PLoS ONE: Styrkelse af Early Livmoderhalskræft Diagnose med Epithelial Layer Analyse af Fluorescence Lifetime Images

Abstrakt

Dette arbejde rapporterer brug af lag analyse for at hjælpe fluorescens levetid diagnose af cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) fra H E farves cervikale vævssnit. Gennemsnittet og standardafvigelsen af ​​levetider i enkelt region af interesse (ROI) af livmoderhalskræft epitel blev tidligere vist at korrelere til guldstandarden histopatologiske klassifikation af tidlig livmoderhalskræft. Disse tidligere definerede enkelt ROI’er blev ligeligt fordelt i lag til analyse. En 10-lags modellen afslørede en støt stigning i fluorescens levetid fra den indre til de ydre epitel lag af sunde vævssnit, hvilket tyder på en tæt samarbejde med cellulære modenhed. Den kortere levetid og minimal levetid stigning mod epitel af CIN-ramte områder er i god overensstemmelse med fraværet af cellulære modning i CIN. Mean lag levetider i top-halvdel livmoderhalskræft epitel blev brugt som har vektorer for ekstreme læring maskine (ELM) klassificeringen forskelsbehandling. Det blev konstateret, at den foreslåede lag analyse teknik forbedrer følsomheden og specificiteten til 94,6% og 84,3%, henholdsvis, som bedre kan supplere den traditionelle guld standard cervikale histopatologiske undersøgelser

Henvisning:. Gu J, Fu CY, Ng BK, Liu LB, Lim-Tan SK, Lee CGL (2015) Styrkelse af Early Livmoderhalskræft Diagnose med Epithelial Layer Analyse af fluorescenslevetid billeder. PLoS ONE 10 (5): e0125706. doi: 10,1371 /journal.pone.0125706

Academic Redaktør: Margaret McLaughlin-Drubin, Brigham og kvinders Hospital /Harvard Medical School, USA

Modtaget: December 26, 2014 Accepteret: 18 Marts 2015; Udgivet: 12. maj 2015

Copyright: © 2015 Gu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. forfatterne erklærer, at dette arbejde understøttes af en intern opstart tilskud (SUG /NBK /2014) fra Nanyang Technological University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hvert år ca. 300.000 kvinder dør af livmoderhalskræft med cirka 510.000 nye tilfælde diagnosticeres [1, 2]. Forud for invasiv cancer er den langsomt voksende cervikal intraepitelialneoplasi (CIN) fase, hvor tidlig påvisning og behandling er mulig. Derfor har mange cervikale screening protokoller blevet gennemført for at påvise de præmaligne cervikale forandringer og livmoderhalskræft associerede dødsfald betydeligt faldet.

Den primære screeningsmetode til tidlig livmoderhalskræft er Papanicolaou (PAP) smear test. Celler fra livmoderhalsen væg med mistanke tegn på neoplasi indsamles til mikroskopisk undersøgelse. Men den Pap-test er kompliceret og arbejdskrævende, og det viser en samtidig lav følsomhed (≤58%) og specificitet (69%) [3, 4], hvilket indebærer behovet for gentagne prøver at reducere falske negativer. Derudover colposcopy skal efterfølgende udført for at bekræfte abnormitet. I ekspert hænder colposcopy kunne opnå fremragende følsomhed ( 90%), men lav specificitet ( 50%), hvilket yderligere kræver en rettet biopsi for endelig [5] diagnose. Det tyndt skiver biopsi farves med hæmatoxylin og eosin (H E farvede cervikale vævssnit af 32 patienter fra KK Kvinders og Børnehospital (KKH), blev Singapore anvendt til analysen i denne undersøgelse. Hver valgte sektion har klare lagdelte lag, der letter lag analyse skal foretages for denne pilotundersøgelse. Disse vævssnit blev patologisk undersøgt af en overlæge fra KKH og de identificerede regioner i epitelet blev klassificeret som normal, CIN1, CIN2 og CIN3. Prøven Sættet indeholder 10 normal, 8 CIN1, 6 CIN2 og 8 CIN3 livmoderhalskræft vævssnit. Denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af den lokale etiske komité (KK Kvinders og Børns Hospital (KKH), Singapore) og Institutional Review Board (CIRB 2010/745 /C). Skriftligt samtykke blev opnået fra deltagerne for anvendelse af oplysninger i medicinske undersøgelser.

Imaging protokollen og Lifetime Beregning

imaging-protokollen var identisk med den, der anvendes i vores tidligere arbejde [25]. Hvidt lys mikroskopi blev oprindeligt brugt til at lokalisere de identificerede områder af interesse og en tidsopløst fluorescens målesystem, der omfatter en konfokal laser scanning mikroskop (LSM 510, Carl Zeiss, Tyskland) og en tid-korreleret enkelt foton tælling (TCSPC) systemet blev anvendt til fluorescens levetid billeddannelse. Belysningslyskilden er en femtosekund Ti: Sapphire laser (Coherent Mira 900, 76 MHz, 200 fs) drevet ved en bølgelængde på 760 nm. En 20 × objektivlinse (Fluar, Carl Zeiss, NA = 0,75) blev anvendt til at fokusere excitation laserstråle til vævsprøven og at indsamle den fluorescensemission. Fluorescenslevetid billeder blev fanget i en scanningstid vindue på 10 ns med en tidsmæssig opløsning på omkring 39 ps. Erhvervelsen tid for et billede bestående af 256 x 256 pixels var 60 s. Billedet har en pixelstørrelse på ca. 1,8 um.

fluorescens levetid

τ

er defineret som den tid, at udledningen fluorescensintensitet falder til 1 /e af sin oprindelige værdi efter en fluorofor er exciteres af en lyspuls. Den forfald mekanisme i fluorescensemission intensitet

jeg

(t) er beskrevet af [32] 🙁 1), hvor τ = 1 /(Kr + Knr), Kr og Knr er radiative og ikke-strålings overgang satser henholdsvis og

t

er tiden forløbet siden lys excitation. Fluorescenslevetiden blev beregnet med den kommercielle software SPCImage (Becker Hickl, Tyskland). Tærskelværdien for kurvetilpasning blev sat til 50 fotoner så mørke pixel med kumulative fotontællinger på mindre end 50 ikke indgik i levetid beregning. Instrumentet responsfunktion (IRF) blev estimeret på basis af den stigende kant af henfaldskurven og en dobbelt eksponentiel model blev brugt til en god kurvetilpasning med dets reducerede chi-square værdi (χ2) nærmer enhed. Den dobbelte eksponentielle model af fluorescens henfald karakteristisk udtrykkes som: (2), hvor τ

1 og τ

2 er fluorescens levetid, og en

1 og en

2 er fraktioneret bidrag hver livstid komponent. Lifetime værdier blev τ

1 og τ

2, opnået ved hjælp af ikke-lineær mindste kvadraters (NLLS) algoritme [33]. Vores tidligere arbejde har vist, at længere levetid komponent τ

2 distributionen give den bemærkelsesværdige diagnostiske kontrast mellem forskellige livmoderhalskræft stadier [25]. På den anden side blev den kortere levetid komponent τ

1 med en typisk værdi på ~ 30 ps og tilskrives instrumental responstid og har ingen sammenhæng til tissue patologi. En falsk-farvet levetid billede består af 256 × 256 pixels blev genereret ved at kortlægge en bestemt farve til levetid værdien af ​​τ

2 ved hver pixel.

Cervikal Epiteliale Layer Definition og Feature vektorer

epitel regioner i cervikale levetid billeder blev delt i lag for at analysere egenskaberne af levetiden komponent τ

2 langs epitelvækst retning. Celler i epitelet vokse og differentiere progressivt i retningen mod epitheloverfladen. Kælderen membran, en tynd og ikke-cellulære region mellem epitel og den nærliggende stroma, danner en barriere for nedadgående epitelial vækst og er kun brydes, hvis epitel gennemgår malign transformation [34]. Den strukturelle forskel i epitel og stroma gør dem let kendelige i billedet og fluorescenslevetid billede hvidt lys som vist i figur 1. basalmembranen er markeret med en hvid stiplet linie L, mens epiteloverfladen er skitseret med hvid stiplet linie M (Fig 1B). Epithelial tykkelse er defineret som afstanden fra et punkt på epiteloverfladen til basalmembranen langs retningen vinkelret på basalmembranen. I vores måling epitel har generelt en tykkelse på 260 ± 60 um om grov undersøgelse, som er i overensstemmelse med litteratur fra 200-500 um [35]. Epitelet blev inddelt i 3 og 10 samme tykkelse lag, henholdsvis langs retningen af ​​vævsvækst [34] for levetid analyse. Den ROI i epithelet for levetid analyse defineres med samme bredde af hver opdelt lag. Fig 1C viser en typisk cervikal vævssnit epitel opdelt i 10 lag. Lag 1 refererer til det basale lag, mens laget 10 indikerer det overfladiske lag. Det 3-lags modellen analyse er af stor interesse for diagnostisk sammenligning på grund af den klassiske definition af CIN, der er baseret på tykkelsen af ​​epitel dækket af neoplastiske celler. På den anden side er den 10-lags model, der anvendes til at tilnærme den biologiske struktur af en cervikal epitel, med dets cellulære modenhed stigende i retning epitheloverfladen. Den 10-lags analyse model har således den fordel, at evaluere CIN-celler som en funktion af deres modenhed. Endelig er den gennemsnitlige (

μ

) og standardafvigelse (

σ

) af levetid i hver opdelt lag beregnet for klassificering væv.

(a) Hvidt lys billede af H & E farvet vævssnit (b) Falsk farve fluorescenslevetid billede med Målestokken fra 0 til 2 ns. Basalmembran var præget af hvid stiplet linie

L

epitel overflade blev afgrænset af hvid stiplet linie

M

. (C) pixels i hver opdelt lag blev opnået ved at flytte basalmembran pixels i retningen vinkelret på basalmembranen mod epitheloverfladen. Lag er nummereret trinvist fra 1 til 10. Pixels i hver opdelt lag udgør ROI.

Extreme Learning Machine Klassifikation Algoritme

Forskelsbehandling mellem normal og præcancer (CIN1, CIN2, CIN3) cervikale væv blev udført ved anvendelse af et neuralt netværk ELM klassifikator. I forhold til andre konventionelle neurale netværk klassificører såsom support vektormaskine (SVMs) og back-propagation (BP) metode, ELM har en bedre generalisering ydeevne med større læring hastighed, fordi alle vægte i de skjulte knudepunkter er tilfældigt genereret uden at skulle iterativt tunet [36]. Den ELM learning algoritme er implementeret som følger. Overvej en uddannelse sæt Ψ = {(

x

jeg,

t

i) |

x

i = [

x

i1,

x

i2, …,

x

i ]

T ε

R

n,

t

i = [

t

i1,

t

i2, …,

t

im] ε

R

m, i = 1, …,

N

} hvor

x

i og

t

jeg angive input levetid har vektorer og den tilhørende output mål beskriver patologisk tilstand, og

N

repræsenterer antallet af prøver i træningssættet. Den skjulte lag output matrix H og output vægt β af det neurale netværk er beregnet i følgende trin:

Tilfældigt tildele input vægt vektorer a

jeg og skjulte node skævhed b

i, i = 1, …,

L

hvor

L

er antallet af skjulte noder.

L Drømmeholdet værdi blev justeret således, at maksimal nøjagtighed diskrimination blev opnået i denne undersøgelse.

Beregn output funktionen af ​​hver skjult node g (a

i, b

i, x ), i = 1, …, N og det skjulte lag output matrix H = [

g

(a

1, b

1,

x

), …,

g

(a

L, b

L

,

x

)]. Her

g

(a

i, b

jeg,

x

) = 1 /(1 + exp [- (a

jeg ∙

x

+ b

i)]).

Bestem output vægt, β = H

+ T hvor H

+ er Moore-Penrose generaliseret inverse af det skjulte lag output matrix H og H opfylder ligningen Hβ =

t

, hvor β = [β

1, …, β

L

]

T.

i dette arbejde,

n

angiver det samlede antal har komponenter i hver prøve. I 3-lags-analyse,

μ

og

σ

fra lag 1 til lag 3 udgør i alt 6 har komponenter og dermed

n

= 6. I mellemtiden,

m

indikerer de to mulige patologiske tilstande af en cervikal vævsprøve, fx normal eller præcancer, og dermed

m

= 2.

I ELM, output vægt β af det neurale netværk er først beregnet på baggrund af de input har vektorer og deres kendte mål output fra træning datasæt. Dette output vægt β blev derefter anvendt til at bestemme produktionen af ​​trækvektorerne i sættet test data og sammenlignet med deres kendte måloutput at udlede den diagnostiske nøjagtighed.

krydsvalidering blev anvendt til at opnå objektiv udvælgelse af træningsdata og testdata. Dybest set, det opdeler tilfældigt hele datasæt i uddannelse datasæt og test datasæt. Træningsdata og afprøvning datasæt af samme størrelse anvendes til at maksimere nøjagtigheden af ​​ELM algoritme i dette tilfælde. Derfor blev vektorer fra 16 tilfældigt udvalgte prøver valgt som træningsdata mens trækvektorer fra de resterende 16 prøver blev anvendt til testning. I alt 1.000 tilfældige sæt af uddannelse og testdata blev genereret for beregning at reducere klassificering bias. For hvert sæt af tilfældigt udvalgte træningsdata og forsøgsdata, er ELM anvendes til at skelne mellem histologisk identificeret normale og CIN-prøver. Den diagnostiske nøjagtighed (sensitivitet og specificitet) for hvert sæt af træningsdata og test data er derefter beregnet ved at sammenligne ELM resultat med den histologiske identifikation. Endelig betyder følsomhed og specificitet fra 1000 datasæt blev beregnet i overensstemmelse hermed til sammenligning.

Resultater

Lifetime Distribution i Whole Livmoderhalskræft epitel

Fig 1A viser den hvid- lysmikroskopisk billede af en typisk H & E farvet normal cervikal væv og fig 1B viser den tilsvarende fluorescens levetid billede. En sammenligning mellem de to billeder afslører, at yderligere biokemisk kontrast potentielt kunne ekstraheres fra levetiden billedet til at karakterisere cervikale væv. Det kan ses, at epitelet region består af flere lag af tætpakkede celler. Stromaet region, som består af fibroblaster, glatte muskelceller og kollagen [37], er ret forskellige. Grænsen mellem de to regioner kan nemt identificeres som vist i figur 1B.

celle-rige epitel region blev specifikt undersøgt og diagnosticeret med FLIM teknik, da livmoderhalskræft meste stammer fra epitel [38]. Den diagnostiske værdi af middelværdien (

μ

) og standardafvigelse (

σ

) af τ

2 distribution i hele epitel først udforsket til sammenligning med lag analyse. Normale prøver viste sig at have større levetider i området fra 670 ps til 1000 ps mens præcancerøse væv har mindre levetider leveret fra 450 ps til 850 ps. På den anden side, normale prøver har levetid

σ

værdier fordelt mellem 150 ps og 200 ps mens præcancerøse prøver har levetid

o

værdier i området på 170 ps til 280 ps. Dette giver en diskrimination, der skal foretages mellem normale og forstadier cervikale prøver på grundlag af vores tidligere arbejde [25]. Den diagnostiske nøjagtighed hel-epitel analyse blev vurderet med ELM klassificeringen, hvilket giver en gennemsnitlig sensitivitet 62,2% og specificitet på 52,3%.

Tre-Layer Analyse af cervikal epitel Lifetime

Hver cervikal epitel blev delt i 3 lag og den tilknyttede τ

2 distributions- profiler blev ekstraheret for hvert lag og sammenlignes med de patologiske stadier (som vist i figur 2). En konsekvent tendens τ

2 afkortning kan observeres som cervikal væv skrider fra normal til CIN3, bortset fra lag 1, hvor τ forkorter

2, når sygdommen etape går fra CIN2 til CIN3. Levetiden forskel mellem normale og CIN 3 prøver blev estimeret til at være 50 ps på lag 1, 80 ps på lag 2 og 100 ps på laget 3. Mean levetid τ

2 i hver opdelt lag blev anvendt til at danne en 3- dimensionale trækvektorer for ELM klassificering. Den ELM klassificering metode giver en forbedret følsomhed på 81,1% og en nedsat specificitet på 39,6%. Standardafvigelse af τ

2 fordeling blev også undersøgt, men dens varierende tendenser (S1 Fig) ikke bidrager til nogen væsentlig forbedring i diagnose og anses derfor for ukorrelerede for væv patologi. Resultaterne indikerer, at funktionen vektorer omfattende kun de gennemsnitlige τ er

2 tilstrækkelig til at opnå den samme diagnostiske sensitivitet og specificitet.

Her er de gennemsnitlige τ

2 for hver patologisk tilstand blev beregnet ud fra prøven pool, som omfatter 10 normal, 8 CIN1, 6 CIN2 og 8 CIN3 livmoderhalskræft vævssnit og gennemsnit relative standardafvigelse (RSD) blev beregnet til at være 15% for alle kategorier. Flere oplysninger om fejl barer er belyst i S3 Fig.

Ti-Layer Analyse af cervikal epitel Lifetime

Fordelingen af ​​τ

2 i de 10 fordelt lag af hver prøve blev analyseret for de forskellige histologiske etaper og præsenteres i figur 3. Udlodning af τ

2 i de første 5 lag (1-5) blandt normale og CIN prøver blev først sammenlignet. På trods af en konsekvent afkortning af τ

2 i lag (3-5) som CIN skrider frem, værdien af ​​middelværdier τ

2 ændring er under 70 ps, ​​når sammenligningen af ​​den normale epitel med CIN 3 prøver. Derimod var de gennemsnitlige τ

2 distribution fra lag 6 til 10 viser større variation på tværs af forskellige patologiske stadier, med normale væv udviser den længste levetid. De gennemsnitlige τ

2 værdier i lag 6 til 10 blev observeret at konsekvent falde som vævene videre til de præcancerøse faser. Når sammenligningen er lavet af lag 6 til lag 10, foretrækkes det mindste levetid variation af ~ 147ps findes på lag 6 mens den største ændring af ~ 245ps forekommer i laget 10. I lighed med den 3-lags epitel analyse, standardafvigelse

σ

af levetiden τ

2, med dårlig patologisk korrelation (S2 fig), blev ikke medtaget i trækvektorerne for klassificering væv.

Her er de gennemsnitlige τ

2 for hver patologisk tilstand blev beregnet fra prøven pulje, som omfatter 10 normale, 8 CIN1, 6 CIN2 og 8 CIN3 cervikal vævssnit og det gennemsnitlige relative standardafvigelse (RSD) blev beregnet til at være 20% for alle kategorier. Flere oplysninger om fejl barer er præciseret i S4 Fig.

De gennemsnitlige τ

2 værdier af normale og forstadier (CIN1, CIN2, CIN3) prøver i hvert lag blev også afbildet i fig 4 for sammenligning. Inden for hver lag, blev observeret varierende forskelle mellem normale og forstadier prøver, hvilket giver forskellig grad af diagnostisk information. Det er ønskeligt at have en passende kombination af middelværdier τ

2 værdier for at forbedre klassifikationen ydeevne [39].

Her middelværdierne τ

2 for hver patologisk tilstand blev beregnet fra prøven pool der omfatter 10 normal, 8 CIN1, 6 CIN2 og 8 CIN3 livmoderhalskræft vævssnit og gennemsnit relative standardafvigelse (RSD) blev beregnet til at være 18% for alle kategorier. Flere oplysninger om fejl barer er præciseret i S5 Fig.

For at undersøge det optimale antal lag for at tage højde for maksimal nøjagtighed, feature vektorer omfattende gennemsnitlige τ

2 værdier fra successive lag, startende fra lag 10, dvs. epiteloverflade, til et nedre lag (dvs. lag 9) som afskæringsværdien lag er undersøgt. For eksempel kan en typisk sæt vektorer med afskårne lag ved 9 er 2-dimensional indeholdende gennemsnitlige τ

2 værdier fra lag 10 og lag 9, mens afskårne lag ved 6 resultater i et sæt af 5-dimensional funktion vektorer, der består af middelværdier τ

2 fra lag 10 til lag 6. ELM klassificeringen blev brugt til at lave klassifikationer mellem normale og forstadier til prøver. Den tilsvarende følsomhed og specificitet som en funktion af den afskårne lag blev beregnet og vist i figur 5. Det kan ses af afbildningen, at når den afskårne lag aftager fra 10 til 6, stiger følsomheden smule fra 92,8% til 94,6%, mens specificiteten stiger kraftigt fra 30,1% til 84,3%. Både maksimal følsomhed og specificitet forekomme ved cut-off lag af 6. Når den afskårne lag aftager 5-1 både sensitivitet og specificitet fald meget og til sidst falder til en lav værdi på 55,5% og 51,4%, hhv. Den samlede maksimal følsomhed (94,6%) og specificitet (84,3%), opstår, når funktionen komponenter τ

2 fra lag (6-10) blev anvendt til ELM klassifikation.

Optimal følsomhed (94,6%) og specificitet (84,3%) blev samtidigt findes på cut-off lag af 6.

den foreslåede epitel lag analyse med neurale netværk ELM klassificeringen kunne opnå ønskelige forskelsbehandling mellem normale og forstadier cervikale væv når flere trækvektorer fra betyde τ

2 værdier af lag (6-10) blev anvendt. Den optimale følsomhed og specificitet opnået er 94,6% og 84,3%, henholdsvis. Derimod hele epitel analyse gav en følsomhed og specificitet på 62,2% og 52,3% hhv. Tre-lags analyse i overensstemmelse med den generiske definition af CIN opnår en følsomhed på 81,1% og specificitet på 39,6%. Tabel 1 opsummerer de diagnostiske nøjagtighed fra de forskellige analysemodeller anvendes i dette arbejde. Den 10-lags analyse tyder på, at den øverste halvdel epitel (lag 6-10) er den effektive zone for FLIM diagnose med samtidigt høj følsomhed og specificitet. Gennemsnittet af opnåede følsomhed og specificitet (89,5%) er omkring 1,5 gange sådanne afledt af hel-epitel (57,3%) og tre-lags (60,4%) -analyse.

Desuden beregningstiden for data montering og ELM klassifikation blev også beregnet. Tidsforbruget blev halveret sammenlignet med det hel-epitel analyse, der involverer data fitting for hele epitel. Lifetime beregning data NLLS som er i størrelsesordenen flere minutter er beregningsmæssigt intensiv og bidrager mest markant i den samlede behandlingstid [40], mens ELM klassificering tager kun snese sekunder med vores system. Da kun den øverste halvdel epitel er nødvendig for at udlede gennemsnitlige τ

2 værdier, den samlede behandlingstid til at beregne levetid data blev reduceret med to gange.

Diskussion

Dette er en pilot undersøgelse undersøger anvendelsen af ​​laget analyse i FLIM billeder af H & E farvet cervikal vævssnit epitel til tidlig detektion af kræft. En 3-lags epitel model blev først undersøgt for sammenligning med standard 3-tier histologisk klassificeringssystem (CIN1, CIN2 og CIN3), som er baseret på andelen af ​​epitelial tykkelse påvirket af neoplasi. Lifetime diagnose med en 10-lags epitel model blev også udført, og den resulterende diagnostisk nøjagtighed blev forbedret. Denne model blev undersøgt, fordi det bedst repræsenterer den biologiske struktur af cervikal epitel omfatter 10 cellulære lag med stigende modenhed mod dens overflade. Klassificeringen resultat vist i figur 5 identificerede den øverste halvdel epitel (lag 6-10) som den mest effektive region for livmoderhalskræft epitel diagnose. Det er blevet påvist i vores tidligere arbejde [25], som eosin er medvirkende fluorofor, som tilvejebringer den molekylære kontrast. Den forbedrede diagnostiske nøjagtighed med den øverste halvdel epitel kan muligvis tilskrives den fremtrædende samspil mellem cellulære modenhed og eosin molekyler. Normale celler vides at afvige markant fra CIN-celler i deres evne til at differentiere [41]. Normale cervikale celler kan differentiere til modne specialiserede celler som de vokser opad fra basalmembranen til epiteloverfladen [42]. CIN celler, på den anden side, forbliver umodne (udifferentierede) og formere vertikalt med øgede abnormiteter. Det er tydeligt i figur 4, som betyder τ

2 af normale celler stiger støt fra lag 1 til lag 10, hvor cellerne er fuldt modnet. Derimod CIN celler viser gradvis stigning i gennemsnitlige τ

2 i den nederste halvdel epitel og minimal ændring i top-halv lag. Den store forskel i gennemsnitlige τ

2 mellem normale og CIN celler, drevet af deres forskellige modenhed, udgør derfor den fremtrædende diagnostiske kontrast i øverste halvdel epitel.

afkortning af τ

2 er også observeret i “normale” upåvirkede lag af CIN1 og CIN2, som defineret ved konventionel grading system (se figur 3). For eksempel, mens CIN1 cellerne er i princippet begrænset til den nederste tredjedel epitellaget ifølge standard diagnose, afkortning af τ

2 (angivelse præcancer udvikling) stadig observeret i øverste halvdel epitel. Derfor afkortning af τ

2 ikke alene tilskrives tilstedeværelsen af ​​umodne CIN celler, men også andre mulige abnormaliteter begynder at udvikle sig i de øvre epiteliale lag.