PLoS ONE: Målretning Mitokondrisk STAT3 med Novel Phospho-valproat (MDC-1112) Hæmmer kræft i bugspytkirtlen Væksten i Mice

Abstrakt

Nye agenter er nødvendige for at behandle kræft i bugspytkirtlen, en af ​​de mest dødelige menneskelige maligniteter . Vi syntetiserede phospho-valproinsyre, et hidtil ukendt valproat derivat, (P-V; MDC-1112) og vurderes dens effektivitet i kontrollen af ​​pancreascancer. P-V inhiberede væksten af ​​humane pancreas cancer-xenotransplantater i mus ved 60% -97% og 100%, når de kombineres med cimetidin. Den dominerende molekylære mål for P-V var STAT3. P-V inhiberede phosphoryleringen af ​​JAK2 og Src, og Hsp90-STAT3 association, undertrykke den aktiverende phosphorylering af STAT3, som igen reduceres ekspressionen af ​​STAT3-afhængige proteiner Bd-x

L, Mcl-1 og survivin. P-V reduceres også STAT3 niveauer i mitochondrierne ved at forhindre dets translokation fra cytosolen, og øget de mitochondrielle niveauer af reaktive oxygenformer, der udløste apoptose. Hæmning af mitokondrie STAT3 ved P-V var påkrævet for dens anticancer effekt; mitokondrie STAT3 overekspression reddede dyr fra tumorvækstinhibering af P-V. Vores resultater viser, at PV er en lovende kandidat lægemiddel mod kræft i bugspytkirtlen og etablere mitokondriel STAT3 som sin centrale molekylære mål

Henvisning:. Mackenzie GG, Huang L, Alston N, Ouyang N, Vrankova K, Mattheolabakis G, et al. (2013) Målretning mitokondrier STAT3 med Novel Phospho-valproat (MDC-1112) Hæmmer kræft i bugspytkirtlen Vækst i mus. PLoS ONE 8 (5): e61532. doi: 10,1371 /journal.pone.0061532

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: December 14, 2012; Accepteret: 11. marts 2013; Udgivet: 1. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Mackenzie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH 2R01 CA92423 og R01 CA10101902 til BR og en Stony Brook University-Institut for Medicin frø-tilskud til GGM. Dette arbejde blev også støttet delvist af tilskud R01 CA154172 (BR), udstedt af National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health. Undersøgelsen sponsorer havde ingen rolle i undersøgelsen design, i indsamling, analyse og fortolkning af data, i skrivning af manuskriptet, og heller ikke i beslutningen om at indsende manuskriptet til offentliggørelse

Konkurrerende interesser:. BR har en egenkapital position i Medicon Pharmaceuticals, Inc., det selskab, der leveres testforbindelsen; PPC og NO er ​​tilknyttet det samme. Alle andre forfattere erklærer nogen interessekonflikt. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen (PC), henvises til som “dystre sygdom” på grund af dens aggressive natur og høj dødelighed, er et af de mest ødelæggende ondartetheder verdensplan, er ofte dødelig inden for 6 måneder [1]. Den høje dødelighed af PC tilskrives sen diagnose, hurtig sygdomsudvikling og resistens mod kemoterapi. På grund af den skuffende præstation af nuværende behandlinger, der er et presserende behov for at identificere nye midler til dens behandling.

Signal Transducer og Activator af transskription 3 (STAT3) transskription faktor spiller en væsentlig rolle i patogenesen af ​​PC , at blive associeret med ondartet svulst initiering, transformation og progression [2], [3]. Udover sin faste nukleare transkriptionel rolle, STAT3 spiller en væsentlig rolle i mitokondrierne, hvor den fremmer Ras-afhængige malign transformation [4], og sikrer en optimal funktion af elektrontransportkæden [5]. Fordi det regulerer flere veje vigtige i tumorigenese [6], er STAT3 anerkendt som et potentielt mål lægemiddel til PC [7].

Rational narkotika udvikling kræver blandt andet at udnytte egenskaber formodede molekylære mål. Vi har identificeret phospho-valproinsyre (P-V; MDC-1112;. Figur 1A), en hidtil ukendt valproat (VPA) derivat, som en potent STAT3 inhibitor. Denne agent er blevet syntetiseret ud fra en generel tilgang, hvor en specifik kemisk modifikation af kendte lægemidler øger deres ønskede anticancer egenskaber, primært deres effektivitet. Anticancer egenskaber VPA, en forgrenet kortkædede fedtsyre i vid udstrækning som et antiepileptisk lægemiddel, er under undersøgelse, især da det blev identificeret som en histondeacetylering (HDAC) -hæmmer [8] – [10]. Igangværende forsøg med VPA viser opmuntrende resultater for flere humane maligniteter [11].

(A) Den kemiske struktur af P-V (MDC-1112). (B) BxPC-3 tumorvækst af lydstyrke (▴) og P-V 50 mg /kg /d (▪) behandlede mus. *

s

0,01

vs

. kontrolgruppe. (C) Billeder af repræsentative tumorer fra kontrol- og P-V-behandlede mus. (D) MIA PaCa-2 tumorvolumen vækst af kontrol (•), 100 mg /kg (▪) og 150 mg /kg (▴) P-V-behandlede mus. *

s

0,01

vs

. kontrol. (E) BxPC-3 tumorvækst af kontrol volumen, P-V 50 mg /kg /d og VPA 250 mg /kg /dag behandlede mus. *

s

0,01

vs

. P-V og VPA-grupper;

#

s

0,01

vs

. VPA-gruppe. (F) Cimetidin (CIM) synergistisk med P-V for at inhibere væksten af ​​humane PC xenotransplantater. Nøgne mus med MIA PaCa-2 (

venstre

) eller BxPC-3 (

højre

) xenotransplantater blev behandlet med P-V 50 mg /kg, CIM 100 mg /kg, eller begge dele. *

s

0,01

vs

. kontrol;

#

s

0,05

vs

. PV eller CIM grupper.

Heri vi etableret PV som et potent middel til PC kontrol, identificeret cimetidin som en stærk kombination partner og skitserede sin virkningsmekanisme, som er involveret i hæmning af STAT3 på mitokondrie niveau

Materialer og metoder

Reagenser -. Celledyrkning

PV og phospho-aspirin (MDC-43) var en gave fra Medicon Pharmaceuticals Inc. (Stony Brook, NY ). Cimetidin og VPA blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Dihydroethidium (DHE), 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorecein diacetat (DCFDA), MitoSOX Red og Annexin V blev indkøbt fra Invitrogen. Alle generelle opløsningsmidler og reagenser var af HPLC-kvalitet eller den højeste karakter kommercielt tilgængelige.

Menneskelig pancreas (AsPC-1, BxPC-3, Capan-2, CFPAC-1, HPAF-II, Panc-1 og MIA Paca-2), bryst (MCF-7 og MDA-MB 231) og kolon (HT-29, og SW-480) celler blev dyrket som foreslået af ATCC (Manassas, VA). Alle cellelinjer blev passeret i vores laboratorium i mindre end 6 måneder efter modtagelsen. Mitokondrierne-mindre (ρ

0) derivater af BxPC-3-celler blev opnået ved inkubering af celler med 200 ng /ml ethidiumbromid og 50 ug /ml uridin i 8 uger [12].

Cellevækst blev bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. Celleproliferation blev analyseret ved 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) inkorporering; apoptose og nekrose ved farvning med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) og analysere fluorescensintensiteter ved FACScaliber (BD Bioscience); og cellecyklus ved flowcytometri, alle som beskrevet [13].

Antistof microarray

Kinex Antibody Microarray analyser blev udført på proteinlysater opnået fra BxPC-3 celler behandlet med eller uden PV for 2 timer at følge instruktionerne fra Kinexus (www.kinexus.ca).

Bestemmelse af ROS niveauer

Celler blev behandlet med test agenter i 1 time, farvet med 10 pM DCFDA, 10 uM DHE eller 10 pM MitoSOX Red i 30 minutter ved 37 ° C og fluorescensintensiteten blev analyseret ved FACScaliber

Bestemmelse af mitokondrie O

2

-. ved fluorescens mikroskopi

Celler seedet natten i glasbund kultur retter (Mattek, Ashland, MA) blev behandlet med PV og analyseret ved fluorescensmikroskopi [14].

Bestemmelse af mitokondrie membranpotentiale

Den mitokondrielle membranpotentiale (A ^ m) blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af JC-1 kationiske farvestof [13].

Bestemmelse af den mitokondriske elektrontransportkæde kompleks i-aktivitet

aktiviteten af ​​den mitokondriske elektrontransportkæde kompleks jeg blev bestemt i mitokondrie ekstrakter fra MIA Paca-2 celler inkuberet med PV 1,5 × IC

50 i 1 time, efter fabrikantens anvisninger (MitoSciences, Eugene, OR).

Mitokondriel import assay

in vitro

mitokondrie import analyser blev udført som beskrevet [15] (detaljer i Methods S1).

Bestemmelse af HDAC-aktivitet

HDAC-aktivitet blev bestemt ved hjælp af en colorimetric- baseret assay. Kort beskrevet blev Panc-1-celler behandlet med PV, VPA eller HDAC inhibitor Trichostatin A i 3 timer og HDAC-aktiviteten blev derefter bedømt efter fabrikantens instruktioner (BioVision, Milpitas, CA)

Western blot-analyse

Hele cellefraktioner blev opnået som beskrevet [13]. Cytosolisk og mitokondriske fraktioner blev fremstillet under anvendelse af Mitokondrier Fraktion Isolation Kit (Pierce, Rockford, IL). Western blots blev udført som beskrevet [13].

STAT3 gendæmpning

Celler blev transficeret med 100 nmol /l STAT3 lille interfererende RNA (siRNA) eller uspecifik kontrol siRNA (detaljer i Methods S1) .

STAT3 overekspression

Celler blev forbigående eller stabilt transficeret med STAT3 ekspressionsplasmidet (STAT3 cDNA; OriGene, Rockville, MD; detaljer i Methods S1). For

in vivo

undersøgelser blev MIA PaCa-2 celler med tavshed STAT3, transficeret med STAT3 Y705F Flag pRc /CMV-plasmidet [16], en gave af James Darnell (Rockefeller University, NY) (Addgene plasmid # 8709). På den anden side, aspC-1 celler, med tavshed STAT3, blev transficeret med MLS-STAT3 plasmid [17], en gave fra Dr. Andrew Larner.

Dyreforsøg

Alle dyr eksperimenter blev godkendt af vores Institutional Animal Care og brug Udvalg Stony Brook University.

nude mus xenografundersøgelser

Kemoterapi protokol.

BALB /c nøgne mus (5- 6 uger gammel, Charles River, Wilmington, MA) blev subkutant injiceret med 1,5 × 10

6 BxPC-3 eller MIA PaCa-2-celler i 100 pi PBS i hvert flanke. Når tumorerne nåede 200 mm

3, mus (n = 10 /gruppe) blev randomiseret i grupper, der fik majsolie (kontrol) eller PV (50, 100 eller 150 mg /kg) i majsolie givet oralt 5 × /wk

kemoforebyggende protokol

En uge før implantere BxPC-3 celler, blev musene inddelt i tre grupper.. (kontrol, PV, og VPA, n = 7 /gruppe) og begyndte på PV 50 mg /kg /d eller VPA 250 mg /kg /d med mavesonde i 7 uger; disse doser udgør 25% af deres respektive maksimale tolererede doser (MTD)

Kombination undersøgelse

Female ncr-nøgne mus (5-6 uger gamle, Taconic, Hudson, NY).. var subkutant indpodet i hver flanke med 1,5 × 10

6 BxPC-3 eller MIA PaCa-2-celler i 100 pi PBS og randomiseret i fire grupper (n = 7 /gruppe), der fik 5 × /uge til 58 dage: køretøj (majs olie); 50 mg /kg P-V i majsolie ved oral gavage; 100 mg /kg cimetidin i PBS i.p .; og PV plus cimetidin som ovenfor.

ortotopisk pancreas xenograft undersøgelse

Forældre, STAT3-overudtrykkende eller STAT3

Y705F-overekspression MIA Paca-2 celler, eller forælder og MLS-STAT3 overekspression AsPC -1 celler (1 x 10

6 i 30 pi PBS) injiceret ind i parenkym i bugspytkirtlen med en 27-gauge kanyle. Fem dage senere blev mus randomiseret i to grupper (n = 8 /gruppe) og behandlet med vehikel (majsolie) eller PV 150 mg /kg 5 × /wk oralt med sonde i 18 eller 38 dage.

immunhistokemi

farvning for Ki-67, amylase, STAT3, p-STAT3

Ser727, p-STAT3

Tyr705, Mcl-1 og Bcl-2 blev udført som beskrevet [18]. Apoptose var bestemt immunhistokemisk af terminalen deoxynukleotidyltransferase-medieret deoxyuridintriphosphat-biotin nick endemærkning (TUNEL) assay [14]. Se for flere detaljer.

statistiske analyser

Resultater fra mindst tre uafhængige forsøg blev udtrykt som

betyder

±

SEM

og analyseret med en-faktor variansanalyse efterfulgt af Tukey test for multiple sammenligninger.

P

0,05 var statistisk signifikant

Resultater

PV hæmmer væksten af ​​humane PC xenografter hos mus:. Synergi med cimetidin

For at vurdere kemoterapeutisk potentiale PV, vi ansat både ortotopisk og heterotopiske (subkutane) PC xenograftmodeller i nøgne mus ved hjælp af to humane PC cellelinier afviger i deres

Kras

status, BxPC-3 (vildtype

Kras

) og MIA PaCa-2 (mutant

Kras

) (fig. 1B-D). P-V 50 mg /kg /d hæmmede væksten af ​​BxPC-3 subkutane xenotransplantater, reduktion på dag 17 tumorvolumenet med 75,4% sammenlignet med kontrol (p 0,01). Ved doser på 100 og 150 mg /kg /x25d, P-V inhiberede væksten af ​​subkutane MIA PaCa-2 xenotransplantater med 76,6% og 96,9% (p 0,01). En noget lavere inhiberende virkning blev bemærket i ortotopisk MIA Paca-2 xenotransplantater i mus behandlet med PV 150 mg /kg /D, ud 5 dage efter implantation og fortsættende i 38 dage (60% inhibering ved aflivning; p 0,001, Fig S1. .)

Vi sammenlignede også anticancer effekter af PV og VPA, dens oprindelige forbindelse, ved at behandle nøgne mus der bærer subkutane BxPC-3 xenotransplantater med PV 50 mg /kg /d og VPA 250 mg /kg /d; disse doser udgør 25% af deres respektive MTDs. Vi fulgte en forebyggende protokol, dvs. behandling startet 1 uge før BxPC-3 implantation. På dag 38 efter implantation, sammenlignet med kontroller PV reducerede xenotransplantat tumorvolumen med 68%, mens VPA blevet nedsat med 34% (p 0,01 for begge), hvor forskellen mellem de to er signifikant (p 0,05;. Fig 1E) .

i betragtning af den aggressive karakter af PC, vi undersøgt, om PV kan med held kombineres med andre midler. Vi screenede adskillige forbindelser in vitro. Isobologrammer etableret synergi mellem P-V og 5-FU, GABA, arsentrioxid og cimetidin (Fig S2.); alle er rapporteret at have en vis effekt mod PC [19] – [22]. Mens 5-FU ikke virke synergistisk med P-V in vivo (fig. S3), cimetidin, en histamin-2 blokker, havde en dramatisk effekt på væksten af ​​PC-xenotransplantater, når det kombineres med P-V (fig. 1F). Administreres under en behandling protokol til mus med MIA PaCa-2-xenografter, kombinationen væsentlige producerede tumor stasis; hver forbindelse alene havde kun en delvis virkning ( 45% inhibering ved afslutningen af ​​undersøgelsen). Administreres under en forebyggelse protokol til mus med BxPC-3 xenotransplantater, cimetidin plus PV elimineret alle tumorer i alle dyr ved dag 58, i modsætning til hver forbindelse alene (31% inhibering med cimetidin og 68% ved PV).

PV reducerede tumorvækst via dets cytokinetic virkning. For eksempel i studiet af heterotopiske BxPC-3 xenotransplantater, P-V inhiberede celleproliferation med 49% og øgede apoptose med 78% sammenlignet med kontroller (Fig. S4). Notatet i studier med disse to PC celler (og ni yderligere bugspytkirtlen og ikke-PC cellelinjer), P-V, som hæmmede deres in vitro vækst mere potent end VPA, vises en tredobbelt cytokinetic effekt: a) hæmning af spredning; b) blok på G

2 /M → G

1 cellecyklus overgang, der er forbundet med øget p21 udtryk; og c) induktion af apoptose (fig. S5), som var selektiv, skåner de normale acinære celler (Fig. S6).

PV var veltolereret af musene i alle undersøgelser (fig. S1c), og viste ingen genotoksicitet på Ames test og ingen akut toksicitet i mus (Resultater S1)

PV hæmmer STAT3 signalering i PC:. Cytosolisk /nukleare effekt

Identifikation af molekylære target (e) af en nye middel er en væsentlig del af dens udvikling. Fordi VPA inhiberer histondeacetylering, vi oprindeligt undersøgt, om P-V også kunne inhibere histondeacetylering. Til dette formål målte vi HDAC-aktivitet i Panc-1-celler efter 3 h inkubation med P-V ved koncentrationer svarende til 1 × og 1,5 × IC

50 for cellevækst. P-V hæmmede HDAC-aktivitet med 23 og 29%, henholdsvis mens VPA på sit IC

50 hæmmede det med 56%. Som forventet, Trichostatin A stærkt inhiberede HDAC-aktivitet med 89% (fig S7A.)

Fordi NF-KB konstitutivt aktiveret i 70% af humane pancreascancer, og i humane pancreatiske cellelinjer [23] – [25] vi undersøgte også, hvis PV hæmmet dens aktivering. Som vist i fig. S7B, P-V kun beskedent hæmmede NF-KB-aktivering i BxPC-3 celler.

Brug et antistof microarray analyse (Kinexus, Vancouver, Canada), identificerede vi STAT3 som et potentielt mål for P-V. Efter en 2 h behandling af humane PC celler med P-V 15 uM, mest udtalt virkning var inhiberingen af ​​STAT3 phosphorylering. På baggrund af ovenstående, undersøgte vi STAT3 vej videre

I PC cellelinjer, PV hæmmede både konstitutive og IL-6-stimuleret STAT3-aktivering, (men ikke STAT5, Fig 2A)., Faldende STAT3 phosphorylering og blokere dens binding til DNA. Som et resultat af ekspressionen af ​​STAT3-afhængige proteiner, såsom Bcl-x

L, Mcl-1 og survivin, som bidrager til resistens over for apoptose blev undertrykt (figur 2A-B,.. Figur S8). P-V inhiberede også begivenheder opstrøms af STAT3 phosphorylering, herunder både JAK2 og Src-phosphorylering (fig. 2B). Som vist i fig. 2C, P-V forstyrret sammenhængen mellem STAT3 og Hsp90 uden at påvirke dens niveauer (Fig S9.); chaperone protein Hsp90 letter STAT3 fosforylering ved at optimere sin kropsbygning for phosphorylering [26]. Immunhistokemiske studier af ortotopisk PC xenotransplantater viste, at P-V inhiberede p-STAT3 og total STAT3 ekspression in vivo såvel (fig. 2D). I mus med BxPC-3 xenotransplantater behandlet med P-V, blev STAT3 udtryk reduceret med 81%, sammenlignet med kontrolgruppen (p 0,01;. Figur S10). Immunblots af protein lysater fra xenografter bekræftet disse observationer. PV undertrykt udtryk for STAT3-afhængige proteiner Bd-x

L og Mcl-1 i disse tumorer (fig. 2E).

(A) Immunoblots af STAT3, phosphoryleret STAT3 (p-STAT3), STAT5 og p-STAT5 fra BxPC-3-celler behandlet med PV i 1 time og stimuleret med IL-6 i 30 min. (B) JAK2 og Src blev immunpræcipiteret fra kontrol og P-V-behandlede MIA PaCa-2-celler, og præcipitaterne blev immunblottet. (C) Hsp90 blev immunopræcipiteret fra kontrol og P-V-behandlede BxPC-3-celler og bundfaldet blev immunoblottedes for STAT3. IgG = Loading kontrol. (D) Immunfarvning for STAT3 og phosphoryleret STAT3 (p-STAT3) udtryk på vævssnit af MIA PaCa-2 ortotopisk tumorer fra kontrol og P-V-behandlede mus (x40). Resultater udtrykkes som procent af positive celler for p-STAT3 og lysstyrke indeks pr 40 × felt for STAT3. Værdier er gennemsnit ± SEM (n = 7); *

s

0.05 vs

. kontrol. (E) Proteinlysater fra BxPC-3 xenotransplantater blev immunoblottedes for STAT3, Bcl-x

L og Mcl-1 proteiner. Hver bane repræsenterer en anden tumorprøve. Loading kontrol: β-actin. Bånd blev kvantificeret og resultater udtrykt som procent kontrol for hvert protein. Værdier er gennemsnit ± SEM (n = 7); *

s

0.01 vs

. kontrol. (F) (

Øvre

) Cimetidin (CIM) øger P-Vs hæmmende effekt på STAT3 in vivo. Proteinlysater fra MIA PaCa-2 xenotransplantater blev analyseret for STAT3, Bcl-2 og Mcl-1-proteiner ved immunblotting. Hver bane repræsenterer en anden tumorprøve. Loading kontrol: β-actin. (

Lavere

) CIM øger P-Vs afbrydelse af STAT3-Hsp90 forening. Hsp90 blev immunpræcipiteret fra MIA PaCa-2-celler behandlet med eller uden P-V, CIM eller begge dele. Efter immunopræcipitation, immunoblotting for STAT3 blev udført.

Kombineret med cimetidin, P-V undertrykkes også ekspressionen af ​​STAT3, Bcl-2 og Mcl-1 i heterotopiske MIA PaCa-2 xenotransplantater (fig. 2F). Af interesse, cimetidin forbedret evne P-V at forstyrre Hsp90-STAT3 forening i MIA PaCa-2-celler (fig. 2F). Endvidere forbehandling af PC celler med ranitidin, en anden H-2 blokker til kroppen til at modulere væksten inhibitoriske virkning af cimetidin (fig. S11), hvilket antyder, at cimetidin kan ikke udelukkende virke ved at inhibere H-2-receptorer.

PV inhiberer STAT3 signalering i PC: Mitokondrisk virkning

i mitokondrierne, STAT3 understøtter Ras-afhængige malign transformation og er nødvendig for optimal funktion af elektrontransportkæden [4], [5]. I PC celler, P-V faldt niveauerne af STAT3 i mitokondrierne uden at påvirke dets cytoplasmiske niveauer (fig. 3A og fig. S12). Interessant VPA havde ingen effekt på mitokondriske STAT3 niveauer. I modsætning hertil phospho-aspirin, der deler med P-V den samme aromatiske linker [13], reducerede mitokondrielle STAT3 niveauer (Fig. 3B), hvilket antyder, at linkergruppen kan deltage i denne virkning. Ingen af ​​disse tre forbindelser påvirket mitokondrie niveauer af Hsp90 og Hsp60 proteiner, både importeret til mitokondrierne, hvilket indikerer, at ændringerne i STAT3 niveauerne ikke var på grund af en generel undertrykkelse af protein transport ind mitokondrierne.

(A ) Immunblots for STAT3, α-tubulin eller COX IV i cytosolisk (CF) og mitokondrie (MF) fraktioner fra MIA PaCa-2-celler behandlet med PV i 5 timer. (B) Immunoblots for STAT3, Hsp90, Hsp60, α-tubulin og COX IV i mitokondriske fraktioner fra MIA PaCa-2-celler behandlet med p-V, VPA eller phospho-aspirin (P-A) i 3 timer. (C) Immunoblots for p-STAT3

Ser727, STAT3 og Hsp90 i mitokondriske fraktioner isoleret fra MIA PaCa-2 xenotransplantater fra kontrol- eller 150 mg /kg P-V-behandlede mus. β-tubulin = cytosoliske krydskontaminering kontrol; COX IV = mitokondrie loading kontrol. Hver bane svarer til en anden tumorprøve. (D) P-V nedsætter aktiviteten af ​​mitokondrielle elektronoverførsel kæde kompleks I (NADPH dehydrogenase). Aktiviteten af ​​det mitokondrielle kompleks jeg blev målt som beskrevet i Methods. Værdier er gennemsnit ± SEM (n = 3); *

s

0.05 vs

. kontrol. (E) MitoSOX Red, DCFDA og DHE fluorescens blev målt ved flowcytometri i BxPC-3-celler behandlet med p-V i 1 time. Som positive kontroller behandlede vi cellerne med phospho-aspirin (P-A) i 1 time, hvilket inducerer både DCFDA og DHE [13].

Right panel

: Mitokondrisk O

2

– niveauer i et panel af seks PC celler behandlet med P-V 1.5 × IC

50 i 1 time. (F) BxPC-3-celler blev behandlet med PV i op til 2 h, efterfulgt af tilsætning af MitoSOX Red proben og cellerne blev analyseret ved konfokal mikroskopi (x40).

Nuclear-kodede proteiner er importeres til mitokondrier hovedsageligt gennem translocases af mitokondrie ydre membran (TOM) kompleks. TOM20, en komponent af dette kompleks, er afgørende for specificiteten af ​​denne proces [27]. P-V Hæmmede associationen mellem STAT3-TOM20, vist ved immunopræcipitering mitokondriske fraktioner med et anti-TOM20 antistof og immunoblotting for STAT3 (fig. S13A). Dette fund tyder på, at P-V reducerer mitokondrisk import af STAT3. Dette blev bekræftet af en mitokondrier import assay.

35S-methionin mærket STAT3, genereret af

in vitro

oversætte

STAT3

, blev behandlet med eller uden P-V før dens interaktion med intakte mitokondrier. P-V reducerede niveauet af

35S-STAT3 i mitokondrierne, oprettelse dets evne til at inhibere det mitokondrielle transport af STAT3 (fig. S13B). Det PV hæmmer mitokondrie STAT3 blev bekræftet in vivo:. P-STAT3

Ser727 og STAT3 niveauer blev nedsat i mitokondrier isoleret fra PC implanteret af PV-behandlede mus, mens de af Hsp90 protein forblev upåvirket (. Figur 3C)

STAT3 optimerer funktionen af ​​elektron transportkæden, [5] den vigtigste generator af ROS. I MIA PaCa-2-celler, P-V faldt med 29% (p 0,05) (. Figur 3D) aktiviteten af ​​mitokondrisk kompleks I, påvirker ROS produktion. Brug MitoSOX Rød, en molekylær sonde specifik for mitokondrie superoxid anion (O

2

-), viste vi, at PV øgede O

2

-. Niveauer i mitokondrier i seks PC cellelinier (fig 3E -F). Denne effekt var mitokondrier-specifik, da P-V inducerede ikke andet cellulært ROS, bestemt under anvendelse DCFDA (detekterer flere ROS arter) og DHE (prober til totalt cellulært O

2

-). Som positive kontroller, brugte vi phospho-aspirin, tidligere vist at fremkalde både DCFDA og DHE [13]. Notatet VPA havde ingen effekt på ROS, herunder mitokondrie O

2

– (. Figur S14). Som kombination partnere, P-V og cimetidin synergieffekt at øge mitokondrie O

2

– niveauer. P-V og cimetidin hver alene øget andelen af ​​MitoSOX Rød (+) PC celler henholdsvis 3,7 og 0,1 gange henholdsvis og 5,6 gange i kombination (fig. S15A). Effekten af ​​P-V på STAT3 var afgørende for dannelsen af ​​mitokondrie O

2

-. Dette begreb er støttet af den konstatering, at når STAT3 blev slået ned, niveauerne af mitokondrie O

2

– øget (. Figur 4A) og angiver, at STAT3 hæmmede produktionen af ​​O

2

– af mitokondrier. I modsætning hertil, når vi overudtrykt STAT3, som omfattede dets overekspression i mitokondrier, stigningen i mitokondrier O

2

-. Niveauer som respons på PV blev ophævet (. Fig 4B)

(A) Knocking-down STAT3 øger mitokondrie O

2

– niveauer i BxPC-3 celler. Kontrol-siRNA og STAT3-siRNA celler blev præinstalleret med MitoSOX rød, og mitokondrie O

2

– blev bestemt ved flowcytometri (

venstre

) eller konfokal mikroskopi (

højre

; x40). (B) STAT3 overekspression reducerer stigningen i mitokondrisk O

2

– induceret af P-V. BxPC-3-celler blev transficeret med en STAT3-udtrykkende plasmid eller et kontrolplasmid (tom vektor) i 48 timer og derefter behandlet med p-V i 4 timer efterfulgt af tilsætning af proben MitoSOX Red. Celler blev derefter undersøgt ved konfokal mikroskopi (x40). (C) P-V kollapser mitokondriemembranen potentiale (A ^ m) i en tids- (

top

) og koncentrationsafhængig (

bund

) måde. Fluorescens histogrammer blev kvantificeret og resultaterne er vist som gennemsnit ± SEM; *

s

0.05 vs

. kontrol. (D) Immunoblots for cytochrom c, pro-caspaser og caspaser 9 og 3 i cytosol protein ekstrakter fra BxPC-3 celler behandlet med P-V. (E) BxPC-3 mitokondrier-mindre (ρ

0) celler er markant mere modstandsdygtige over for P-V-induceret apoptose.

Top

: Immunoblots for COX IV og STAT3 i forældrenes (-) og ρ

0 BxPC-3 celler. Loading kontrol:. P-actin

En konsekvens af den øgede mitokondrie ROS niveauer var sammenbruddet af mitokondriemembranen potentiale (A ^ m). Behandling af PC celler med P-V kollapsede deres ATm, fremgår af den formindskede rød /grøn fluorescerende forhold mellem celler indlæst med proben JC-1 (fig. 4C). Sammenbruddet af A ^ m aktiveret den indre apoptosecyklus, manifesteret ved frigivelse af cytochrom c til cytosolen (start 4 timer efter behandlingsstart); spaltning af procaspase 9 (begyndende ved 12 timer); og aktivering af caspase 3 (begyndende ved 18 timer) (fig. 4D). Synergien mellem P-V og cimetidin var også tydeligt i induktion af apoptose. Efter 24 timers behandling med PV /cimetidin, fold-stigning på annexinV (+) celler var 2,6 sammenlignet med 1,1 for PV og ingen for cimetidin alene (fig. S15B).

Disse resultater tyder på, at mitokondrier kan mediere PC celledrab effekt af PV. Derfor har vi genereret mitokondrier-mindre (ρ

0) BxPC-3-celler (fravær af det mitokondrielle protein cytochrom c-oxidase subunit IV (COX IV) fra ρ

0-celler bekræftede deres mangel på mitokondrier). I forhold til forældrenes celler, ρ

0-celler var 43% mere modstandsdygtige over for PV-induceret apoptose, at fastslå, at mitokondrier mægle i del induktion af celledød ved PV (fig. 4E).

Overekspression af mitokondrie STAT3 ophæver anticancer effekt af PV

for at bekræfte, at STAT3 er et centralt mål for PV, genereret vi MIA PaCa-2 celler stabilt overekspression STAT3 (STAT3

høj

), idet der som styrer deres overordnede celler, der har basale niveauer af STAT3 (STAT3

normal

). STAT3 overekspression ophævede den vækstinhiberende og proapoptotiske virkninger af P-V in vitro (fig. S16). For eksempel, induktion af apoptose af PV i STAT3

høje

celler var mindre end halvdelen af ​​det i STAT3

normale

celler (2,2 vs. 5,2 gange stigning af annexin V (+) celler efter 24 timers behandling. fig S16B). Ligeledes overekspression af STAT3 halveret induktion af mitokondrie O

2

– niveauer ved PV (6,1 gange forøgelse af MitoSOX Rød (+) celler i STAT3

høj

celler vs . 12.6-fold stigning i STAT3

normale

celler. figur S16C). Den overekspression af STAT3 i mitokondrier af STAT3

høje

celler blev bekræftet ved immunoblotting.

For at vurdere disse resultater in vivo, vi implanteret ortotopisk i nøgne mus STAT3

høj

eller STAT3

normale

celler. Efter 18 dages behandling, PV undladt at påvirke væksten af ​​STAT3

høj

tumorer i modsætning til 72% inhibering af STAT3

normale Salg tumorer (p 0,001; fig. 5A). PV undladt at undertrykke niveauerne af STAT3 eller dets afhængige proteiner Bd-x

L, Mcl-1 og Bcl-2 i STAT3

høje

tumorer, det gjorde undertrykke dem alle i STAT3

normale

tumorer (fig. 5B-C og S17).

(A) MIA PaCa-2 celler med basal (STAT3

normal

) eller overudtrykt STAT3 (STAT3

høj

) niveauer blev orthotopisk implanteret i nøgne mus, som derefter blev behandlet uden (kontrol) eller med PV 150 mg /kg i 18 dage.

Top

: Billeder af repræsentative pancreas tumorer.

Bund

: Pancreastumor vægt (gennemsnit ± SEM). *

s

0.01 vs

. kontrol;

#

s

0.01 vs

. STAT3

høj

P-V-behandlede gruppe. (B) STAT3 og Mcl-1-ekspression i STAT3

normal

STAT3

høj

MIA PaCa-2 ortotopisk tumor vævssnit fra kontrol og PV-behandlede mus (x20 ). (C) Immunoblots for STAT3 og Bcl-x

L i ortotopisk tumorprøver. Hver bane repræsenterer en anden tumorprøve. Loading kontrol: β-actin. (D) MIA Paca-2-celler med overudtrykt STAT3 Y705F mutant (STAT3

Y705F

) niveauer blev orthotopisk implanteret i nøgne mus, som derefter blev behandlet uden (kontrol) eller med PV 150 mg /kg for 18 dage. Pankreatisk tumorvægt (gennemsnit ± SEM). (E) AsPC-1-celler med basal (STAT3

normal

) eller overudtrykkes mitokondrier målrettet, STAT3 (MLS-STAT3) niveauer blev orthotopisk implanteret i nøgne mus, som derefter blev behandlet uden (kontrol) eller med PV 150 mg /kg i 21 dage. Pankreatisk tumorvægt (gennemsnit ± SEM). *

s

0.01 vs

. kontrol;

#

s

0.01 vs

. MLS-STAT3 PV-behandlede gruppe.

For at bekræfte, at mitokondrier STAT3 er en væsentlig mål for PV, genereret vi MIA PaCa-2 celler stabilt overudtrykker STAT3

Y705F

mutant [16], som bevarer mitokondrie funktion, men mangler nukleare transkriptionel aktivitet [5]. Vi implanteres disse celler orthotopisk i nøgne mus, og behandlede dem med eller uden P-V i 18 dage. Ved aflivning, PV undladt at påvirke væksten af ​​STAT3

Y705F

tumorer, hvis vægt var sammenlignelig med kontrol mus (fig. 5D).

For yderligere at undersøge, hvilken rolle