PLoS ONE: Flotillin2 Expression korrelerer med HER2 Niveauer og dårlig prognose i Gastric Cancer

Abstrakt

Målsætning

Flotillin genet er kendt som en tumor promotor eller suppressor, afhængigt af tumor type eller tumor scene. Vi havde til formål at undersøge den kliniske betydning af flotillin2 proteinekspression i mavekræft.

Metoder

Vi undersøgte flotillin2 og erbB2 niveauer i væv microarray af 282 gastrisk kræft prøver og analyseret sammenhængen mellem flotillin2 niveauer, clinicopathologic faktorer og prognose. Reguleringen af ​​erbB2 ved flotillin2 blev undersøgt med flotillin2 siRNA-transficerede gastriske kræftceller.

Resultater

Flotillin2 delvist co-lokaliserede med erbB2 på plasmamembranen som påvist ved konfokal mikroskopi, niveauer af erbB2 blev reduceret efter flotillin knockdown i SGC-7901 kræftceller, og udtryk for flotillin2 var positivt korreleret med den af ​​erbB2. I ikke-neoplastisk maveslimhinden blev flotillin2 ikke udtrykkes i epitel rum. I gastrisk cancer, blev positiv farvning af flotillin2 vist i 129 (45,7%) af 282 tilfælde, også blev det signifikant associeret med en Lauren kvalitet, histologiske type, lymphovascular invasion og tumor placering. Desuden viste overlevelse analyse, flotillin2 ekspression var en uafhængig prognostisk faktor ringe overlevelse (p 0,001).

Konklusioner Salg

Disse resultater indikerer, at der eksisterer en positiv sammenhæng mellem flotillin2 og erbB2 ekspressionsniveauer, flotillin2 måske involveret i stabiliseringen af ​​erbB2 på plasmamembranen, er flotillin2 signifikant korreleret med kræft progression og dårlig prognose i mavekræft

Henvisning:. Zhu Z, Wang J, Sun Z, Sun X, Wang Z, Xu H (2013) Flotillin2 Expression korrelerer med HER2 Niveauer og dårlig prognose i Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (5): e62365. doi: 10,1371 /journal.pone.0062365

Redaktør: Joseph Najbauer, University of Pécs Medical School, Ungarn

Modtaget: Februar 15, 2013; Accepteret: 20 Mar 2013; Udgivet: Maj 2, 2013 |

Copyright: © 2013 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81272718), Young Scholars ‘forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (20122104120008) og fond for videnskabelig forskning af det første hospital i Kina Medical University (FSFH1208). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mange plasma membranproteiner er kendt for at være involveret i celledeling, celleadhæsion, celle motilitet og tumorceller invasion, der tegner sig for mere end to tredjedele af aktuelt kendte lægemiddelkandidater. Cellemembranen og tilknyttede proteiner er af væsentlig interesse med hensyn til forskellige aspekter af tumor, fra kræftfremkaldende og metastatiske mekanismer til molekylær diagnostik og terapi [1]. Flotillins er forbundet med vesikuløse invaginationer af plasmamembranen, og fungerer som regulatorer af signaltransduktion [2]. Blandt flotillin familiemedlemmer, der er to forskellige flotillin gener (flotillin1 og 2), flotillin2 proteinekspression er blevet rapporteret i nogle menneskelige kræftceller og tumorprøver [3], [4], [5], [6]. Da flotillin2 direkte interagerer med signalmolekyler såsom receptorer, kinaser, adhæsionsmolekyler og G-proteiner, det virker som en tumor modulator gennem regulering af celledeling, differentiering, apoptose, vedhæftning og invasion [4].

Overekspression af erbB2 (human epidermal vækstfaktor receptor 2), også kendt som HER2, er membranassocieret tyrosinkinase, der kan føre til aktivering af cellulære signaltransduktionssystemer, hvilket resulterer i cellulær transformation og celleproliferation begivenheder associeret med cancer, såsom bryst- cancer, ovariecancer og gastrisk cancer [7], [8], [9]. Højt ekspressionsniveau af erbB2 er blevet signifikant korreleret med øget tumorinvasion, metastase, modstandsdygtighed over for kemoterapi og dårlig prognose af patienterne [10]. Nylige undersøgelser viste, at flotillin2 protein, blandt andre funktioner, var involveret i endocytiske mekanismer og cellulære trafficking processer, og viste sig at være i et molekylært kompleks med erbB2 [11]. For at forstå, om stabilisering af erbB2 på plasmamembranen medieres af flotillin2 og deres kliniske betydning, vi udført sammenlignende membran proteomisk analyse af menneskets mavekræft.

I denne undersøgelse beskriver vi flotillin2 og erbB2 ekspressionsniveauerne er positivt korreleret på celleniveau samt i gastrisk kræftvæv, og vi viser, at erbB2 internaliseres og nedbrydes af en mekanisme på flotillin2 udtynding. Desuden blev clinicopathologic betydning af flotillin2 evalueres yderligere hjælp arkivering vævsprøver og statistiske analyser. Vi fandt, at flotillin2 er en uafhængigt prognostisk faktor, også en potentiel hidtil ukendt biomarkør for lymfeknudemetastaser. Vore data vil lette forståelsen af ​​gastrisk kræft carcinogenese og minedrift biomarkører for diagnosticering og behandling af denne sygdom.

Materialer og metoder

vævsprøver og opfølgning

A i alt 282 patienter, som havde opereret for mavekræft mellem januar 2006 og december 2009 Første tilknyttede hospital i Kina medicinske universitet blev udvalgt til denne undersøgelse. Alle patienter-afledte prøver blev indsamlet og arkiveret under protokoller godkendt af Institutional Review Boards i Første tilknyttet Hospital China Medical University. Diagnosen blev bekræftet ved mindst to patologer og iscenesættelse var baseret på patologiske fund i henhold til det 7. amerikanske Blandede Udvalg om Cancer retningslinjer. Median opfølgning var 51 (spændvidde, 5-78) måneder.

De 282 patienter, som gennemgik gastroctomy blev udsat for at lukke klinisk observation, herunder bryst og abdominal CT-scanning, CEA-niveau, og blodprøver på 2 til 3 måneders mellemrum og en årlig gastroskopi. Samlet overlevelse (OS) satser blev defineret som intervallet fra den indledende operation til klinisk eller radiologisk bevist tilbagefald eller metastaser og død, hhv. Datoen ende af opfølgende undersøgelse til udførelse af analysen var 29 juni blev 2012.

Etik erklæring

Etisk godkendelse til denne forskning fås fra Research Ethics Committee of China Medical University, Kina. Alle patienter, der leverer tumorvæv samt normale gastrisk vævsprøver underskrevet en samtykkeerklæring før kirurgisk fjernelse af gastrisk karcinom at give mulighed for denne forskning, der skal gennemføres.

TMA byggeri og immunhistokemi

Hematoxylin og eosin (H 0,05) blev derefter anbragt i den multivariate analyse. HR med 95% konfidensinterval (CI) blev målt til at estimere faren risiko for individuelle faktorer. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Analyser blev udført ved hjælp af SPSS statistisk software programversion 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultater

Udtryk for flotillin2 og erbB2 i mavekræft

Farvede sektioner af væv microarrays (TMA) på 282 væv borekerner blev gradueret til deres cytoplasmatisk immunhistokemisk farvning intensitet mod flotillin2 og erbB2 protein. De 282 læsbare prøver omfattede 282 gastrisk karcinom, 181 peri-carcinom og 101 prøver af normalt gastrisk epitel væv. Tumorceller viste typiske diffus membran farvning af flotillin2 kan findes i gastrisk karcinom (figur 1a) med den tilsvarende placering af erbB2 (figur 1b), i ikke-neoplastiske maveslimhinden, flotillin2 og erbB2 blev begge ikke udtrykkes. Positiv farvning af flotillin2 blev vist i 129 (45,7%) af 282 prøver, erbB2 var 59 (20,9%). Amplifikation af erbB2-genet blev bestemt ved tofarvet FISH af xenografter i nøgne mus. ErbB2-gen-amplifikation i en klynge mønster (rød) blev observeret i MGC-803, BGC-823 og SGC-7901 celler, erbB2 overekspression kun i human SGC-7901 gastrisk cancer celle (Figur 2a-c).

repræsentativt protein ekspression af (a) flotillin2 og (B) erbB2 i et væv microarray kerne blev taget fra en gastrisk carcinom. SGC-7901 gastriske cancerceller blev farvet med anti-erbB2, anti-flotillin2 antistof henholdsvis blev den farvede antistof visualiseret ved TRITC /FITC-konjugeret ged anti-mus IgG-antistof, og objektglassene blev derefter undersøgt ved et konfokalt laserscanningsmikroskop. TRITC (erbB2) vises som rød (C), FITC (flotillin2) som grøn (D), og sammenfletningen af ​​grøn og rød bliver gul (E).

Forstærkning af HER2 genet blev bestemt ved FISH. Amplifikation af HER2 genet i en klynge mønster (rød) blev observeret i (A) MGC-803, (B) BGC-823 og (C) SGC-7901 gastrisk cancerceller, HER2 overekspression i humant SGC-7901 celle. (D) Western blot-analyse og (E) Kvantitativ realtids-PCR blev tilgået for erbB2 og flotillin2 i SGC-7901-cellelinje efter knockdown af flotillin-2. Udtrykket status flotillin2 er meget overensstemmende med den af ​​erbB2, siRNA var blank vektor, β-Actin blev anvendt som intern kontrol.

associeringsaftalen mellem De udtryk for flotillin2 med erbB2

Vi analyserede den cellulære lokalisering af erbB2 og flotillins i SGC-7901 mavekræft celle. Vi kunne vise ved konfokal mikroskopi, der flotillin2 delvis co-lokalisere med erbB2 på plasmamembranen (fig 1a-e). Vores data viser, at ekspressionen af ​​flotillin2 gøre har en signifikant korrelation med den af ​​erbB2 (p 0,001) i den immunhistokemiske væv array analyse (tabel 1). Desuden kunne interaktion mellem flotillins og erbB2 påvises ved immunoblot (figur 2d) og kvalitet RT-PCR-forsøg (figur 2e), vælte af endogen flotillin2 resulterede i at trække ned i ErbB2. Vi analyserede næste virkningen af ​​flotillins på internalisering og efterfølgende nedbrydning af erbB2. Som beskrevet nedenfor, erbB2 og HER2 har også mange relationer klinisk-patologiske faktorer til fælles.

associering mellem flotillin2 og klinisk-patologiske faktorer

I denne undersøgelse, 282 gastric cancer patienter med tilstrækkelige primære tumorer materialer og opfølgning tid var til rådighed, hvis væv blev indsamlet i løbet af de sidste 6 år. Tabel 2 gav den beskrivende statistik for parametre målt for disse patienter. Den mediane varighed af opfølgning var 54 måneder (interval 9-78 måneder). Det 5-års samlet overlevelse (OS) sats var 48,2%

Vi fandt, at øget ekspression af flotillin2 og erbB2 blev begge signifikant associeret med histologiske type (p 0,001 henholdsvis)., Lauren kvalitet (p 0,001, henholdsvis) og Lymphovascular invasion (p = 0,059 og p 0,001, tabel 2). Desuden blev flotillin2 signifikant korreleret med tumorstørrelse (p = 0,006), T fase (p = 0,001) og lymfeknudemetastaser (p = 0,033, tabel 2). Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem flotillin2 udtryk og andre parametre, herunder alder, køn, placering, makroskopisk type og hepatisk metastaser.

Angivelse af flotillin2 i forhold til prognose

Brug Cox ‘proportionale farer regression model blev de univariate forhold mellem tumor egenskaber og patienternes resultat opnået (tabel 3). Af de 282 patienter analyseret, var statistisk signifikante forskelle i OS set med et dårligt resultat for patienter med højere farvning af flotillin2 og erbB2. Andre prædiktive faktorer, der viste sig at være korreleret med OS var alder (P = 0,042), størrelse (P = 0,001), makroskopisk type (P = 0,001), pT (P 0,001) og pN fase (P 0,001) (tabel 3). Brug log-rank test, var der betydelige forskelle i OS mellem positive og negative patienter af flotillin2 og erbB2 (P 0,001 henholdsvis) i alle patienter blev vist i Figur 3.

(A) Patienter med en erbB2 -positiv tumor viste en væsentligt kortere overlevelse periode efter operationen, end dem med en erbB2-negativ tumor (p = 0,014). (B) Patienter med flotillin2-positiv tumor viste det værste resultat. Høj flotillin-2 og erbB2 udtryk er signifikant korreleret med dårlig patient resultat (p 0,001).

Cox multivariat proportional-hazard regressionsmodel blev derefter anvendt til at bestemme, hvilke faktorer var fællesskab prsedikativ af OS. Variabler, som blev anset for at være af betydning i univariat analyse blev inkluderet i analysen. Betydningen, reguleret for andre co-variates, blev givet i tabel 4. Multivariate analyse af den kombinerede virkning af flotillin2 og erbB2 med andre prognostiske faktorer viste, at pT (P 0,001) og pN fase (P 0,001) flotillin2 (HR = 1,485, 95% CI: 1,278-1,725, P 0,001) var en bedre uafhængigt prognostisk markør end erbB2 (HR = 1,375, 95% CI: 1,133-1,947 P = 0,004) til OS (tabel 4)

diskussion

vurderingen af ​​biologiske prognostiske faktorer er af klinisk betydning, især for en sygdom med dårligt resultat, såsom mavekræft. Den foreliggende undersøgelse bekræftede konstitutiv ekspression af flotillin2 i gastrisk cancer vævsprøver og cellelinier, vi fandt også, at flotillin2 var en uafhængig dårlig prognostisk faktor af den samlede overlevelse af gastrisk kræftpatienter. Desuden viste denne undersøgelse, for første gang, en positiv sammenhæng mellem de udtryk for flotillin2 og HER2 i mavekræft. I den tidligere undersøgelse, Pust et al. (2012) fandt, at brystkræft cellelinier afledt fra fjernmetastaser viste en højere grad af flotillin mRNA og protein udtryk end dem, der stammer fra primær gastrisk cancer. Således de forklarede rolle flotillin2 som vævs- og scene-specifikke tumor modulator, hvor det fungerer som en inhibitor eller promotor tumor dannelse og progression afhængigt af dens protein interaktion partnere såsom vækstfaktorreceptorer eller celleadhæsionsmolekyler [11] . Vores resultater er enige i denne beskrivelse, fordi flotillin2 udtryk i nærværende undersøgelse var positivt korreleret med HER2 udtryk, som var positivt korreleret med dårlig prognose i mavekræft.

Data fra to nylige publikationer indikerer, at flotillin har en funktionel rolle i receptortyrosinkinase signalering, især i aktiveringen af ​​MAP-kinase signalering og regulering af FGF-signalering i HeLa-celler [16], [17]. I SKBR3 brystkræftceller, det resultat, at Akt fosforylering reduceres ved udtømning af flotillin-2, men ikke efter flotillin-1 knockdown, aftalt med vores data. Således kan receptortyrosinkinaser eller receptortyrosinkinase-medierede signaleringsveje reguleres ved flotillins på forskellig måde og /eller i en celletype-specifik måde, er det muligt, at de forskellige signalveje udløst af erbB2 reguleres ved enten flotillin2. Alligevel de reducerede erbB2 niveauer udløst af flotillin2 knockdown støtte vores hypotese om en flotillin2-medieret stabilisering af erbB2.

ErbB2 vides at være associeret med dårlig prognose i gastrisk cancer, er flotillins blevet beskrevet at være associeret med tumor tilblivelse. Vi viste, at flotillin2 co-lokaliseret med erbB2 på plasmamembranen og spiller en funktionel rolle i reguleringen af ​​erbB2 i mavekræft. Høj ekspression af flotillin2 er forbundet med dårlig prognose og nedsat overlevelse tid, og det viser sig som en potentiel forudsigelse af tilbagefald i gastrisk cancer. Det er blevet rapporteret, at østrogen-receptorer var involveret i gastrisk carcinogenese og flotillin2 interagerer med receptorerne [18], [19], hvilket indikerer en betydelig indvirkning på flotillin2 funktionen på gastrisk udvikling af kræft. På den anden side, baseret på vores væv microarray undersøgelser, flotillin2 overekspression var stærkt forbundet med øget cellevandring og malign transformation, der fører til lymfekirtelinvolvering og øget invasionsevne. I vores undersøgelse, forhøjet flotillin2 og HER2 begge viste en signifikant sammenhæng med histologiske type (P 0,001 begge), Lauren bedømmelse (P 0,001 begge), mens flotillin2 også få en høj relevans med T fase (P 0,001) og lymfeknude metastase (P = 0,033). Denne stærke korrelation antyder, at flotillin2 kan anvendes som biomarkør for at identificere undergrupper af patienter med gastrisk cancer med en mere aggressiv fænotype. Den multivariate analyse viste flotillin2 tjener som en bedre prognostisk markør til at forudsige risikoen for metastaser og tilbagefald (HR = 1,485, 95% CI: 1,278-1,725) end Her2 (HR = 1,375, 95% CI: 1,133-1,947) til OS. Vi foreslår, at flotillin2 overekspression kan bidrage til øget spredning og udvikling af gastrisk kræft.

Som konklusion, dette er den første demonstration af en positiv korrelation mellem flotillin2 og erbB2 niveauer i dyrkede gastrisk kræftceller samt i væv. Desuden flotillin2 ekspressionsniveau korrelerer med dårlig prognose i gastrisk cancer, hvilket indikerer, at flotillin2 kan være en prognostisk biomarkør for mavekræft. Det har vist sig, at erbB2-overudtrykkende tumorer er mere tilbøjelige til at være resistente over for behandling med et antistof-baserede (trastuzumab /Herceptin) terapi, som er blevet den kliniske first-line behandling hos patienter med erbB2-overekspression metastatisk gastrisk cancer [20] , [21]. Men selv i kombination med andre kemoterapeutiske medikamenter, mere end 20% af patienter med erbB2-overekspression udviser ingen reaktion på behandlingen. Således ved at målrette flotillin2 udtryk, kan der udvikles nye strategier i kræftbehandling.