet udelukket. De detaljerede kliniske data (herunder alder, køn, rygevaner) blev opnået fra hver objektets journaler og anført i tabel 3. Blandt patienter med lungecancer, var der 24 tilfælde af adenocarcinom, 2 tilfælde af pladecarcinom, 2 tilfælde af alveolær celle karcinom og 2 tilfælde af dårligt differentieret karcinom.

blodprøve Indsamling og behandling

Veneblod (10 ml) med EDTA-K

2 blev indsamlet fra raske kontrolpersoner og lunge kræftpatienter før operation. Plasma blev separeret og opbevaret ved -70 ° C før måling IFNg. Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev separeret ved Ficoll-Hypaque densitetsgradientcentrifugering (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). CD4

+ T-celler blev isoleret fra PBMC’er ved anvendelse af et CD4-positive isolation kit (Dynal, Oslo, Norge). Renheden af ​​isolerede CD4

+ T-celler blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse PE-konjugeret anti-CD4 (Beckman, Marseille, Frankrig). CD4

+ T-celler blev derefter opsamlet til dna-ekstraktion, bisulfit modifikation, og sekventering.

cellelinier og dyrkningsbetingelser

Den humane NSCLC cellelinie SPC-A1 blev købt fra den kinesiske Academy of Sciences i Shanghai, og dyrket i 5% CO

2 i RPMI 1640 med 2 mmol /l L-glutamin, 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), penicillin G (50 U /ml ) og streptomycin (50 ug /ml).

CD4

+ T-celler co-dyrket i Transwell dyrkningssystem

Transwell eksperimenter blev udført i plader med 24 brønde med porestørrelse 0,4 um (Corning Costar, Corning, NY, USA). SPC-A1-celler (2 x 10

5) blev dyrket i de ydre brønde i plader med 24 brønde i 1640-medium suppleret med 10% humant AB-serum. CD4

+ T-celler (6 x 10

5) adskilt fra raske voksne blev sat ind i de indre brønde i samme medium. Som vist i fig. 3, kontrolgrupper blev etableret med CD4

+ T-celler, der vokser i de indre brønde uden SPC-A1 celler. Efter 5 dages dyrkning CD4

+ T-celler blev vasket, og 1 x 10

6 celler blev opsamlet til DNA-ekstraktion, mens de resterende blev overført til 96-brønds dyrkningsplader. 5 × 10

4 celler /brønd blev stimuleret med 1 ug /ml opløseligt anti-CD3 (eBioscience, San Diego, CA, USA) og 1 ug /ml opløseligt anti-CD28 (eBioscience) (i et samlet volumen på 200 pi) i 6 eller 24 timer. Efter stimulering blev supernatanter opsamlet til IFNg påvisning ved ELISA, CD4

+ T-celler blev indsamlet til IFNg mRNA analyse.

ELISA

IFNg niveauer i kultursupernatanter og plasma blev bestemt ved ELISA (R IFN-γ-revers, 5′-TGT CTT CCT TGA TGG TCT CCA CAC-3 ‘; DNMT1-forward, 5’-GAT CGA ATT CAT GCC GGC GCG TAC CGC CCC AG-3 ‘; DNMT1-revers, 5’-ATG GTG GTT TGC CTG GTG C-3 ‘; DNMT3b-forward, 5’-CCT GCT GAA TTA CTC ACG CCC C-3 ‘; DNMT3b-reverse, 5’-GTC TGT GTA GTG CAC AGG AAA GCC-3 ‘; β-actin-forward, 5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 ‘; β-actin-reverse, 5’-CTA AGT CAT AGT CCG FTT AGA AGC A-3 ‘. Ct-værdier blev normaliseret til ekspression i CD4

+ T-celler ved anvendelse af 2

-ΔΔCt fremgangsmåde og β-actin som husholdning genet. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og resultater fra tre uafhængige forsøg blev gennemsnit.

DNA Isolation og Methylering Analyse

Methylering analyse blev udført ved hjælp af bisulfit sekventering. Genomisk DNA af CD4

+ T-celler blev isoleret ved anvendelse QIAamp Mini Kit (Qiagen) som anbefalet af producenten. DNA’et blev bisulfit omdannet hjælp CpGenome ™ DNA modifikation Kit (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) ifølge producentens instruktioner. Primerne anvendt til at amplificere IFNy-promotoren var: IFNg-forward, 5′-TGT GAA TGA AGA GTT AAT ATT TTA TTA-3 ‘; IFNg-revers, 5’-TTG GTA GTA ATA GTT AAG AGA ATT TA-3 ‘[19]. PCR-produkter blev dannet ved anvendelse af bisulfit-behandlet DNA som template.

Den mest fremtrædende PCR bånd blev separeret på 2% agarosegelelektroforese og oprenset ved gel-ekstraktion (Qiagen), behandlet med TA-kloning under anvendelse af DNA-hale (Takara) og sekventeret på et ABI 3730 (Applied Biosystems). Alle operationer blev udført af GeneScript Corporation (en sino-Amerika joint venture, Nanjing, Kina). Sekvenser blev analyseret af bioinformatik software kulørtheder Version 1.45 (Technelysium, South Brisbane, Australien).

Statistisk analyse

Alle data blev analyseret ved hjælp af SPSS 16,0 software (IBM, Chicago, IL, USA). Uafhængige t-tests blev anvendt til at sammenligne plasma IFNg niveauer og intracellulære forskelle mellem patienter og raske kontroller. Dataene er opsummeret som middel ± SD. Methylering forskelle i IFNg promotoren mellem forskellige grupper blev vurderet ved anvendelse af en Pearson Chi-square test.

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Tak

Vi er taknemmelige for den tekniske support fra National Key Clinical Institut for Laboratory Medicine i Jiangsu-provinsen Hospital.