PLoS ONE: IGFBP3 Methylering er en ny diagnostisk og Intelligent Biomarkør i kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund og Formål

Afvigende hypermethylering af kræftrelaterede gener har vist sig som en lovende strategi for udvikling af diagnostiske, prognostiske og prædiktive biomarkører i human cancer, herunder kolorektal cancer ( CRC). Formålet med denne undersøgelse var at foretage en systematisk og omfattende analyse af et panel af CRC-specifikke gener som potentielle diagnostiske, prognostiske og prædiktive biomarkører i et stort, populationsbaseret CRC kohorte.

Patienter og metoder

Methylering status for de

SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4 og miR137

gener blev undersøgt ved kvantitativ bisulfit pyrosekventering i en populationsbaseret kohorte af 425 CRC patienter.

Resultater

methylering niveauer af alle gener analyserede var signifikant højere i tumorvæv sammenlignet med normal slimhinde (p 0,0001); dog var cancer-associeret hypermethylering hyppigst observeret for

miR137

(86,7%) og

IGFBP3 Hotel (83%) i CRC patienter. Methyleringsanalyse anvendes en kombination af disse to gener påvist størst nøjagtighed til identifikation af colon tumorer (sensitivitet 95,5%; specificitet 90,5%). Lave niveauer af

IGFBP3

promotor methylering opstod som en selvstændig risikofaktor for forudsigelse dårlig sygdomsfri overlevelse i fase II og III CRC patienter (HR = 0,49, 95% CI: 0,28 til 0,85, p = 0,01). Vores resultater antyder også, at fase II III CRC patienter med høje niveauer af

IGFBP3

methylering ikke gavn af adjuverende 5FU kemoterapi.

Konklusion

Ved at analysere et stort, populationsbaseret CRC kohorte, vi demonstrere de potentielle kliniske betydning af

miR137

IGFBP3

hypermethylering som lovende diagnostiske biomarkører i CRC. Vores data viste også, at

IGFBP3 hyper

methylering kan fungere som en uafhængig prognostisk og prædiktiv biomarkør i fase II og III CRC patienter

Henvisning:. Perez-Carbonell L, Balaguer F, Toiyama Y, Egoavil C, Rojas E, Guarinos C, et al. (2014)

IGFBP3

Methylering er en ny diagnostisk og Intelligent Biomarkør i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (8): e104285. doi: 10,1371 /journal.pone.0104285

Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA

Modtaget: April 4, 2014 Accepteret: 7 jul 2014; Udgivet: 15 August, 2014

Copyright: © 2014 Perez-Carbonell et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Den nuværende arbejde blev støttet af tilskud R01 CA72851 og CA181572 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health og midler fra Baylor Research Institute. Lucia Perez-Carbonell er en modtager af en 2012 ph.d.-bevilling fra Fundación Alfonso Martín Escudero. Francesc Balaguer er modtager af et tilskud fra Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). CIBEREHD er finansieret af Instituto de Salud Carlos III. Carla Guarinos er modtager af et tilskud fra Generalitat Valenciana (Vali + D ACIF /2010/018). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ajay Goel er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i de vestlige lande, og er den anden førende årsag til kræft dødsfald hos voksne [1]. Akkumulerende data viser, at epigenetiske ændringer spiller en væsentlig rolle i patogenesen af ​​CRC. Afvigende DNA methylering repræsenterer en af ​​de mest undersøgte epigenetiske ændringer, og det er velkendt, at tumorsuppressorgener ofte tavse af methylering af CpG øer, der almindeligvis bor i 5 ‘regioner på ca. halvdelen af ​​alle menneskelige gener [2], [3 ], [4]. Transkriptionel silencing af tumorsuppressorgener er opstået som et vigtigt skridt i den trinvise proces med kolorektal carcinogenese. Epigenetiske ændringer, især DNA hypermethylering, kan anvendes til tidlig påvisning af præmaligne læsioner, herunder adenomatøse polypper i colon, og er til stede i de ikke-neoplastiske væv støder op til adenomatøse polypper og kræft i tyktarmen [5], [6] . Ud over deres anvendelse som diagnostiske biomarkører, epigenetiske ændringer viser lovende som determinanter for kræft prognose samt biomarkører for svar på specifikke kemoterapi [7], [8].

I CRC, systematiske genom-dækkende tilgange har identificeret flere gener, der viser tumor-specifikke promotor hypermethylering der potentielt kan udvikles til klinisk relevante diagnostiske, prognostiske og prædiktive biomarkører. I forbindelse med CRC, har flere sådanne biomarkører for nylig blevet beskrevet som potentielt lovende diagnostiske biomarkører, herunder:

SEPT9

(Septin 9), et medlem af septin familien involveret i cytokinese og cellecykluskontrol [9], [10], [11];

ALX4

(homeobox protein aristaless-like 4), en transskription faktor involveret i kraniet og udvikling lemmer [12], [13];

TWIST1

(Twist homolog 1), en antiapoptotisk og pro-metastatisk transskription faktor [14], [15];

IGFBP3

(Insulin-lignende dyrket faktor bindende protein 3), et medlem af insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein familie [16];

GAS7

(vækst anholdelse-specifikke 7), som spiller en formodet rolle i neuronal udvikling [17], [18]; og

miR137

, en ikke-kodende microRNA som er indlejret i en CpG ø [17], [19], [20], [21]. Men til dato, ingen af ​​disse methylering markører har gennemgået en systematisk validering i en stor kohorte af CRC patienter til fuldt ud at fastslå deres potentiale som klinisk anvendelige diagnostiske, prognostiske eller prædiktive biomarkører. Derfor har vi til formål at udforske den diagnostiske, prognostiske og prædiktive værdi af

SEPT9, TWIST1, ALX4, IGFBP3, GAS7

, og

miR137

promotor hypermethylering i et stort, godt karakteriseret, populationsbaseret CRC kohorte. Derudover undersøgte vi associationer mellem status methylering af individuelle markører og deres kombination med de klinisk-patologiske funktioner i disse primære CRC’er, og for første gang rapport,

IGFBP3

hypermethylering er en lovende diagnostiske og prædiktiv biomarkør i CRC patienter.

Materiale og metoder

patienter

Denne undersøgelse omfattede 425 CRC patienter, der blev indskrevet som en del af Epicolon-i-projektet, som er et populationsbaseret studie af CRC som tidligere beskrevet [22], [23], [24]. Da denne undersøgelse havde til formål at bestemme den prognostiske og prædiktive potentiale methylering biomarkører blev patientprøver indgår i denne undersøgelse tilfældigt udvalgt fra en tidligere beskrevet kohorte af patienter, for hvem var tilgængelige opfølgende data [7], [25], [26 ]. Demografiske, kliniske og tumorrelaterede karakteristika probander, samt en detaljeret familiens historie, blev opnået ved anvendelse af en tidligere etableret spørgeskema [22]. Klinisk-patologisk og molekylære funktioner i patienter inkluderet i disse studier er beskrevet i tabel S1. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for alle deltagende hospitaler i EPICOLON kohorte (Hospital 12 de Octubre, Madrid, Hospital Clinic, Barcelona, ​​Hospital Clínico Universitario, Zaragoza, Sygehus Cristal-Pinor, Complexo Hospitalario de Ourense, Parc de Salut Mar, Barcelona Hospital Donostia, CIBERehd, University of Country Basque, San Sebastian, Hospital General Universitario de Alicante, Hospital General de Granollers, Hospital General de Vic, Hospital General Universitario de Guadalajara og Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias Murcia, Hospital General Universitario de Valencia), og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient. status promotor methylering af seks gener (

SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4

og

miR-137

) blev analyseret i alle 425 CRC patienter, såvel som i normal colon mucosa fra 21 raske individer med en normal koloskopi.

DNA-ekstraktion og bisulfit modifikation

Genomisk DNA blev ekstraheret fra paraffinindlejret tumorvæv (FFPE) prøver i Epicolon-i studie. Under tilsyn af undersøgelsen patolog, blev vævssnit omhyggeligt undersøgt, tumor-berigede områder identificeres og omhyggeligt dissekeret for DNA-ekstraktion. Efter paraffin fjernelse ved xylen blev DNA isoleret ved anvendelse QIAamp DNA Mini kits, i henhold til fabrikantens anvisninger (Qiagen, Valencia, CA). Den resulterende genomiske DNA blev modificeret med natrium-bisulfit under anvendelse af EZ Methylering Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA).

DNA Methyleringsanalyse

bisulfit pyrosekventering blev udført til kvantitativ methyleringsanalyse som tidligere beskrevet (figur S1) [7], [25], [26]. Anvendte primere var designet under anvendelse af PyroMark 1,0 design software, og Pyrosekventering assays blev kørt på bisulfit-modificerede DNA (Tabel S2 og Information S1). Gennemsnitlige procentvise methylering for alle bindingssteder for CpG i hvert assay blev beregnet for hvert gen /markør. Methylering afskæringsværdier blev bestemt for hver markør baseret på de gennemsnitlige methylering niveauet i normal colon mucosa fra raske personer over 2 standardafvigelser. Yderligere bekræftende methylering analyse for

IGFBP3

blev også udført af en kvantitativ MSP (qMSP) assay for promotor /exon1 CpG ø ved hjælp af primere og PCR-betingelserne som beskrevet tidligere [27].

CpG Island Methylator Fænotype (CIMP) og mikrosatelitter ustabilitet (MSI) status

CIMP status CRC prøver fra Epicolon-i kohorten blev tidligere bestemt ved anvendelse af bisulfit pyrosekventering af CIMP markører

CACNAG1

,

SOCS1

,

RUNX3

,

NEUROG1

, og

MLH1

, som rapporteret tidligere [7]. En CRC blev betragtet CIMP-positiv, hvis mindst 3/5 promotorer blev methyleret [7]. Mikrosatelitter ustabilitet (MSI) blev udført ved hjælp BAT26 og NR24 quasimonomorphic markører som beskrevet tidligere [28]. Tumorer blev klassificeret som MSI-positive, når enten markør blev muteret, og blev anset mikrosatellit stabil (MSS), når hverken markør viste nogen tegn på genetisk ustabilitet.

BRAF

mutation

Tilstedeværelse af

V600E BRAF

mutation i CRC prøver blev påvist under anvendelse TaqMan prober og en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), med allelisk diskrimination, som tidligere beskrevet [29].

Statistisk Analyse

Kontinuerlige variabler er angivet som middelværdi + standardafvigelse (SD), mens kategoriske variable nævnes som frekvens eller procenter. Statistiske forskelle i baseline karakteristika mellem grupper blev analyseret ved hjælp af χ

2 test for kategoriske data, efterfulgt af anvendelse af Yates ‘korrektion og Mann-Whitney U test til kvantitativ dataanalyse. De primære resultater af denne undersøgelse var samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS). Analyser af begge udfald blev udført for hele CRC kohorte, og hver for sig i den delmængde af fase II og III CRC patienter med henblik på specifikt vurdere effekten af ​​methylering status på prognosen og respons på adjuverende kemoterapi. OS blev defineret som tiden fra indskrivning til døden, og DFS blev defineret som tiden fra indskrivning til død uanset årsag eller den første tilbagefald. Data om OS og DFS blev censureret på 1100 dage fra datoen for kræft diagnose. CRC tumorer blev kategoriseret i høje og lave methylering status grupper ved hjælp af Receiver Operating Karakteristik kurve (ROC) analyse. Kaplan-Meier analyse blev udført for at estimere fordelingerne af DFS og OS i fase II og III patienter. Overlevelse fordelinger blev sammenlignet ved hjælp af log rank test. En multivariat analyse til bestemmelse af hazard ratio for død eller tumor tilbagefald blev udført ved hjælp af flere variabler, herunder, lymfeknude metastaser, TNM stadie, MMR status, tumor differentiering klasse, alder og adjuverende kemoterapi. Yderligere analyser blev udført ved anvendelse Cox ‘proportionale farer regression på en trinvis måde for at teste virkningen af ​​status for methylering af et givet gen /markør med DFS og dens interaktion med kemoterapi. Hazard ratio og 95% konfidensinterval (95% CI) for død blev beregnet ved hjælp af Cox overlevelse modellering. Alle rapporterede p-værdier er tosidet, og p-værdier 0,05 blev anset for signifikante. Alle beregninger blev udført ved hjælp af SPSS 10.0 eller GraphPad Prism 4.0 statistisk software.

Resultater

I vores serie af 425 CRC tilfælde middelværdien ± SD alder af patienterne var 70,4 + -11 år, og der var flere mandlige patienter end kvinder (252/425; 60,3%). Af de 425 tumorer, blev 117 (27,9%) placeret i den proksimale colon, 151 (36,2%) var i den distale colon og 150 (35,9%) blev placeret i endetarmen. Ca. 12,8% af tilfældene var fase I, 33,7% fase II, 39,7% fase III, og 13,7% stadie IV tumorer. Vi fandt, at 35/425 (8,2%) CRC’er var MSI, 90/303 (29,7%) var CIMP-positive, og 21/191 (10,9%), nærede en somatisk V600E mutation i

BRAF

gen. Som forventet blev CIMP-positive fænotype oftere forbundet med MSI og tilstedeværelsen af ​​

BRAF

V600E mutation (22,3% vs. 2,3%, p 0,0001 for MSI fænotype, og 31% vs. 1,5% , p 0,0001 for

BRAF

V600E mutation)

diagnostisk betydning af methylering markører i CRC

de gennemsnitlige methylering niveauer for hvert gen i primære CRC væv var:. 23.8 % for

SEPT9

, 50,5% for

TWIST1

, 44,9% for

IGFBP3

, 50,2% for

GAS7

, 36,5% for

ALX4

, og 35,3% for

miR137

. Som vist i figur 1, methylering niveauer af hvert gen var signifikant højere i CRC versus normal slimhinde fra raske personer (

s Restaurant 0,0001 til

s Restaurant 0,0005 for alle sammenligninger). Disse resultater viser kræft-specificitet for hypermethylering af disse gener og etablere en begrundelse for deres udnyttelse som potentielle diagnostiske biomarkører for CRC, i betragtning af at alle 6 markører viste hypermethylering i alle faser af CRC’er (figur 2).

Bisulfite pyrosekventering resultater for methylering af

SEPT9 Hotel (A),

TWIST1

(B),

IGFBP3

(C),

ALX4

(D),

GAS7

(E) og

miR137

(F) gener sammenligningen af ​​den normale slimhinde fra raske kontroller (N-N) og primære tumorer fra CRC patienter.

Bisulfite pyrosekventering resultaterne af methylering af

sept9

(a),

twist1

(b),

IGFBP3

(c),

alx4

(d),

gas7

(e) og

mir137

(f) sammenligningen af ​​den normale slimhinde fra raske patienter (nn) og primære tumorer fra CRC patienter i alle TNM stadier i-iv. n (antal individer); medianen af ​​methylering (%).

For at vurdere effektiviteten af ​​hver methylering markør individuelt for CRC diagnose blev methylering resultater analyseret som en kategorisk variabel. Derfor blev hvert gen klassificeret som methylerede når gennemsnitlige methylering niveauet var højere end 7,1% for

SEPT9

, 35,7% for

TWIST

, 27,5% for

IGFBP3

, 53,5% for

GAS7

, 28,5% for

ALX4

, og 11,9% for

miR137

. Baseret på disse analyser, de hyppigst methylerede markører i CRC væv var den

miR-137

gen (302/344, 87,7%), efterfulgt af

IGFBP3

(289/348, 83% ),

TWIST1

(269/356, 75,6%),

SEPT9

(244/346, 70,5%),

ALX4

(214/350, 61,1%), og

GAS7

(164/378, 43,3%). For yderligere at vurdere, om en kombination af markører yderligere vil styrke den diagnostiske nøjagtighed analysen, vi analyserede kombination markør paneler og fandt, at

miR137

+

IGFBP3

kombination gav et diagnostisk nøjagtighed på 86% , efterfulgt af

TWIST1

+

IGFBP3

(82,7%) og

TWIST1

+

miR137

(78,5%). Desuden fandt vi, at kombinationen af ​​

miR137

+

IGFBP3

+ TWIST1 methylering havde den højeste diagnostiske nøjagtighed, 92%, som vist i tabel 1.

klinisk-patologiske træk forbundet med methylering biomarkører

Derefter undersøgte vi forholdet mellem forskellige klinisk-patologiske og molekylære karakteristika og deres sammenslutning med afvigende methylering af alle seks gener analyseret i denne undersøgelse. De klinisk-patologiske variabler inkluderet alder, køn, TNM mellemstationer og tumor placering, og de molekylære faktorer omfattede MMR status, CIMP fænotype og

BRAF

mutationsstatus. Tumor placering og TNM stadier ikke forbinder med status for methylering af en af ​​de gen-markører. Mærkeligt,

SEPT9

methylering var signifikant associeret med mandlige køn (p 0,05; Tabel S3). Når methylering blev analyseret som en kontinuerlig variabel, observerede vi en tendens til højere methylering af

TWIST1

,

IGFBP3, ALX4

, og

GAS7

(p 0,05) og ældre patienter med CRC; Men vi fandt ikke en positiv sammenhæng mellem normal colon mucosa methylering i disse gener og alder hos raske individer. (Tal 3 og 4.)

Med hensyn til molekylære foreninger,

TWIST1

methylering niveauer var højere i MSS sammenlignet med MSI CRCs (51% vs. 40,3%; p 0,05) (tabel 2). Methylering af fire gener,

ALX4, IGFBP3, GAS7

, og

miR137

, var signifikant korreleret med CIMP-positive tumorer (p 0,001). Som vist i tabel 2, CRC’er med

ALX4

IGFBP3

methylering blev mere ofte forbundet med en somatisk

BRAF

V600E mutation (13,5% vs. 1,8%, p 0,05 for

ALX4

, og 12,4% vs. 0%, p 0,05 for

IGBFP3

)

Afvigende hypermethylering af gener og dens indflydelse på. CRC patient prognose

den mediane opfølgning for serien af ​​425 patienter inkluderet i dette studie blev 1268 dage (3,4 år; range 0-2204 dage). Ved slutningen af ​​opfølgningsperioden, var 169 patienter døde (39,7%), og den mediane opfølgning for denne gruppe var 671 ± 513 dage (1,8 ± 1,4 år). Oplysninger om dødsårsagen var til rådighed i 99 patienter; 67,7% (67/99) døde som følge af komplikationer ved tumor progression, 18,2% (18/99) døde som følge af komplikationer af kemoterapi, og 14,1% (14/99) bukkede under for død af andre årsager, herunder postoperative komplikationer. Tumortilbagefald blev observeret i 116/370 patienter (31,3%), med en gennemsnitlig tid varighed af 644 ± 448 dage (1,7 ± 1,2 år) efter kirurgi.

For at bestemme den prognostiske betydning af status for methylering for hvert gen blev alle CRCs kategoriseret i to grupper baseret på deres methylering niveauer (høj versus lav), og dosis-respons-forhold mellem graden af ​​methylering og event-overlevelse blev undersøgt ved ROC-kurve analyse. Samlet, høje niveauer af methylering af

GAS7

(prognose afskæringsværdi = 52.62%; høj methylering: 43,3%, lav-methylering: 56,7%; χ

2 p = 0,03) og

ALX4

gener (prognose afskæringsværdi = 25,8%, high-methylering: 67,1%, lav-methylering: 32,9%; χ

2 p = 0,005) forbundet med dårlig DFS i CRC patienter (data ikke vist). I modsætning hertil lave niveauer af

IGFBP3

methylering viste en forening med betydeligt værre DFS efter ukorrigerede analyse (prognose afskæringsværdi = 53,1%; høj methylering: 30,9%, lav methylering: 69,1%; χ

2 p = 0,01; figur 5a og B). Efter multivariat Cox regressionsanalyse, hvor flere variabler blev analyseret, kun lave niveauer af

IGFBP3

methylering opstod som en selvstændig risikofaktor for dårlig DFS i fase II og III CRC patienter (HR = 0,49, 95% CI: 0.28- 0,85, p 0,01). Desuden status methylering af

IGFBP3

gen var den eneste statistisk signifikant risikofaktor for fase II CRC, efter justering for andre prognostiske faktorer som alder, hjælpestof 5-FU (5-fluorouracil) kemoterapi eller MSI-status (HR = 0,28, 95% CI: 0,12-0,70, p = 0,006; tabel 3)

(a) sygdomsfri overlevelse for patienter med stadie II og III crc ifølge

IGFBP3

status for methylering (høj methylering, n = 73, (30,3%) lav methylering, n = 168, (69,7%). (b) sygdomsfri overlevelse for patienter med stadium II sygdom, ifølge

IGFBP3

methylering (høj methylering, n = 45, (32,4%);. lav methylering, n = 94, (67,6%) (c) sygdomsfri overlevelse for patienter med stadium II og III sygdom, i høj

IGFBP3

methylering tumorer baseret på adjuvans kemoterapi (kemoterapi, n = 20, (22,5%);. ingen kemoterapi, n = 69, (77,5%) (d) sygdomsfri overlevelse for patienter med stadium II og III sygdom, i lav

IGFBP3

methylering tumorer efter adjuverende kemoterapi (Chemotherapyc n = 83, (52,7%); INGEN Kemoterapi, n = 74, (47,2%).

Afvigende gen hypermethylering og dens indflydelse på patientens overlevelse efter kemoterapi behandling

Kemoterapi blev givet til 257/425 patienter (60,5%), hovedsageligt ved hjælp af 5FU + leucovorin (236; 91,8% af patienterne). Blandt hele kohorten, 315 patienter (74,1%) havde enten en trin II eller III sygdom, og 155 (49,2%) af disse modtagne 5FU adjuverende kemoterapi. Kun 9 stadie II og III patienter modtog andre kemoterapeutiske behandlinger, og blev udelukket fra yderligere analyse. Efter en median opfølgning på 1221 dage (3,3 år), 92 (31,2%) patienter med stadie II og III viste tumor tilbagefald, og ved udgangen af ​​opfølgningsperioden, 101 (34,2%) patienter fra disse grupper havde døde

Adjuverende kemoterapi forudsat en signifikant forbedring i OS i fase II og III CRC patienter sammenlignet med patienter, som ikke fik kemoterapi (kemoterapi: 49,1%, ingen kemoterapi:. 50,9%; χ

2 p = 0,0001). Disse forskelle i OS var også til stede i multivariat analyse, som kontrolleres for alder, køn, lymfeknude metastaser, MMR, og CIMP fænotype status. (HR = 0,55, 95% CI: 0,36-0,85, p = 0,007)

Interessant, blandt alle 6 methylering markører undersøgte, kun

IGFBP3

methylering niveauer var prædiktive for reaktionen på 5FU kemoterapi. Ifølge vores resultater, patienter med lav

IGFBP3

methylering niveauer havde længere OS (p = 0,0007) og DFS (p = 0,05), da de modtog kemoterapi. Omvendt i patienter med højt

IGFBP3

methylering, adjuverende kemoterapi ikke bedre OS (p = 0,4) eller DFS (p = 0,3, figur 5C og D). Brug multivariat Cox regressionsanalyse (tabel 4), hos patienter med lav-

IGFBP3

methylering, adjuverende kemoterapi uafhængigt forudsagt bedre OS (HR = 0,49, 95% CI: 0,29 til 0,80, p = 0,004); Men var det ikke i væsentlig grad påvirke DFS (p = 0,08). På den anden side, MMR-status var det eneste variabel, der uafhængigt forudsagt OS (p = 0,05) og DFS (p = 0,04) hos patienter med høj

IGFBP3

methylering (tabel 4). I patienten kohorte behandlet med 5-FU adjuverende kemoterapi,

IGFBP3

methylering status ikke selvstændigt forudsige OS og DFS. I modsætning hertil blev DFS positivt påvirket af

IGFBP3

methylering status hos patienter, som ikke modtog adjuverende kemoterapi. (HR = 0,41, 95% CI: 0,18 til 0,91, p = 0,02)

diskussion

i de senere år er en række lovende gen methylering-baserede diagnostiske biomarkører herunder

SEPT9, TWIST 1, IGFBP3, GAS7, ALX4

, og

miR137

er blevet foreslået til tidlig opdagelse af tyk- neoplasi. Imidlertid har de fleste af disse markører været begrænset til indledende små opdagelse studier, og er ikke blevet udviklet til klinisk praksis, da de ikke er blevet systematisk valideret i store, uafhængige kohorter af CRC patienter. På baggrund af dette hul i viden, designet vi denne undersøgelse for at bekræfte den diagnostiske potentiale i disse biomarkører, og at kende deres prognostiske og prædiktive værdier CRC. Derudover var vi interesserede i at undersøge sammenhængen mellem afvigende hypermethylering af disse gener og klinisk-patologiske træk ved at analysere et stort, godt karakteriseret, populationsbaseret kohorte af CRC patienter.

Baseret på vores kvantitative methylering analyse, alle seks gener afhørt opfyldte kriterierne for potentiel klinisk anvendelse som diagnostiske biomarkører for CRC. Disse kriterier omfattede: a) methylering af hvert gen skete i en tumor-specifik måde; b) methylering niveauer af hvert gen i neoplastiske væv var betydeligt højere end i normalt kolonmucosa; og c) ingen af ​​generne viste en aldersafhængig stigning i DNA-methylering i normal colon mucosa [30], [31]. Methylering niveauer af hvert gen tilladt os at klassificere colorektale væv som normalt eller neoplastisk. Blandt alle de undersøgte markører,

IGFBP3

miR137

methylering niveauer viste den højeste diagnostiske nøjagtighed som individuelle genmarkører til identifikation af primære CRC’er (83% og 78,3%, henholdsvis). Denne diagnostiske nøjagtighed blev yderligere forbedret ved at kombinere status for methylering af to genmarkører; især status methylering af

IGFBP3 + TWIST1

eller

IGFBP3

+

miR137

havde de højeste nøjagtighed værdier på 86% og 82,7% henholdsvis med følsomhed og specificitet værdier 80%.

Vi undersøgte de molekylære træk forbundet med tumor methylering niveauer af disse gener. Dette var af særlig interesse som molekylær klassifikation baseret på MSI og CIMP status er blevet stadig vigtigere [32] for sin prognostiske [33], [34], [35] og intelligent rolle i CRC patienter [7], [34], [ ,,,0],36]. I denne undersøgelse blev fire af de seks gener positivt associeret med CIMP fænotype (

ALX4, IGFBP3, GAS7

, og

miR137

). Desuden er en positiv sammenhæng mellem

BRAF

V600E mutation og methylering af

ALX4

IGFBP3

gener var forbundet med CIMP-høj i CRC [37], [38] . Som forventet, methylering af

ALX4

IGFBP3

gener var forbundet med tilstedeværelsen af ​​

BRAF

genmutation.

TWIST1

methylering var højere hos patienter med MMR-dygtige tumorer i forhold til MSI tumorer; men i vores kohorte, kun en lille del af CRC’er var MMR-mangel (5%), og korrelationerne mellem MFR status og methylering markører kan være gået tabt, når man analyserer gruppen som helhed.

I fase II og III CRC patienter, der har gennemgået potentiel kurativ resektion, prognose afhænger af recidiv, som primært er forbundet med fjernmetastaser. Derudover har den fordel af adjuverende kemoterapi, især for fase II CRC patienter forblev et område med kontroverser og kemoterapeutiske modstand er fortsat et stort problem i disse patienter. Derfor opdagelsen af ​​nye prognostisk og prædiktiv biomarkører, der kan hjælpe med at identificere fase II og III patienter, der har høj risiko for tilbagefald og metastaser, kan forbedre den nuværende strategi for CRC patient lagdeling og terapi ledelse. Så vidt vi ved, har ingen tidligere studie undersøgte sammenhængen mellem methylering af

SEPT9, IGFBP3, TWIST1, GAS7, ALX4

, og

miR137

gener med prognose hos patienter med CRC, samt evnen af ​​disse biomarkører til at forudsige respons på 5-FU-baseret adjuvans kemoterapi. Baseret på vores resultater i denne store, velkarakteriseret populationsbaseret kohorte, fase II og III CRC patienter med lave niveauer af

IGFBP3

promotor methylering havde dårligere OS og DFS sammenlignet med dem med høje niveauer af DNA hypermethylering. Med hensyn til respons på kemoterapi, var, da 5-FU adjuverende kemoterapi administreret til fase II og III CRC patienter, kun de patienter med lave niveauer af

IGFBP3

-methylated tumorer blev positivt påvirket, hvilket resulterer i længere DFS og OS gange, hvilket indikerer, at fordelen ved kemoterapi var begrænset til denne gruppe af CRC patienter. Mærkeligt, denne effekt af

IGFBP3

methylering var uafhængig af CIMP status. er det ikke desto mindre vigtigt at påpege, at selv om

IGFBP3

methylering status opstået som det eneste uafhængige faktor, der forudsagde stakkels DFS sandsynlighed blandt stadie II CRC patienter, er yderligere uafhængige kliniske undersøgelser skal bevise, at

IGFBP3

methylering niveauer i CRC kunne udgøre en potentiel rutine test for prognosticering af CRC patienter, og forbedre behandlingen af ​​patienter med lokaliseret sygdom i kombination med de nuværende klinisk-patologiske og molekylære værktøjer.

Andre undersøgelser har observeret en sammenhæng mellem høj niveauer af

IGFBP3

methylering og dårlig klinisk resultat i lunge og ovariecancer [39], [40], og for nylig i CRC patienter [27]. Afvigende rapporter ved hjælp methylering markører kan skyldes anvendelsen af ​​forskellige metoder og analyse af forskellig sekvens steder inden CpG Islands. I denne undersøgelse anvendte vi bisulfit pyrosekventering til methyleringsanalyse, hvilket er en pålidelig kvantitativ tilgang for robust DNA methyleringsanalyse sammenlignet med den konventionelle Methylering Specific PCR (MSP), som mangler kvantificering leveres af bisulfat pyrosekventering [27], [39], [40]. Hertil kommer yderligere for at sikre nøjagtigheden af ​​vores methylering resultater, vi også gennemført en kvantitativ-MSP (qMSP) analyse i CpG øregion tidligere undersøgt i CRC [41]. Som vist i figur 6, vi bekræftet, at vores bisulfit pyrosekventering methylering resultater var positivt korreleret til de opnåede resultater inden for CpG øregion tidligere studeret [27], [39], [40].

(a) Skematisk oversigt over insulinlignende dyrket faktor bindende protein 3 (IGFBP3) genet. exoner er vist med blå kasser, introns med blå linjer, og promotorområdet af blå stiplede linier.

IGFBP3

genet har en cytosin-phosphat-guanin (CPG) ø ved i promotorregionen og exon1 understreger potentialet til at modulere genekspression ved hjælp af CPG hypermethylering, og dette er repræsenteret ved en grøn boks. Vi udførte to forskellige analyser, der dækker både CpG’er øer (angivet med grønne pile) ved hjælp af to kvantitative metoder: pyrosekventering og qmsp for at korrelere methylering niveauer af disse to steder. (B) Lineær regressionsanalyse sammenligne

IGFBP3

methylering niveauer ved pyrosekventering (% methylering) i 348 patientprøver og qmsp (PMR) analyser i CRC væv (n = 197).

Selv om der er nogle forskelle mellem denne undersøgelse og tidligere offentliggjorte undersøgelser, mener vi, dette arbejde er mere robust og omfattende, som vores beskæftiger det største patient kohorte, er populationsbaseret, og omfatter en kontrolgruppe af ikke-behandlede CRC patienter til sammenligning. Den biologiske rolle og timingen af ​​

IGFBP3

methylering i CRC er dårligt forstået;