PLoS ONE: Interleukin-23 Letter kræft i skjoldbruskkirtlen Cell Migration og Invasion Ved at hæmme SOCS4 Expression via MicroRNA-25

abstrakt

Interleukin-23 (IL-23) er en konventionel proinflammatorisk cytokin, der spiller en rolle i tumorudvikling ved at inducere inflammation i tumormikromiljøet. Men fortsat uklart, hvilken rolle af IL-23 i migration kræft i skjoldbruskkirtlen og invasion. I den foreliggende undersøgelse, observerede vi, at behandlingen med IL-23, inducerede migration og invasion i humane skjoldbruskkirtel cancerceller. Yderligere data viser, at

SOCS4

negativt regulerer IL-23-medieret migration og invasion. På undersøge de mekanismer, der er involveret i IL-23 medieret migration og invasion, vi observeret, at miR-25 fremmer migration og invasion af kræft i skjoldbruskkirtlen celler ved direkte binding til 3′-UTR af

SOCS4 Hoteller, som fører til hæmning af

SOCS4

. Derudover har vi også vist, at IL-23 øger miR-25-ekspressionsniveauer, og overudtrykt miR-25 er involveret i IL-23-associerede

SOCS4

hæmning og celle migration og invasion. Sammen vores data tyder på, at IL-23 inducerer migration og invasion i skjoldbruskkirtlen kræftceller ved at mediere miR-25 /

SOCS4

signalvejen

Henvisning:. Mei Z, Chen S, Chen C Xiao B, Li F, Wang Y, et al. (2015) Interleukin-23 Letter kræft i skjoldbruskkirtlen Cell Migration og Invasion ved at hæmme

SOCS4

Expression via MicroRNA-25. PLoS ONE 10 (10): e0139456. doi: 10,1371 /journal.pone.0139456

Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institut, KINA

Modtaget: 19. juni 2015; Accepteret: 12. september 2015; Udgivet: 5 oktober 2015

Copyright: © 2015 Mei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (No.81372880); den uafhængige forskningsprojekt af Wuhan University (nr 2042014kf0184; NO 2042014kf0119.); ph.d.-programmet for videregående Research Fund uddannelse (nr 20130141120093; No. 20110141110062); Natural Science Foundation i Hubei-provinsen (No.2012FFA045). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i skjoldbruskkirtlen er en almindelig form for endokrine malignitet, der har vist en hurtig stigning i verdensomspændende forekomst i de seneste årtier [1]. Trods forbedringer i terapeutiske strategier, nogle patienter er vanskelige at behandle og udvikle invasion og metastase [2]. Derfor er det vigtigt at identificere de molekylære mekanismer, der ligger kræft i skjoldbruskkirtlen invasion og metastase. Nylige rapporter vist, at inflammation er en stærk promotor for carcinogenese og malignitet i mange former for cancer [3,4]. Inflammation synes at være en vigtig mediator for udviklingen af ​​cancer og giver kræftcellerne et gæstfrit mikromiljø [5]. Interleukin-23 (IL-23), et heterodimert type 1 cytokin sammensat af IL-12 /p40-underenheden og den specifikke p19-underenheden, hører til interleukin-6 superfamilien [6]. Tidligere undersøgelser har vist, at IL-23 er forbundet med carcinogenese samt inflammation. Høje niveauer af IL-23 blev fundet i humant hepatocellulært carcinom, colorektalt carcinom, pladecarcinom, og esophageal carcinoma [7-10]. Noget tyder på, at IL-23 overekspression kan fremkalde metastaser i kolorektal, lunge-, og oral cancer [7-10].

De undertrykkere af cytokin signalering (SOCS) er vigtige negativ feedback regulatorer af cytokin signalering [11]. De SOCS-proteinerne er en familie af 8 proteiner (SOCS1-7 og et cytokin-inducerbart SH2-holdigt protein eller CIS). Hver SOCS protein indeholder en central SH2 domæne der interagerer med phosphorylerede tyrosiner [12]. SOCS proteiner er for nylig blevet undersøgt for deres rolle i udviklingen af ​​forskellige cancere [13-18]. Men lidt er kendt om den rolle, SOCS4 i karcinom, og deres mulige indflydelse på tumorvækst og malignitet.

MikroRNA’er (miRNA) er en art af små ikke-kodende enkeltstrengede RNA, som spiller en vigtig rolle i udviklingen af forskellige cancere ved binding af 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af målrettede gener [19]. Afvigende miRNA udtryk er også blevet hyppigt rapporteret i adskillige tumorer [20]. I de seneste år, flere beviser tyder på en rolle for miRNA i tumorcellelinier biologiske processer, herunder celleproliferation, differentiering, migration og invasion [21]. MicroRNA-25 hører til MIR-106b-25 klynge, der omfatter MIR-106b, MIR-93, og MIR-25. MicroRNA-25 er blevet rapporteret at være afvigende overudtrykt i flere tumorer, såsom ovariecancer, lungecancer, mavecancer, og kolorektal cancer [22-26]. Selvom ekspressionen af ​​MIR-25 i forskellige tumorer er blevet beskrevet, en klar rolle for MIR-25 i thyreoideakarcinom fortsat uklar.

I denne undersøgelse viser vi, at IL-23 fremmer kræft i skjoldbruskkirtlen cellemigration og invasion . Vi demonstrerer endvidere, at IL-23 regulerer migration og invasion af skjoldbruskkirtlen kræftceller via en miR-25 /SOCS4 signalvejen.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke til deltagelse i undersøgelsen. Undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-deklarationen og godkendt af Institutional Review Board af Remin Hospital i Wuhan University, i overensstemmelse med sine retningslinjer for beskyttelse af forsøgspersoner.

Prøver og sager

Skjoldbruskkirtel væv blev indsamlet ved Remin Hospital i Wuhan University perioden februar 2010 til februar 2014. Vævsprøver blev skåret i to dele, den ene blev gennemgået af to ekspertgrupper patologer at kontrollere histologiske diagnose, den anden straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i flydende nitrogen indtil RNA-ekstraktion. Ingen af ​​patienterne havde modtaget nogen præoperativ behandling. Tumorer blev iscenesat i henhold til den amerikanske Blandede Cancer (AJCC) patologisk tumor-node-metastaser (TNM) classiication. De karakteristiske træk ved patienter er beskrevet i S1 og S2 Tables.

Cell kultur

Menneskelig kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer K1 (papillær) og WRO (follikulær) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco BRL), 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycinsulfat. Celler blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Alle disse cellelinjer blev oprindelig købt fra celle bank af det kinesiske Academy of Science, Shanghai

Reagenser

Rekombinant human IL-23 (rhIL-23) blev købt fra R . D Systems ( Minneapolis, MN). Monoklonale antistoffer (Abs) mod human SOCS4 og GAPDH blev erhvervet fra Sigma (St. Louis, MO). Kemisk syntetiseret miRNA efterligner og miRNA-hæmmere blev købt fra Ambion (Austin, TX, USA). TRIzol, Lipfectamine-2000 enzymblanding blev indkøbt fra Invitrogen (Basel, Schweiz).

Kvantitativ realtids-PCR

Kvantitativ realtids-PCR-analyse blev udført for at bestemme modne miRNA og mRNA-niveauer. Til kvantitativ modne microRNA’er detektion blev Total miRNA isoleret under anvendelse af en Mirvana miRNA isolation kit (Ambion) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA (2 ug) blev reversetranscribed med Bulge-Loop modne miRNA-specifikke reverse transskriptionsprimere (Ambion) og Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase (Promega). Kvantitativ realtids-PCR-baserede kvantificering af miRNA blev udført under anvendelse af miRNA-analyse kits (Ambion) ifølge producentens instruktioner. Niveauerne af miRNA blev normaliseret til de af den interne kontrol U6 snRNA. For at detektere cellulære mRNA’er, blev totalt RNA isoleret ved anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Basel, Schweiz). Cellulære RNA-prøver blev revers-transkriberet under anvendelse af vilkårlige primere. Real-time PCR blev udført under anvendelse af en LightCycler 480 (Roche) og SYBR Green systemet (Applied Biosystems). GAPDH blev forstærket som en intern kontrol. Primere anvendt denne undersøgelse er anført i S3 Bord og SYBR grønne produkter verificeret ved sekventering.

Transwell assay

Cell migration og invasion assay blev udført som tidligere [27] beskrevet. Kort beskrevet blev celler behandlet enten med 50 ng /mL rhIL-23 eller BSA-puffer kontrol for beskrevne tid og dosis og iagttaget i overensstemmelse hermed. Det gennemsnitlige antal trækkende og invaderende celler blev udtrykt som en procentdel i forhold til kontrollen, der blev betegnet som 100%.

Sårlukning assay

Et sår blev indført på sammenflydende monolag celler ved hjælp en mikropipettespids. Fotografier blev taget ved 40 x forstørrelse ved hjælp af fasekontrastmikroskopi umiddelbart efter sår incision og på udvalgte tidspunkter. Sårlukning blev målt ved at beregne pixel tæthed i sårområdet ved Cella software (Olympus Biosystem Gmb, Hamburg, Tyskland) og udtrykt som procent af sår lukning af tredobbelte områder ± SD.

MTT assay

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay blev anvendt i evalueringen af ​​celleproliferation. Celler blev podet i plader med 96 brønde ved 5 x 10

3 celler /brønd. Fireogtyve timer senere blev MTT-assay udført. Endelig blev den optiske densitet bestemmes ved 570 nm under anvendelse af ELISA-pladelæser (Model 550; Bio-Rad). blev sikret mindst tre uafhængige forsøg.

Transfektion og luciferase reporter assay Salg

Celler blev podet på 24-brønds eller 6-brønds skåle, afhængig af eksperimentet, og blev dyrket til sammenløbet nå ca. 80-90% på tidspunktet for transfektion. Celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten. En Renilla luciferase reporter vektor pRL-TK blev anvendt som intern kontrol. Luciferase-assays blev udført med en dobbelt-specifik luciferse (Promega, Madison, WI). Ildflueluciferase aktiviteter blev normaliseret på grundlag af Renilla luciferaseaktiviteter. Alle reporter assays blev gentaget mindst tre gange. De viste data var middelværdier ± SD fra et repræsentativt eksperiment.

RNA-interferens

SOCS4 shRNA og irrelevant shRNA kontrol (shRNA-kontrol) blev købt fra GenePharma (GenePharma, Shanghai) og udarbejdet af ligation af de tilsvarende par af oligonukleotider til PGPU6 /GFP /Neo. Målsekvensen kan findes i S4 tabel.

Western blot-analyse

helcellelysater blev fremstillet ved lysere celler med PBS pH 7,4 indeholdende 0,01% Triton X-100, 0,01% EDTA, og 10% protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af Bradford-assayet (Bio-Rad). Polypeptiderne fra cellelysater adskiltes på SDS-12% polyacrylamidgeler tværbundet med N, N -methylenebisacylamide og overført elektrisk til nitrocellulosemembraner (Millipore, Billerica, MA). Ikke-specifik binding blev blokeret med 5% mælk i PBST før tilsætning primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse. Peberrodsperoxidase-koblet anti-kanin- og anti-muse-antistoffer (Sigma, St. Louis, MO) blev anvendt som sekundære antistoffer. Proteinniveauer blev kvantificeret ved scanning blots på en gel Doc EZ imager (Bio-Rad) og analyse med Mængde One 1D billedanalysesoftware 4.4.0 (Bio-Rad)

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism 5 software (GraphPad software, La Jolla, CA, USA). Parametriske og parametriske data blev analyseret ved anvendelse af en to-halet t-test og Mann-Whitney U test hhv. En værdi på P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse. eller middel ± SEM

Resultater

IL-23 fremmer migration og invasion af thyreoidea cancerceller

Vi ønskede at teste virkningen af ​​IL-23 på celleproliferation af skjoldbruskkirtel kræftceller for at observere, hvis celledeling forstyrrer migration og invasion kapacitet af cellerne. MTT-analysen viste, at spredningen af ​​K1-celler og WRO celler næppe påvirket af enhver dosis af IL-23 (S1 Fig). Derefter undersøgte vi, om IL-23 kan påvirke migration og invasionen af ​​skjoldbruskkirtlen kræftceller. Forbedret bevægelse og invasion af K1-celler blev påvist i nærvær af 50 og 100 ng /ml IL-23 (fig 1A og 1B). Ligeledes blev øget migration og invasion også detekteret så tidligt som 48 timer (h) efter behandling med 50 ng /ml IL-23-protein (figur 1C og 1D). Vi påviste også, at IL-23 forøgede migration og invasion af WRO celler på en dosis- og tidsafhængig måde (S2 Fig). Desuden sårheling assay viser også, at IL-23 forøgede migration af K1-celler (Fig 1E og 1F). Tilsammen bekræfter disse resultater den dosis- og tidsafhængige promigratory og proinvasive virkning af IL-23.

(A) K1-celler blev behandlet med rhIL-23 i 48 timer ved de angivne koncentrationer, efterfulgt af dyrkning i et trans-brønd-system i 24 timer. (B) celleinvasion assay blev udført med K1-celler, der blev behandlet som i (A). (C) K1-celler blev behandlet med en koncentration på 50 ng /ml rhlL-23 for de angivne tidspunkter, efterfulgt af dyrkning i et trans-brønd-system i 24 timer. (D) Forsøgene blev udført som i (C) for celleinvasion assay. (E) K1-celler blev behandlet med rhIL-23 i 48 timer ved de angivne koncentrationer, efterfulgt af indføring af et sår. Cellemigrering ind i såret blev overvåget ved 24 timer. (F) K1-celler blev behandlet med en koncentration på 50 ng /ml rhlL-23 for de angivne tidspunkter, efterfulgt af indføring af et sår. Cellemigrering ind i såret blev overvåget ved 24 timer. Sårlukning blev målt ved at beregne pixel tætheder i sårområdet og udtrykt som procent af sårlukning af tredobbelte områder ± standardafvigelser i Transwell migration, invasion og sårheling assay data udtrykt i procent af kontrollen. Data repræsenterer gennemsnit ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

IL-23 inducerer migration og invasion af kræft i skjoldbruskkirtlen celler gennem

SOCS4

for at identificere den rolle IL-23 i ekspressionen af ​​SOCS4 blev K1-celler stimuleret med IL-23-protein i 24 timer ved en koncentration på 50 ng /ml. De undertrykkere af cytokin signalering (

SOCS4

) mRNA og protein blev opdaget af real-time PCR og western blot hhv. Resultaterne viste, at IL-23 undertrykte

SOCS4

mRNA og proteinekspression i K1-celler (fig 2A). Lignende resultater blev også opnået i WRO cellelinje (figur 2B). For at bestemme om SOCS4 deltager i IL-23-medieret migration og invasion af skjoldbruskkirtlen cancerceller konstruerede vi 4 human SOCS4-specifikke korte hårnål RNA (shRNA). Real-time PCR-resultater viste, at # 2 shRNA plasmider markant kunne inhibere ekspressionen af ​​SOCS4 i K1-celler, mens de øvrige shRNA plasmider havde ringe effekt på ekspressionen af ​​SOCS4 (Fig 2C). SOCS4 protein niveauer viste en lignende tendens, som bestemt ved Western blot (Fig 2D). I celle migration eksperimenter, overekspression af

SOCS4

hæmmede IL-23-induceret migration i K1-celler (Fig 2E). Omvendt knockdown af

SOCS4

udtryk forbedret IL-23-induceret migration i K1-celler (Fig 2F). De grader af induktion blev korreleret med effektiviteten af ​​

SOCS4

knockdown af hver shRNA plasmid (Fig 2F). Lignende resultater blev opnået med Transwell invasion eksperimenter (fig 2G og 2H). Da SOCS4 negativt regulerer migration, vi næste analyseret rolle SOCS4 i cellen spredning af kræft i skjoldbruskkirtlen celler. Resultater fra MTT-analysen viste, at spredningen af ​​K1-celler næppe påvirket af ekspression af SOCS4. Desuden overekspression eller Knockdown af SOCS4 og behandling med IL-23 kunne ikke påvirke celleproliferation af skjoldbruskkirtlen cancerceller (S3 Fig). Disse resultater antyder, at aktivering af IL-23-reguleret migration og invasion kan kræve SOCS4.

(A) K1-celler blev behandlet med 50 ng /ml rhlL-23 i 48 timer.

SOCS4

RNA-niveauer blev kvantificeret ved QRT-PCR (venstre felt) og proteinet niveauer af SOCS4 blev påvist ved western blot (højre panel). (B) Forsøg med WRO celler blev udført som i A. (C, D) K1-celler blev transficeret med forskellige

SOCS4

shRNA (shRNA # 1, shRNA # 2, shRNA # 3 og shRNA # 4) eller shCtrl som mock. Efter 48 timer,

SOCS4

mRNA-niveauer blev målt ved QRT-PCR (C) og western blot (D). (E) K1-celler blev transficeret med den angivne plasmid, derefter behandlet med rhIL-23 (50 ng /ml) i 48 timer og fik lov til at migrere til serum i 24 timer (øverste panel). Proteinniveauer af SOCS4 blev påvist ved western blot (nederste panel). (F) celler blev transficeret med indikeret shRNA-SOCS4 og forsøgene blev udført som i (E). (G, H) De celle invasion assay blev udført under lignende betingelser som beskrevet i (E) og (F). I realtid RT-PCR-forsøg, blev kontrollen betegnet som 1. Alle forsøg blev gentaget mindst 3 gange med lignende resultater. Bar grafer repræsenterer gennemsnit ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

MicroRNA-25 nedregulerer

SOCS4

udtryk ved direkte at målrette sin 3′-UTR

for at analysere de miRNA, der kan målrette 3′-UTR af

SOCS4

, vi brugte 3 online databaser, TargetScanHuman, miRDB, og miRWalk2.0, for at søge efter muligheder kandidater. Fjorten af ​​de fælles potentielle miRNA blev fundet i de 3 databaser. For at bestemme virkningen af ​​de forudsagte miRNA på ekspressionen af ​​

SOCS4

,

SOCS4

3′-UTR blev klonet i en ildflueluciferase reporterplasmid. Luciferaseaktiviteten assays indikerede, at 6 miRNA inhiberede SOCS4 luciferaseaktivitet under 50% i forhold til MIR-Ctrl (S4A Fig). Derefter undersøgte vi, hvilke miRNA blev aktiveret med IL-23-induceret migration og invasion. K1-celler blev behandlet med IL-23-protein ved 50 ng /ml i 48 timer. Resultater fra real-time PCR viste, at blandt de miRNA, der kunne dæmpe

SOCS4

luciferaseaktivitet, udtryk for miR-25 var signifikant induceret (s4b Fig).

Fra vores data, vi hypotese, at mIR-25 kan spille en rolle i IL-23 /SOCS4 signalvejen. Vi undersøgte derefter, om miR-25 regulerer

SOCS4

udtryk med post-transkriptionel målretning af 3′-UTR. En særskilt mutation blev genereret i 3′-UTR af

SOCS4 dele på forudsagte frø-matchende sites til at teste samspillet mellem miR-25 og

SOCS4

3′-UTR (figur 3A). Transient transfektion af K1-celler med vildtype (WT)

SOCS4

3′-UTR, og MIR-25 mimic, fører til et signifikant fald i reporter aktivitet sammenlignet med den for MIR-kontrol (Fig 3B ). Dette fænomen blev afbrudt, når de samme cellelinier blev transfekteret med

SOCS4

3′-UTR mutanter (fig 3B). MIR-25 inhibitor (miR-25-Inh) signifikant stimulerede luciferaseaktiviteten af ​​WT

SOCS4

3′-UTR, uden nogen effekt på Mut

SOCS4

3′-UTR i K1 celler (fig 3C). MicroRNA-25 overekspression i K1-celler undertrykte signifikant både mRNA og protein niveauer af SOCS4 (fig 3D). Omvendt miR-25 hæmmer-medieret knockdown af endogen miR-25 steg

SOCS4

mRNA og protein-ekspression i K1-celler (Fig 3E). For at bestemme hvorvidt MIR-25-medieret nedregulering af

SOCS4

ekspression er et fælles træk i skjoldbruskkirtlen cancerceller, blev lignende eksperimenter udført i WRO celler (fig 3F og 3G). Sammen disse resultater tyder på, at SOCS4 er et mål for miR-25 i K1-celler og WRO celler.

(A) Sekvenserne af MIR-25 bindingssteder i det menneskelige

SOCS4

3 ‘ UTR’er og den skematiske reporterkonstruktioner. I dette panel, WT repræsenterer reporter konstruktioner indeholdende hele 3’UTR sekvenser af

SOCS4

.

SOCS4

-MUT repræsenterer reporter konstruktioner indeholdende muterede nukleotider. (B, C) K1-celler blev co-transficeret med enten WT eller MUT

SOCS4

3’UTR reporter plasmider og enten MIR-25 mimic (B) eller MIR-25 inhibitor (C). Luciferaseaktiviteter blev målt efter 48 timer under anvendelse af en dual-luciferase assay kit og normaliseret til Renilla luciferase. (D) K1-celler blev transficeret med MIR-25 efterligner eller kontrol i 48 timer.

SOCS4

mRNA (venstre panel) og protein (højre panel) blev påvist ved QRT-PCR og western blot, henholdsvis. (E) Celler blev transficeret med MIR-25 inhibitor eller kontrol og forsøgene blev udført som i D. (F, G) WRO celler blev udnyttet, og eksperimenter blev udført som i D og E. Alle forsøgene blev gentaget mindst 3 gange med lignende resultater. Bar grafer repræsenterer gennemsnit ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

MicroRNA-25 fremmer motilitet skjoldbruskkirtlen kræftceller ved at målrette

SOCS4

Siden miR-25 kan undertrykke

SOCS4

udtryk ved sekvens-specifik binding til dets 3′-UTR, vi hypotese, at miR-25 kan påvirke migration og invasion af kræft i skjoldbruskkirtlen via SOCS4. For at teste hypotesen, K1 celler blev cotransficeret med

SOCS4

ekspressionsvektor (eller tom vektor) og miR-25 efterligner (eller miR-Ctrl). Transwell migration analyser viser, at miR-25 fremmer migration af K1-celler og celle migration fremkaldt af miR-25 vendes ved

SOCS4

overekspression (Fig 4A). Derudover observerede vi, at knockdown af

SOCS4

signifikant kan forøge virkningen af ​​MIR-25 cell migration (Fig 4B). Lignende resultater blev opnået i invasionen assays og sårheling assay (Fig 4C-4F). Virkningen af ​​MIR-25 /SOCS4 signalvejen for migration af skjoldbruskkirtlen cancerceller blev yderligere evalueret under anvendelse af MIR-25 inhibitor. Som vist i fig 4G, MIR-25 inhibitor inhiberer signifikant migrationen af ​​K1-celler. Derudover MIR-25-inhibitoren og

SOCS4

ekspressionsvektor synergistisk inhiberer migreringen af ​​K1-celler (Fig 4G). Omvendt høje niveauer af migration var til stede i K1-celler, når

SOCS4

blev slået ned af shRNA-SOCS4 # 2 (fig 4H). Lignende resultater blev også opnået i invasion assays og sårheling assay (Fig 4I-4L). Disse resultater antyder, at inhibering af

SOCS4

ekspression er ansvarlig for evnen af ​​MIR-25 for at fremme celleinvasion og migration.

(A, B) K1-celler blev co-transficeret med indikeret mIR-RNA mimic og plasmid (A) eller shRNA (B) i 48 timer og fik lov til at migrere til serum i 24 timer. (C, D) Cell invasion assay blev udført med de samme betingelser som i A og B. (E, F) Sårheling assay blev udført med de samme betingelser som i A og B. (G, H) Celler blev transficeret med miR-25 hæmmer eller kontrol og forsøgene blev udført som i A og B. (i, J) Cell invasion assay blev udført med de samme betingelser som i G og H. (K, L) sårheling assay eksperimenter blev udført med de samme betingelser som i G og H. Bar grafer repræsenterer gennemsnit ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

IL-23 stimulerer miR- 25 ekspression i skjoldbruskkirtlen cancerceller

for at identificere den rolle IL-23 i ekspressionen af ​​mIR-25, blev K1-celler stimuleret med humant IL-23-protein ved forskellige koncentrationer i 48 timer. MikroRNA-25 niveauer blev opdaget af real-time PCR. Resultater viser, at MIR-25 niveauer opreguleres af IL-23-protein på en dosis-afhængig måde (figur 5A). Konsekvent blev K1-celler behandlet med IL-23-protein på forskellige tidspunkter, ved en koncentration på 50 ng /ml. Resultater fra realtids-PCR-analyser viser, at MIR-25 niveauer stige i takt med tid stiger (figur 5B). Rollen af ​​IL-23 på MIR-25 ekspression blev bekræftet ved at gentage forsøg under anvendelse WRO celler (Fig 5C og 5D). Disse resultater antyder, at IL-23 aktiverer MIR-25-ekspression.

MicroRNA-25 niveauer blev kvantificeret ved realtids-PCR og blev udført forsøgene som beskrevet i fig 1. Ekspressionsniveauerne blev normaliseret til U6 snRNA. Data repræsenterer gennemsnit ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05)

MicroRNA-25 spiller en vigtig rolle i IL-23-medieret

SOCS4.

hæmning og celle migration og invasion

for at definere den rolle, miR-25 i nedregulering af IL-23-medieret

SOCS4

udtryk, K1-celler blev transficeret med enten miR-25 efterligner eller mIR-Ctrl og behandlet med eller uden IL-23-protein i 48 timer. Resultater fra realtids-PCR og western blot-analyser viser, at transfektion med MIR-25 efterligner forøger IL-23-medieret inhibering af

SOCS4

mRNA og proteinekspression (fig 6A). I modsætning hertil høje niveauer af

SOCS4

mRNA og protein er til stede i K1-celler, når ekspressionen af ​​MIR-25 inhiberes af MIR-25 inhibitor (fig 6B). Vi undersøgte også, om MIR-25 er involveret i IL-23-medieret thyreoideacancer cellelinje motilitet. Brug Transwell migration og invasion assays, viste vi, at miR-25 overekspression stimulerer IL-23-medieret aktivering af migration og invasion (Fig 6C og 6D), og knockdown af miR-25 udtryk hæmmer IL-23-medieret aktivering af migration og invasion (fig 6E og 6F). Lignende resultater blev også opnået i sårheling assay (Fig 6G og 6H) .Taken sammen viser disse data, at MIR-25 er den nøglekomponent involveret i IL-23-medieret kræft i skjoldbruskkirtlen cellemigration og invasion gennem inhibering af

SOCS4

ekspression.

(A) K1-celler blev transficeret med den angivne plasmid, derefter behandlet med rhIL-23 (50 ng /ml) i 48 timer. SOCS4 mRNA (venstre panel) og protein (højre panel) blev påvist ved QRT-PCR og western blot, henholdsvis. (B) Celler blev transficeret med MIR-25 inhibitor eller kontrol, og forsøgene blev udført som i A. (C, D) K1-celler blev transficeret med MIR-25 mimic (C) eller inhibitor (D) og kontroller, derefter behandlet med rhIL-23 (50 ng /ml) i 48 timer og fik lov til at migrere til serum i 24 timer. (E, F) Cell invasion assay blev udført med de samme betingelser som i C og D. (G, H) sårheling assay blev udført med de samme betingelser som i C og D. Alle forsøgene blev gentaget mindst tre gange med lignende resultater. Bar grafer repræsenterer gennemsnit ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05)

Udtrykket af IL-23, miR-25 og

SOCS4

i skjoldbruskkirtlen kræft væv

for at validere rolle IL-23, miR-25 og

SOCS4

i kræft i skjoldbruskkirtlen, ekspression af IL-23, miR-25 og SOCS4 blev analyseret i 35 par af klinisk PTC, 26 par af klinisk FTC og 22 normal thyroid prøver. Som vist i S5A-S5C Fig ekspressionen af ​​

SOCS4

var lavere og ekspressionsniveauet af IL-23 og MIR-25 var højere i PTC og FTC prøver end normal thyroid prøver. Desuden blev høje niveauer af IL-23 korreleret med høje niveauer af MIR-25 (S5D Fig). Interessant, lave niveauer af

SOCS4

udtryk blev korreleret med høje niveauer af IL-23 og miR-25-ekspression i PTC og FTC prøver (S5E og S5F Fig). Disse observationer antyder kraftigt, at ændringer af IL-23, miR-25 og SOCS4 udtryk kunne være involveret i kræft i skjoldbruskkirtlen progression.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi definerede en ny signalvej impliceret i bekæmpelse af kræft i skjoldbruskkirtlen cellemigration og invasion. Først, vi viste, at IL-23 opreguleret miR-25-ekspression samt nedreguleret

SOCS4

udtryk i kræft i skjoldbruskkirtlen celle migration og invasion. Endvidere viste vi også, at miR-25 fremmer kræft i skjoldbruskkirtlen celle migration og invasion ved at målrette SOCS4. Endelig vores data antyder, at MIR-25 er involveret i IL-23-associeret

SOCS4

ekspression og cellemigration og invasion.

Tumor cellevandring og invasion er en meget kompliceret proces, hvor kræft celler spredes fra den primære tumor, overleve i kredsløbet og vokse i fjerne steder i kroppen [28]. Hver proces bestemmes af migration og invasion evne tumorcellerne og den lokale tumor mikromiljø, der giver et gunstigt miljø for tumorceller at overleve og metastaserer [29]. Nylige undersøgelser har vist, at høj ekspression af niveauer af IL-23, der kan påvises i mikromiljø, kunne bidrage til at lette tumor metastase. For eksempel IL-23 fremmer hepatocellulært carcinom metastase af NF-KB-opreguleret MMP9-ekspression [9]. IL-23 er højt udtrykt i metastaser-associerede astrocytter, og IL-23 inducerer progressionen af ​​melanom hjernemetastaser [8]. IL-23 spiller en central rolle i udviklingen af ​​esophageal cancer via en epitel-mesenkymale overgang [7]. IL-23 kan forøge proliferation og invasion af colorektale carcinomaceller [10]. Imidlertid er stadig ukendt rolle af IL-23 i kræft i skjoldbruskkirtlen cellemigrering og invasion. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at påvise de direkte virkninger af IL-23 på migration og invasion af skjoldbruskkirtlen cancerceller. Interessant, en nylig undersøgelse viste, at IL-23 regulerer proliferation af lungecancerceller [30]. Ikke desto mindre, i modsætning til lungekræft celler, vi fandt ikke beviser til støtte, at IL-23 inducerer spredning af kræft i skjoldbruskkirtlen celler (S1 Fig). Vi spekulere, at der kan være visse iboende forskelle mellem kræft i skjoldbruskkirtlen og lungekræft. På den anden side, IL-23 fremmer migration og invasion af skjoldbruskkirtlen kræftceller.

I øjeblikket har to rapporter indebar potentielle rolle SOCS4 i kræft. Et studie Anvendes dobbelt kombination array analyse at bevise, at SOCS4 er en hidtil ukendt gastrisk cancer suppressor gen [31]. Den anden undersøgelse sammenlignede udtrykket forskelle

SOCS1-7

mellem brystkræft væv og baggrund brystvæv [32]. Høj udtryk for

SOCS4

er signifikant associeret med en tidligere tumor stadie og et bedre klinisk resultat i human brystcancer [32]. I denne undersøgelse har vi observeret, at niveauet af SOCS4 er nedsat hos IL-23-induceret migration og invasion af skjoldbruskkirtlen cancerceller (fig 2). Behandling med IL-23 resulterede i reducerede ekspressionsniveauer af

SOCS4

i skjoldbruskkirtlen cancerceller (fig 2). Gennem overekspression og Knockdown eksperimenter, vi viser, at

SOCS4

negativt regulerer IL-23-induceret migration og invasion (figur 2). For nylig har flere undersøgelser vist bevis for, at SOCS familien har en stærk tumor undertrykke rolle i flere typer af faste og hæmatologiske tumorer [32,33].