PLoS ONE: Cryptosporidium parvum Infektion i SCID mus inficeret med kun én oocyst: qPCR Vurdering af Parasite replikering i væv og Udvikling af Digestive Cancer

Abstrakt

dexamethason (Dex) behandlede Alvorlige kombineret immundefekt (SCID) mus var tidligere beskrevet som udvikle fordøjelsessystemet adenocarcinom efter massiv infektion med

Cryptosporidium parvum

så snart som 45 dage efter infektion (PI). Vi havde til formål at bestemme den minimale antal oocyster stand til at inducere infektion og dermed gastrointestinale tumorer i denne model. Mus blev udfordret med kalibrerede oocyster opslæmninger indeholdende bestemt doser af: 1, 10, 100 eller 10

5 oocyster af

C. parvum

Iowa stamme. Alle indgivne doser var infektiøse for dyr, men øgede oocyst udfordring fører til en stigning i mus infektivitet (P = 0,01). Udskillelse af oocyster blev detekteret efter 7 dage P.I. efter inokulation med mere end 10 oocyster, og efter 15 dage i mus udfordret med en oocyst. I grupper udfordret med lavere inokula, parasit vækstfase var signifikant højere (P = 0,005) sammenlignet med mus inokuleret med højere doser. Efter 45 dage P.I. alle grupper mus havde en middelværdi på udskillelse af oocyster overlegen til 10.000 oocyster /g fæces. Det mest imponerende observation af denne undersøgelse var påvisningen af, at

C. parvum

-induceret fordøjelsessystemet adenocarcinom kan skyldes infektion med lave doser af

Cryptosporidium

, selv med kun én oocyst: i mus podet med lave doser, blev neoplastiske læsioner opdages så tidligt som 45 dage P.I. både i maven og ileo-caecal region, og disse læsioner kan udvikle sig i en invasiv adenokarcinom. Disse resultater viser en stor forstærkning effekt af parasitter i muse væv efter udfordring med lave doser som bekræftet ved kvantitativ PCR. Evnen af ​​

C. parvum

at inficere mus med én oocyster og udvikle fordøjelsessystemet adenocarcinom tyder på, at andre pattedyrarter, herunder mennesker kunne også være modtagelige for denne proces, især når de er alvorligt immunkompromitterede

Henvisning:. Benamrouz S, Guyot K , Gazzola S, Mouray A, Chassat T, Delaire B, et al. (2012)

Cryptosporidium parvum

Infektion i SCID mus inficeret med kun én oocyst: qPCR Vurdering af Parasite replikering i væv og Udvikling af Digestive Cancer. PLoS ONE 7 (12): e51232. doi: 10,1371 /journal.pone.0051232

Redaktør: Gordon Langsley, Institut national de la santé et de la recherche médicale – Institut Cochin, Frankrig

Modtaget: September 16, 2012; Accepteret 31. oktober, 2012; Udgivet: December 13, 2012 |

Copyright: © 2012 Benamrouz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Særlig støtte blev leveret af katolske Institute of Lille (ICL), herunder et tilskud til Sadia Benamrouz. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Forskning, Frankrig (EA3609 /4547 Université de Lille 2), Føderative Institut for Forskning 142 (Institut Pasteur de Lille), og den franske National Research Agency (giver No. ANR-09-ALIA-009 og ANR-10-ALIA-004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cryptosporidium

arter på verdensplan spredt Apicomplexan parasitære protister, der inficerer oftest mavetarmkanalen af ​​fisk, padder, krybdyr, fugle og mere end 150 arter af pattedyr, herunder mennesker [1]. Infektionen skyldes indtagelse af

Cryptosporidium

oocyster gennem indtagelse af fecally forurenet mad eller vand eller gennem direkte person,

–

til-person eller dyr til person kontakt [2]. Sværhedsgraden af ​​sygdommen hos patienter varierer fra asymptomatisk til dødelig cryptosporidiose, afhængigt af inficerende arter, deres infektionsstedet, alderen og immunstatus værten. Inficerede immunkompetente individer ofte udvikle akut gastroenteritis mens immunkompromitterede individer bliver kronisk og undertiden dødeligt ramt [2].

I øjeblikket mere end 20

Cryptosporidium

arter betragtes som gyldige [3], og to store arter,

Cryptosporidium parvum

C. hominis

, er ansvarlige for de fleste menneskelige tilfælde af cryptosporidiose [4]. En høj smitsomme magt

Cryptosporidium

isolater fra mennesker eller dyr blev rapporteret [5]. Således i raske frivillige uden serologisk tegn på tidligere infektion med

Cryptosporidium

, en oral dosis på 30

C. parvum

oocyster forårsaget infektion [5]. Den samme gruppe rapporterede, at

Cryptosporidium hominis

ID50 var 10 oocyster [4]. Derudover blev det også rapporteret, at en enkelt oocyster af

C. meleagridis

kan producere et patent infektion i steroid-behandlede C57BL /6 mus [6].

For at undersøge de biologiske og patologiske afvigelser mellem

Cryptosporidium

arter eller stammer og at bidrage til forståelsen af ​​dynamikken i infektionen, Certad og samarbejdspartnere udviklet en reproducerbar dyremodel for kronisk cryptosporidiose hjælp Dex-behandlede voksne SCID-mus [7]. Dyr blev inokuleret med enten

C. parvum

som parasitises tarmkanalen, eller med

C. muris

som har en tropisme for maven af ​​mus. Uventet fandt de ved hjælp af denne model, et inokulum på 10

5 oocyster af

C. parvum

men ikke

C. Muris

var i stand til at inducere udviklingen af ​​invasiv fordøjelsessystemet adenocarcinom [7]. Men der er minimun antal oocyster, der kan producere både infektion og fordøjelsessystemet neoplasi i denne model? Spørgsmålet er vigtigt så vidt denne model kan bruges til at udforske de fænotypiske egenskaber af

Cryptosporidium

prøver isoleret fra human afføring eller miljø (hovedsagelig vand og fødevarer), hvor oocyst mængder ofte kan være meget lav. For bedre at beskrive vores dyremodel, vi udforskede den potentielle evne til frisk isolerede

Cryptosporidium

oocyster at fremkalde både patent infektion og gastrointestinale neoplastiske forandringer, når det administreres ved meget lave doser.

Materialer og metoder

Cryptosporidium parvum

oocyster

C. parvum

IOWA oocyster blev købt fra Waterbo

RNE ™, Inc. Hotel (New Orleans, Louisiana). Stamopløsningen af ​​oocyster blev opbevaret i afsendelse mellemstore (phosphatpufret saltvand eller PBS med penicillin, streptomycin, gentamycin, amphotericin B og 0,01% Tween 20) ved 4 ° C indtil anvendelse. Fravær af bakterier og svampe var sikret ved at teste oocyster suspensioner på kimtal Agar (37 ° C, 1 uge) og på Sabouraud plader (37 ° C, 1 uge).

Animal kilde

CB17-SCID 6-7 uger gamle hunmus blev opnået fra en koloni avlet og regelmæssigt kontrolleres for at vurdere infektioner (herunder

Helicobacter

spp.) på Pasteur Institute of Lille (Frankrig). Dyr blev holdt under aseptiske betingelser i en isolator under hele eksperimenter som beskrevet tidligere [7], [8], [9], [10]. Dyreforsøg blev udført i dyret facilitet i Pasteur Institute of Lille (forskning akkreditering nummer, A59107). Den eksperimentelle protokol blev godkendt af den franske regionale komité (autorisationsnummer CEEA 112.011). Evaluering af aspekter af dyrs tilstand blev udført for at konstatere lidelse. Kliniske tegn, som kan udgøre et slutpunkt inkluderet, men var ikke begrænset til: hurtig eller progressiv vægttab, invaliderende diarré, ru pels, foroverbøjet kropsholdning, sløvhed eller enhver tilstand forstyrrer daglige aktiviteter (f.eks spise eller drikke, mobilisering, eller eliminering) .

Eksperimentel design

SCID mus blev administreret med 4 mg /l dexamethasonnatriumphosphat (Dex) (Merck, Lyon, Frankrig) via drikkevandet [7], [11]. Dexamethason administration begyndte to uger før oral podning med

Cryptosporidium

oocyster (se nedenfor) og blev opretholdt under hele eksperimenter. Dex-tilsat vand blev erstattet tre gange om ugen.

Oocyster blev inokuleret til mus ved oral-gastrisk tvangsfodring med 18-20 gauge sonderne. Hver mus blev podet med 200 pi PBS indeholdende forskellige mængder af oocyster: 1, 10, 100 eller 10

5. For hver dosis 4 til 8 mus blev inokuleret (gruppe 1 til gruppe 4). Negative kontrolmus blev inokuleret med PBS (n = 4) eller med et inokulum på 10

5 varme inaktiveret oocyster (90 ° C, 15 min) (n = 4). Efter gavage mus blev huset i sterile capped bure. Inficerede mus blev individualiseret at undgå fysisk kontakt og minimere risikoen for infektion med krydskontaminering og negative kontrol mus blev grupperet. Musene blev fulgt op til 100 dage P.I. til evaluering af infektivitet og neoplastiske læsioner udvikling.

Udarbejdelse af kalibrerede oocyst suspensioner

oocyster koncentration af

C. parvum

Iowa stamopløsning blev bekræftet ved måling i tre eksemplarer 10 pi-portioner. Stikprøven fraktioner blev anbragt på en multi-brønd slide, fik lov til at tørre og fikseret med methanol. En direkte immunofluorescens assay (DFA) med en FITC-konjugat anti-

Cryptosporidium

monoklonalt antistof (Cellabs Pty. Ldt., Croissy-Beaubourg, Frankrig) blev gjort. Brønde blev undersøgt ved en forstørrelse på × 400 og fluorescerende oocyster blev talt i 10 tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter. Før podning blev oocyst levedygtighed stamopløsningen anslået af en trypsin-taurocholat excystation test [12]. Baseret på excystation sats (50%), blev seriefortyndinger udføres for at forberede alle doser. Doserne af ≤100 oocyster blev fremstillet i 6 portioner på 200 pi: 5 portioner blev verificeret til vurdering af potentielle forskelle med den påtænkte inokulum og den sidste prøve blev inokuleret til mus. Verifikation af mængden af ​​oocyster i hver alikvot blev gjort ved filtrering prøver gennem et 0,4 um 25 mm sort polycarbonat filter. Derefter blev en DFA udført på filteret, som beskrevet tidligere. Hele filteret blev derefter monteret på et objektglas med Citifluor mounting medium (Biovalley). Oocyster stede på hele overfladen af ​​filteret blev talt (ved en forstørrelse på 400) ved manuel scanning på et epifluorescensmikroskop (Axioplan 2, Zeiss). Gennemsnittet af infektiøse oocyster optalt efter kontrol af portioner er repræsenteret i tabel 1.

udskillelse af oocyster vurdering

For at vurdere udskillelse af oocyster i løbet af

Cryptosporidium

infektion blev frisk udskilte fækalpellets samlet tre gange om ugen. Hver mus blev overført til en individuel rent bur under 30-60 min. Fæces blev anbragt i en mikrorør og vægtes før tilsætning og homogenisering i sterilt MilliQ vand. Detektering og kvantificering af udskillelse af oocyster blev gjort ved immuno-magnetisk separation (IMS) under anvendelse af Dynabeads anti-

Cryptosporidium

kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig) ifølge leverandørens anbefaling og som tidligere beskrevet [8] , [10]. Oocystsuspensionen var fastsat på immunofluorescensglas og mærket med en FITC-konjugat anti-

Cryptosporidium

monoklonalt antistof (Cellabs Pty.Ldt., Croissy-Beaubourg, Frankrig). Tælling af oocyster blev udført på hele overfladen af ​​hver brønd ved en forstørrelse på × 400, og antallet af parasitter blev udtrykt per gram fæces. Infektivitet blev udtrykt som den andel af dyrene, blev inficeret ved hver dosis.

Histologisk analyse og immunhistokemi

Periodisk eller når tegn på forestående død dukkede op, blev mus eutaniseret af CO

2 inhalation . Mave og ileo-caecal regioner blev fjernet fra hver mus, fikseret i 10% neutral formalin og indlejret i paraffin. Sektioner af 5 um tyk blev farvet af hæmatoxylin-eosin (Leica Autostainer-XL, Rueil-Malmaison, Frankrig) eller anvendes til immunhistokemi.

Læsioner på forskellige steder blev scoret i henhold til “nomenklaturen for Histologisk Vurdering af Intestinal tumorer i Rodent “, og i forhold til” Wien klassifikationen “af de epiteliale neoplasi i mavetarmkanalen for mennesker”, som tidligere med små modifikationer [8], [10]. Kort fortalt: 0, ingen læsion; 1, inflammation og /eller regenerative ændringer; 2, lav kvalitet intraepitelialneoplasi (LGIEN); 3, høj kvalitet intraepitelialneoplasi (HGIEN), carcinoma in situ (begrænset til epitelet) eller intramucosal adenocarcinom (invasion i lamina propria gennem basalmembranen af ​​kirtler). 4, submukøse adenocarcinom når kirtler trænge gennem muscularis mucosa; 5, invasiv adenokarcinom med invasionen gennem muscularis ind i subserosa.

Følgende histokemiske og immunhistokemiske analyser blev udført ved hjælp af den BenchMark XT farvningsmodulet (Ventana medicinsk system, Meylan, Frankrig).

Den Volgens-Gomori farvning (retikulinfibre) [13] blev anvendt til vurdering af basalmembran integritet. Et monoklonalt muse-antistof til cytokeratin (ufortyndet) (AM071-5 M, Biogenex, Holland) blev anvendt til at markere epitelceller. Muskelfibre blev farvet ved anvendelse af et anti-alfa glatmuskelactin monoklonalt antistof (fortynding 1:100) (M0851, Dako, Danmark). Snittene blev undersøgt ved hjælp af en Leica DMRB mikroskop udstyret med et Leica digitalkamera tilsluttet en Imaging Research MCID analysesystem (MCID software, Cambridge, Storbritannien).

Kvantificering af parasitter i mus væv

DNA-ekstraktion fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede vævsprøver.

paraffin indlejret væv fra ileo-caecal region fra 17 mus var til rådighed til molekylær analyse. DNA blev ekstraheret fra en blanding af 2 dele af 25 um af hvert væv blok. Histologiske snit blev bearbejdet ved anvendelse af xylen og ethanol i paraffin fjernelse og blev derefter rehydreret. At forstyrre oocysterne blev prøverne nedfrosset (-80 ° C, 5 min) og optøet (99 ° C, 4 min) seks gange og blev til sidst sonikeret i 1 min. DNA blev derefter ekstraheret ved hjælp af NucleoSpin væv (Machery Nagel, Düren, Tyskland) følge instruktionerne producenten bortset fra, at proteinase K-fordøjelse blev udført natten over.

Real time kvantitativ PCR (qPCR) analyser.

To TaqMan systemer blev udviklet:

Cryptosporidium

Taqman assay og in-house mus Taqman assay. Den primere og TaqMan sonde, der anvendes til

Cryptosporidium

qPCR assay blev de rapporteret af Fontaine og Guillot (2002) [14], der er placeret inde i en specifik 452 bp sekvens (Genbank AF188110) til stede i en enkelt kopi i genomet. De fremadrettede og reverse primere forstærkes en 138 bp fragment. Det fluorescerende TaqMan-probe blev mærket ved 5′-enden med 6-carboxy-fluorescine (FAM) reporter-farvestof og ved 3′-enden med det sorte hul quencher 1 farvestof (BHQ-1). For muse Taqman assay var målet beta-actin-gen (GenBank accessionsnummer AC144818), en enkeltstrenget kopital housekeeping-gen. Den forreste (5′-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3 ‘) og revers (5′-CTGAGAAGCTGGCCAAAGAGA-3′) primere blev udformet til at opformere en 68-pb fragment. Det fluorescerende TaqMan-probe (5’-CCCAGGTCAGTATCCCGGGTAACCC-3 ‘) blev mærket ved 5′-ende med hexachlor-6-carboxy-fluorescein (HEX) reporter-farvestof og ved 3’-enden med den BHQ-1 udslukningsfarvestof.

hver amplifikation blev udført i en 25-pi reaktionsblanding, som indeholdt 1 × iQ ™ Supermix (Bio-Rad, Frankrig), 400 nM af hver

Cryptosporidium

primer eller 200 nM af hver primer actin, 100 nM af

Cryptosporidium

sonde eller 50 nM af beta-actin sonde og 5 pi DNA-prøve. De qPCR reaktioner blev udført på en Rotor-Gene 6000 instrument (Corbett Research, Qiagen, Frankrig) og omfattede en indledende denaturering ved 95 ° C i 15 minutter efterfulgt af 49 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 s og annealing /forlængelse ved 60 ° C i løbet af 1 min. erhvervelse Fluorescens blev gjort umiddelbart efter hver annealing /forlængelse trin.

Alle prøver blev målt i tre eksemplarer på hvert assay og negative kontroller uden skabelon blev inkluderet i hver PCR-kørsel. For at omgå virkningen af ​​PCR-inhibitorer, blev hver DNA-ekstrakt testet ren eller fortyndet 10 og 100 gange. Forstærkning og dataanalyse blev udført med Rotor-Gene 6000 Software.

Kvantificering standarder og normalisering af parasitter i væv.

Specifikke eksterne standarder blev konstrueret til både target gener af interesse ved kloning fragmentet i et plasmid.

Cryptosporidium

og væv standardkurver blev derefter genereret fra seks serielle fortyndinger af plasmid-DNA med kendte mængder af input kopi numre i hver reaktion. Lineær regression af standarder fortyndingsserier og beregning af den tilsvarende R

2 værdier blev udført ved anvendelse af Rotor-genet software. Nøjagtighed af absolut kvantificering bygger på den antagelse, at DNA amplifikationseffektiviteter er ens mellem standarden og de testede prøver. For at teste en mulig påvirkning af plasmid-DNA i genomisk DNA kvantificering, linearitet og effektivitet både qPCR assays blev også evalueret med både genomisk

Cryptosporidium

og murine DNA. Antallet af

Cryptosporidium

genom og murine beta-actin genkopier i amplifikationsreaktioner blev automatisk beregnet af softwaren med henvisning til de eksterne plasmidisk standardkurver. For nøjagtig sammenligning af parasitinfektion i vævsprøver, blev mængden af ​​total værts-DNA i hver prøve normaliseret ved TaqMan qPCR af den murine beta-actin-genet. Kvantitativ parasitbelastning data blev derfor udtrykt som forholdet mellem

Cryptosporidium

genom nummer over musegenomet tal for hver prøve. Men for nemmeste sammenligning mellem prøver, variationer i prøve belastning blev korrigeret ved normalisering af

Cryptosporidium

genom kopier til 10

6 beta-actin kopier.

Statistisk analyse

Fishers eksakte test (to-halet) blev anvendt til at analysere infektivitet (sammenligning grupper inficeret med doser ringere end 10 eller større end 10 ° oocyster) eller parasit belastninger i væv. En analyse af varians (ANOVA) blev udført for at redegøre for effekten af ​​relevante faktorer (inokula, dag P.I.) og deres interaktioner på daglig oocyst udskillelse. Dataanalyse blev udført med den statistiske software Graphpad. Signifikans blev defineret som P 0,05

Resultater Salg

For at vurdere infektion følsomhed af mus udfordret med kalibrerede suspensioner indeholdende forskellige tilsigtede doser, blev mængden af ​​oocyst i fæces anslået periodisk.. Alle indgivne doser indeholdende forskellige mængder af oocyster afsløret til at være infektiv for Dex-behandlede SCID-mus, men forøge oocyster doser føre til en stigning i niveauet af infektivitet (P = 0,01). To ud af 7 mus (28,5%) podet med en tilsigtet dosis på 1 oocyster, 6/8 mus (75%), der modtager tilsigtede dosis på 10 oocyster, og alle mus inokuleret med påtænkte doser på 10

2 og 10

5 levedygtige oocyster udviklet kronisk infektion indtil eutanasi (45-100 dage PI). Ingen af ​​de negative kontrolmus udledes oocyster efter oral inokulering med enten PBS eller 10

5 varmeinaktiverede oocyster (tabel 1).

Mønstret for udskillelse af oocyster af de forskellige grupper er vist i fig. 1. På dag 7 P.I. udskillelse af oocyster blev påvist i mus fra gruppe 2, 3 og 4 (udfordret med 10, 100 og 10

5 oocyster), men ikke i dyr fra gruppe 1 (belastet med en oocyst). Parasit udgydelse af dyr fra denne sidstnævnte gruppe blev der for første gang efter 15 dage P.I. ANOVA-analyse af hele datasættet viste, at dag P.I. og inokulum størrelse stor indflydelse de geometriske middelværdier af oocyster Sheding (P = 0,02 og 0,005 henholdsvis): på 75 dage PI, mus podet med påtænkte doser på 1, 10, 100 og 10

5 oocyster havde en mangedobling af 3,3 , 3,25, 2,26 og 1,45 log sammenlignet med initial inokulum. Efter 45 dage efter infektion, alle grupper af mus har en middelværdi på udskillelse af oocyster overlegen til 10.000 oocyster /g bekræfter den høje proliferationshastighed af parasit vækst ved lavere doser.

Eksperimentelle grupper blev inokuleret med påtænkte doser på 1 , 10, 100 og 10

5 oocyster. Hvert punkt repræsenterer en mus, linierne bliver de geometriske middelværdier for udskillelse af oocyster pr gruppe. Kun dyr med udskillelse af oocyster på et præcist tidspunkt af dagen er repræsenteret. Ingen af ​​mus inficeret med en oocyst frigivet parasitter indtil dag 15 (se materialer og metoder til udskillelse af oocyster vurdering).

Efter histologisk undersøgelse af væv, gastrointestinale neoplastiske læsioner (tabel 1) blev observeret i alle Dex -behandlet SCID-mus inficeret med

C. parvum

, uanset inoculum (figur 2).

A. Invasiv adenokarcinom i antropyloric region (pile) i en mus 100 dage efter injektion .. Bar = 1250 um (hematoxylin og eosin). B. Invasiv adenokarcinom i antropyloric region i en mus 100 dage P.I. viser parasitter inde i kirtler (pile). Bar = 50 um (hematoxylin og eosin). C. adenom i ileo-caecale region i en mus 45 dage efter injektion .. Bar = 625 um. D. Høj kvalitet intraepitelial neoplasi i ileo-caecale region i en mus 45 dage P.I. med mange parasitter (pil) inde i kirtler. Bar = 25 um (hæmatoxylin og eosin).

I maven, blev neoplastiske læsioner lokaliseret i antropyloric region og blev opdaget så tidligt som dag 45 P.I. i alle grupper af inficerede mus. På dag 45 P.I. disse læsioner blev beskrevet som lav kvalitet intraepitelialneoplasi (LGIEN) eller invasiv adenokarcinom for gruppe 1 og 2, og som høj kvalitet intraepitelialneoplasi (HGIEN) eller invasiv adenokarcinom for gruppe 3 og 4 (tabel 1). På dag 100 PI observerede vi tilstedeværelsen af ​​adenocarcinom i submucosa invaderer eksterne muscularis lag i antro-pylorique region fra en mus inokuleret med en enkelt oocyster (figur 2A, 2B).

I ileo- caecum region, med påtænkte doser på 1 og 10 oocyster en polypoid slimhinde (adenom), der indeholder LGIEN og HGIEN læsioner blev observeret henholdsvis 45 og 100 dage PI (Figurerne 2C, 2D). Med større inokulum (100 oocyster) HGIEN blev observeret tidligere (dag 45 P.I.). Retikulin farvning og cytokeratin immuno-mærkning tillod bekræftelse af HGIEN: en fragmenteret basalmembran og neoplastiske epitelceller i lamina propia blev observeret. Disse ændringer, som er typiske for intramucosal adenocarcinom, blev observeret i mus i gruppe 3, efter kun 80 dage PI. Neoplastiske læsioner syntes at være mere alvorlige i maven end i ileo-caecale region.

For kvantitativ analyse af

Cryptosporidium

DNA i ileo-caecum væv, 17 mus blev udvalgt. Standard kurver genereret for både

Cryptosporidium

og beta-actin viste en reproducerbar lineært forhold mellem Ct værdi og log transformeret antal kopier over næsten fem størrelsesordener af DNA fortynding. Korrelationskoefficient opnået ved lineær regressionsanalyse af tre uafhængige forsøg var R

2 = 0,99 for både

Cryptosporidium

og mus plasmider. DNA amplifikationseffektiviteter var 99% for

Cryptosporidium

og 89% for mus. Standardkurver blev også udført med

Cryptosporidium

genomisk DNA samt muse genomisk DNA. For både, plotning af delta Ct-værdier (Ct plasmid-DNA – Ct genomisk DNA) mod logaritmen til fortyndingsfaktorer resulterede i en varmekurve lavere end 0,1 (data ikke vist), hvilket viser, at plasmid-DNA kan anvendes til at kvantificere genomisk DNA .

antallet af

Cryptosporidium

og mængden af ​​murine DNA til stede i hver prøve blev kvantificeret ved interpolation af de tilsvarende Ct-værdier i standard kurverne for

Cryptosporidium

DNA og for det murine beta-actin-genet. Niveauer af parasit-DNA i væv af undersøgte dyr er vist i tabel S1. I alt 14 ud af 15 undersøgte podede mus blev koloniseret med

Cryptosporidium

.

Parasitten belastning i væv fra mus podet med højere inokulum (10

5) var højere i forhold til mus inokuleret med lave doser (≤100 oocyster) (p 0,001). Men når man sammenligner væv belastninger på samme tid P.I. (45 dage) mellem den laveste og den maksimale inokulum, mus N ° 12, podet med 100.000 gange flere oocyster end mus nr 1, havde kun 3,6 gange mere parasit belastninger. Nej

Cryptosporidium

DNA blev fundet i en mus (N ° 7) inokuleret med 10 oocyster (tabel S1). Denne mus udviklede hverken infektion eller neoplastiske læsioner, som også bekræftet af IMS-DFA.

For 6 prøver,

Cryptosporidium

qPCR var ikke positivt for alle 3 replikater antagelse en Poisson fordeling af skabelon, når detektering meget lave antal mål-kopi. For sådanne prøver, de opnåede Ct-værdier var mellem 39 og 40 som angiver, at PCR-reaktionen indeholdt teoretisk 1-genomet kopi. Faktisk blev detektionsgrænsen for analysen nået, og vi kunne ikke forsøge kvantificering med et acceptabelt niveau af nøjagtighed og pålidelighed. Kørsler af

Cryptosporidium

qPCR blev testet med prøver ved en lavere fortynding punkt for at opnå lavere Ct-værdier. Usandsynligt, de blev ikke valideret følge af en negativ PCR resultat (Ct fravær) eller fordi de gennemsnitlige ændringer i Ct ikke frembragte den forventede ændring (respekterer 10 gange fortynding).

Histologiske læsioner blev altid forbundet med forekomst af parasitter, som det blev observeret ved mikroskopi (figur 2B, 2D) og qPCR (tabel S1). DNA påvisning af parasitter under qPCR bestyrker, at selv mus med laveste parasitter belastninger i væv havde neoplastiske læsioner. Hverken parasitter eller læsioner blev påvist i negative kontrolgrupper (mus podet med PBS uden parasitter eller med varme-inaktiverede oocyster) (Tabel 1, S1).

Diskussion

De nuværende resultater viser, at Dex -behandlet SCID-mus er modtagelige for infektion med ekstremt lav

C. parvum

inokulum størrelser på 1 og 10 oocyster. Disse podede kalibrerede doser blev vurderet flere gange Ved mikroskopi (se Materialer og Metoder og tabel 1). Denne dyremodel af Dex behandlede SCID mus viste at have en høj følsomhed for

C. parvum

infektion og kan være meget nyttigt at vurdere tilstedeværelsen af ​​denne parasit i kliniske eller miljømæssige prøver, hvor oocyster satser kan være meget lav (f.eks postevand, spiselige grøntsager, insekter).

Vi sammenlignede vores resultater med data, der tidligere er rapporteret for en anden dyremodel for corticoid behandlede C57BL /6N mus inficeret med en oocyster af samme

C. parvum

Iowa isolere [15]. De fandt 17% af infektivitet efter inokulation med en enkelt oocyster mod 29% i vores undersøgelse [15]. Da disse forfattere også diskuteret, kan forskellige grunde forklare det faktum, at ikke alle mus blev smittet med en enkelt parasit [15]: Den oocyst ikke var til stede i inokulum på grund af den seriel fortynding metoden, oocyst kunne forblive i gauge påfyldningsrør under podning, at oocyst var ikke i stand til at nå tarmen, eller det var ikke rentabelt på tidspunktet for podning (en levedygtighed på 50% blev målt i bestanden suspension).

Derudover er der i vores undersøgelse dyr udfordret med lav inokulum udviklet kronisk infektion og kaste oocyster uden stationær eller tilbagegang fase indtil afslutningen af ​​eksperimentet.

modellen af ​​immunsupprimerede C57BL /6 voksne mus [15] blev også testet til formering af

C. meleagridis

(arter fra fugle) og 50% af musene udfordret med en enkelt

C. meleagridis

oocyst blev smittet [16]. Men i trods af dyb immundepression af SCID-mus, forstærket yderligere ved Dex administrerende, disse dyr var tilsyneladende ikke modtagelige for isolater af andre

Cryptosporidium

arter som

C. meleagridis

(upublicerede observationer),

C. hominis Hotel (fra mennesker) eller

C. molnari Hotel (fra fisken

Sparus auratus

) [10]. Således som det er blevet beskrevet for andre opportunistiske parasitiske sygdomme, kunne immunosuppression være ikke nok til at bryde artsbarrieren (eller host-artsspecificitet) [17].

Alligevel mest imponerende observation af det foreliggende arbejde er påvisningen af, at infektion med lave doser, selv med kun én oocyster af

C. parvum

kan føre til udvikling af fordøjelsessystemet invasiv adenokarcinom. Vi viste før, at vores model af Dex-behandlede SCID mus var nyttigt at vurdere evnen af ​​

C. parvum

at fremkalde fordøjelsessystemet adenocarcinom i dyr inficeret med doser mellem 10

5 og 10

8 oocyster [7], [8], [10], men det mindste antal oocyster stand til at inducere den slags læsioner var ikke kendt indtil nu. Faktisk som det tidligere blev observeret, efter infektion med højere inocula (10

5-10

7) i

C. parvum

Iowa stammen [7], [10], i nærværende undersøgelse neoplastiske læsioner (LGIEN og HGIEN) blev opdaget så tidligt som dag 45 P.I. både i maven og i ileo-caecale region Dex behandlede SCID-mus udfordret med bestemt doser på 100, 10 eller endda en oocyster, og disse læsioner kan også udvikle sig i en invasiv adenokarcinom forløber gennem alle lag af maven og ileo-caecal region.

Konsekvent, bemærkede vi, at hos mus podet med lav inokula parasitten udskillelsen steg hurtigt og nåede et gennemsnit på udskillelse af oocyster på mere end 10.000 oocyster /g fæces på 45 dage PI. det ser ud til, at de få oocyster podet til mus havde en vigtig multiplikation og at en stigning i oocyst podet doser hæve infektivitet, men ikke nødvendigvis udgydelse af parasitter og patologiske udfald.

i eksperimentelle infektioner af immunkompetente dyr, forskellige observationer har blevet rapporteret. Hos kvæg efter inokulering med så lidt som en røde blodlegemer inficeret med

Babesia bovis

, anden Apicomplexan parasit, var der en stigning i den præpatente periode (som vi også observeret) men den høje sygelighed og dødelighed hos dyrene blev ikke ændret i forhold til dem smittet med højere inocula [18]. Disse fund er i modsætning til dem for infektioner med haemoparasite

Theileria parva

, hvor infektion af kvæg med et lavt inokulum resulterede i nedsat sygdommens sværhedsgrad og lavere dødelighed [19]. Interessant nok i studier af

Eimeria

infektion af kyllinger og rotter, var det især bemærkelsesværdigt, at med den største infektionsdosis, antallet af oocyster produceret pr oocyst inokuleret var mindre [20].

On derimod i vores tidligere undersøgelse, det udskillelse af oocyster efter podning med 10

5 oocyster var meget højere [8].