PLoS ONE: Focal Adhesion kinase hæmmere i kombination med erlotinib Demonstrere Enhanced antitumoraktivitet i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Blokade af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) aktivitet har været en primær terapeutisk target for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Da patienter med vildtype-EGFR har vist kun beskedne udbytte af EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), er der behov for yderligere terapeutiske tilgange i patienter med vildtype-EGFR. Som et centralt element i downstream integrin signalering og kendt receptor krydstale med EGFR, vi hypotese, at målrette omdrejningspunkt vedhæftning kinase (FAK) aktivitet, som også er blevet vist sig at korrelere med aggressiv etape i NSCLC, ville føre til øget aktivitet af EGFR TKI’er . Som sådan EGFR TKI-resistente NSCLC-celler (A549, H1299, H1975) blev behandlet med EGFR TKI erlotinib og FAK-inhibitorer (PF-573,228 eller PF-562,271) såvel som enkelte midler og i kombination. Vi bestemt celle levedygtighed, apoptose og 3-dimensionelle vækst

in vitro

og vurderet tumorvækst

in vivo

. Behandling af EGFR TKI-resistente NSCLC celler med FAK-hæmmer alene effektivt hæmmede cellelevedygtighed i alle testede cellelinier; men dens anvendelse i kombination med EGFR TKI erlotinib var mere effektiv til at reducere cellelevedygtighed end enten alene behandling ved testning i både 2- og 3-dimensionelle assays

in vitro

, med forbedret ydelse set i A549-celler. Denne forøgede effekt kan være delvist skyldes den observerede inhibering af Akt phosphorylering, når lægemidlerne blev anvendt i kombination, hvor igen A549-celler demonstrerede mest inhibering efter behandling med lægemiddelkombinationen. Kombinere erlotinib med FAK-hæmmer var også potent

in vivo

som det fremgår af reduceret tumorvækst i A549 mus xenograft model. Vi yderligere konstateret, at den forøgede følsomhed var uanset LKB1 mutationsstatus. Sammenfattende udviser vi effektiviteten af ​​at kombinere erlotinib og FAK-inhibitorer til anvendelse i kendt EGFR vildtype, EGFR TKI resistente celler med potentiale at en delmængde af celletyper, som omfatter A549, kunne være særligt følsom over for denne kombinationsbehandling. Som sådan yderligere evaluering af denne kombinationsbehandling er berettiget, og kan vise sig at være en effektiv terapeutisk tilgang til patienter med iboende EGFR TKI-resistente NSCLC

Henvisning:. Howe GA, Xiao B, Zhao H, Al-Zahrani KN, Hasim MS, Villeneuve J, et al. (2016) Focal Vedhæftning kinase hæmmere i kombination med erlotinib Demonstrere Enhanced antitumoraktivitet i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 11 (3): e0150567. doi: 10,1371 /journal.pone.0150567

Redaktør: Jeremy J. W. Chen, Institut for Biomedicinsk Institut, TAIWAN

Modtaget: September 28, 2015; Accepteret: 14 februar 2016; Udgivet: 10 marts 2016

Copyright: © 2016 Howe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling til CLA fra Lung Cancer Research Foundation (https://www.lungcancerresearchfoundation.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling eller analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelsen af ​​dette manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

forkortelser: DMSO, dimethylsulfoxid; ECM, ekstracellulær matrix; EGFR, epidermal vækstfaktor receptor; FAK, fokal vedhæftning kinase; LKB1, liver kinase B1; NSCLC, ikke-småcellet lungekræft; PBS, phosphatpufret saltopløsning; PF-228, PF-573.228; PF-271, PF-562.271; TKI, tyrosinkinasehæmmer

Introduktion

Lungekræft tegner sig for flere dødsfald på verdensplan end nogen anden form for kræft [1] med ~ 80% af lungekræfttilfælde er klassificeret som ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [2]. Den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) protein er overudtrykt hos op til 80% af NSCLCs, dermed EGFR har været et primært terapeutisk mål for NSCLC [3,4]. Til dette formål har midler er designet til at målrette både det ekstracellulære domæne og intracellulære kinasedomæne af EGFR. Inhibitorer er målrettet kinasedomænet af EGFR, såsom erlotinib og gefitinib, har vist sig lovende i patienter med aktiverende mutationer (dvs. i exonerne 18, 19 eller 21) i EGFR [5-8], selvom disse inhibitorer har vist kun beskedne fordele for patienterne huser vild type EGFR [9,10]. Derudover kan sekundære mutationer i EGFR eller c-MET forstærkning udvikle, giver resistens i tidligere følsomme patienter [11]. Da hyppigheden af ​​EGFR-aktiverende mutationer er relativt lav i de fleste nordamerikanske og europæiske populationer [12-15], er der behov for at forbedre følsomheden over for EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) hvor patienter med vildtype-EGFR.

Focal adhæsion kinase (FAK) er en ikke-receptortyrosinkinase, der lokaliseres på steder med celleadhæsion til den ekstracellulære matrix (ECM) og medierer signaleringsbegivenheder nedstrøms for integrin indgreb af ECM. FAK er kendt for at regulere celleoverlevelse, proliferation og migration [16]. FAK udtryk har også vist sig at være opreguleret i mange cancertyper, herunder lungekræft [17], således at positionere FAK som et vigtigt mål for regulering i kræftbehandling. Til dette formål har FAK-hæmmere blevet udviklet, herunder farmakologiske hæmmere af FAK tyrosinkinaseaktivitet [18,19]. Inhibering af FAK har vist sig at påvirke en række cellulære processer vigtige for tumorvækst og sygdomsprogression herunder angiogenese og metastase [20-22]. Yderligere er FAK-inhibitorer vist sig effektivt at inhibere tumorvækst i en række subkutane xenograftmodeller [23,24] viser lovende som enkelte midler og i kombination med andre inhibitorer [24-26].

NSCLC, forøgede ekspressionsniveauer af FAK observeres i tumorvæv i sammenligning med normale lungevæv, og denne forøgede ekspression er korreleret med højere sygdomstilstande stadier [27]. Disse fund tyder på en vigtig rolle for FAK i progressionen af ​​NSCLC. Nylig dokumentation har også impliceret β1 integrin udtryk i modstand mod EGFR TKI gefitinib, med øget gefitinib følsomhed blive set efter β1 integrin udtømning i NSCLC celler [28]. Eftersom FAK er en af ​​de vigtigste kinaser aktiverede nedstrøms for β1 integrin, er betydningen af ​​ECM-fokal adhæsion kompleks signalering i resistens mod EGFR TKI behandling indiceret. Da det er en etableret praksis at behandle NSCLC patienter med EGFR TKI’er og der stigende tegn på, at FAK spiller en stor rolle i lunge kræft vækst og progression, vi satte os for at teste nytten af ​​at kombinere EGFR inhibitor erlotinib med FAK hæmning i NSCLC. Vi undersøgte virkningerne af to FAK-inhibitorer, PF-573.228 (PF-228) og PF-562.271 (PF-271) på NSCLC cellevækst i kultur og tumorvækst i mus xenograftmodeller som både enkelte midler og i kombination med erlotinib. Resultaterne af vores undersøgelse viser, at kombinere FAK hæmning med erlotinib mere effektivt reducerer EGFR vildtype NSCLC cellelevedygtighed

in vitro

xenograft tumorvækst

in vivo

end både medicinsk behandling alene med særlig virkningsfuldhed i A549 celletype. Således har vores resultater identificeret en lovende lægemiddel kombination strategi rettet mod EGFR og FAK i NSCLC, og viser, at et behandlingsregime med en FAK-hæmmer kan vise sig mere fordelagtig end behandling med erlotinib alene hos patienter huser iboende EGFR TKI-resistente NSCLC.

Metoder

Cellekultur og reagenser

humane cellelinjer A549 (EGFR vildtype) og H1299 (EGFR vildtype) blev erhvervet fra ATCC, mens H1975 (EGFR L858R og T790M mutationer), HCC827 (EGFR ΔE746-E750) og HCC4006 (EGFR ΔL747-E749) cellelinjer var en gave fra Dr. Ming Tsao (Prinsesse Margaret Hospital, Toronto, ON). A549-celler blev holdt i DMEM (Mediatech, Manassas, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Medicorp, Montreal, QC), mens H1299, H1975, HCC827 og HCC4006 celler blev opretholdt i RPMI-1640 (HyClone Laboratories, Logan , UT) med 10% FBS. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2. Den FAK-inhibitor PF-573.228 (PF-228) blev købt fra Tocris Bioscience (Bristol, UK) og opløst i DMSO. Erlotinib og FAK inhibitoren PF-562.271 (PF-271) blev købt fra Shanghai Biochempartner Co Ltd (Shanghai, Kina) og opløst i DMSO for

in vitro

cellekultur arbejde.

Generation af erlotinib resistente celler

HCC4006 celler, som oprindeligt var følsomme over for erlotinib, blev gjort resistente over for erlotinib gennem 5 runder af dosiseskalering startende med 0,005 pM erlotinib og stigende koncentration med en faktor 5, indtil celler er resistente over for 3 uM erlotinib blev isoleret. Parentale celler blev behandlet med ækvivalente mængder af DMSO til celler, der undergår selektion for resistens for varigheden af ​​dosiseskaleringen eksperiment, og disse blev anvendt som kontroller til alle efterfølgende eksperimenter.

Plasmid transfektion af LKB1 i A549-celler

A549 celler blev transficeret med pcDNA3-FLAG-LKB1 (plasmid 8590 [29], Addgene, Cambridge MA) at overudtrykke LKB1 eller med pcDNA3.1 som vektor kontrol ved hjælp GeneJuice transfektion reagens (Novagen, Etobicoke, ON). Transficerede celler blev udsået i flere vævskulturskåle, og efter 48 timer, aktivt delende celler blev behandlet med 500 ug /ml Geneticin (Invitrogen, Burlington, ON) for at lette udvælgelse af plasmid-udtrykkende celler. Celler i hver vævskulturskål bliver tilbage efter selektion blev samlet til at skabe en række puljede kloner af både LKB1 udtrykkende og ikke-udtrykkende A549-celler. Bekræftelse af LKB1 ekspression i FLAG-LKB1 transficerede celler og fortsatte manglende LKB1 ekspression i kontrolceller blev bekræftet ved Western blotting for LKB1.

siRNA transfektion

H1299-celler var enten mock transficeret (PBS) eller transficeret med siGENOME ikke-targeting kontrol siRNA # 2 eller siGENOME SMARTpool LKB1 siRNA (cat # M-005.035-02, Dharmacon, Lafayette, CO) med Oligofectamine reagens (Invitrogen, Burlington, ON). Effektivitet af LKB1 knockdown blev bekræftet gennem western blotting. For MTT-assays udnytte siRNA-transficerede celler, medicinsk behandling påbegyndt på 48 timer efter transfektion. For forsøg med stimulering af celler med EGF i western blotting, siRNA-transfekterede celler blev serum sultet natten start på før vækstfaktor stimulering 48 timer efter transfektion.

MTT celleviabilitetstest

Celler var podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 4.000 celler /brønd og inkuberet natten over. For dosiseskaleringsundersøgelser og drug kombinationseksperimenter blev celler behandlet med enten erlotinib eller PF-228 alene eller i kombination i forskellige koncentrationer af lægemiddel i DMEM eller RPMI-1640 suppleret med 5% FBS i 48 timer. Cellelevedygtighed blev derefter vurderet med MTT-reagens (thiazolylblåt tetrazoliumbromid, Sigma, Oakville, ON) som tidligere beskrevet [30] med absorbans bestemmes ved 570 nm med en Multiskan Ascent pladelæser (Thermo Scientific, Rockford, IL). Behandlinger blev udført i replikater af seks med middelværdierne udtrykt som den procentvise levedygtighed i forhold til DMSO behandlet kontrol (100% levedygtige). Arten af ​​virkningen af ​​erlotinib i kombination med FAK inhibitoren PF-228 blev bestemt ved Chou-Talalay-fremgangsmåden [31] ved brug CalcuSyn software (Biosoft, Cambridge, UK). Data for cellelevedygtighed som målt ved MTT for hvert lægemiddel alene og i kombination blev anvendt i CalcuSyn programmet til frembringelse fraktion-ramte CI (Fa-CI) plots indikerer kombinationen (CI) værdier for hver kombination lægemiddel. CI værdier 1 indikerer synergistiske interaktioner, Cl-værdier 1 angiver antagonistiske interaktioner og Cl-værdier = 1 indikerer additive interaktioner.

FAK immunfældning og in vitro kinaseassay

Immunopræcipitation og kinase-reaktioner blev udført som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt blev lige store mængder af total cellelysat (600 ug) immunudfældet for FAK med anti-FAK-antistof (BD Bioscience, Mississauga, ON) og 20 pi af protein A /G sepharose perler (GE Healthcare, Uppala, Sverige) under rotation for 2 timer ved 4 ° C. Perlerne blev derefter vasket 3 gange med 200 mM NETN (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 200 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630) efterfulgt af én vask i kinasebuffer (0,25 mM Navo

3, 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphat, 1 mM dithiothreitol, 15 mM MgCl

2). DMSO (vehikelkontrol) eller FAK-inhibitor PF-228 på 1 eller 5 uM koncentrationer blev derefter tilsat til reaktionen i 20 pi kinasepuffer og inkuberet i 20 minutter ved 30 ° C. Den kinaseassay blev derefter initieret med 1 pi [

32p] γATP (5 uCi /ul) og inkuberes i 30 minutter ved 30 ° C under blanding hvert 10. minut. Reaktionen blev afsluttet efter tilsætning af 4X SDS-prøvebuffer. Prøverne blev opløst på en 7,5% polyacrylamidgel og overført til PVDF-membran. Membranen blev underkastet autoradiografi for udvikling af FAK phosphoryleringsbegivenheder og probet for totale FAK-niveauer ved Western blotting som beskrevet nedenfor.

Flowcytometri

Celler blev behandlet med opløsningsmiddel kontrol (DMSO), erlotinib , PF-228, eller begge erlotinib og PF-228 i medium indeholdende 5% FBS i 48 timer. Både ikke-adhærente og adhærente celler blev opsamlet og samlet, vasket to gange med PBS og resuspenderet i 70% ethanol i permeabilisering. Cellesuspensioner blev derefter behandlet med propidiumiodid-opløsning (48 ug /ml propidiumiodid, 40 ug /ml RNase A) i 30 minutter ved stuetemperatur. I alt 1 x 10

4-celler blev evalueret under anvendelse af Beckman Coulter Epics XL flowcytometer (Beckman-Coulter, Mississauga, ON), og procentdelen af ​​apoptotiske celler blev beregnet ud fra celler med mindre end 2N DNA-indhold under anvendelse af FCS Express flow cytometri analyse software (De Novo software, Los Angeles, CA).

Western blot-analyse

Efter totalt protein ekstraktion blev western blotting udført som tidligere beskrevet [30]. Primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse var som følger: (. Cat # 9272) (. S473, Cat # 9271) kanin-anti-Akt, Pakt, LKB1 (Cat # D60C5.) Og PARP-antistoffer var fra Cell (Cat # 9542). Signaling Technology (Danvers, MA), muse-anti-FAK (klon 77 /FAK) var fra BD Transduction Laboratories (Mississauga, ON), og muse-anti-β-actin antistof (klon AC-74) var fra Sigma (St. Louis , MO). Efter inkubering med primært antistof natten over blev membranerne vasket 3 x 5 minutter og inkuberet i peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret gede anti-muse eller gede-anti-kanin sekundært antistof (Calbiochem, San Diego, CA) i 1 time. Membraner blev derefter vasket 6 x 5 minutter og inkuberet i Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (EMD Millipore, Billerica, MA) før billedet udvikling ved hjælp af GeneGnome Bio Imaging System og GeneSnap software (Syngene, Frederick, MD).

Colony vækstassay

Lab-Tek II 4-brønds kammerobjektglas (Nalge Nunc International, Naperville, IL) blev coatet med 100 pi reduceret vækstfaktor basalmembran ekstrakt (BME, Trevigen, Gaithersburg, MD), som størknede i 30 minutter ved 37 ° C. Celler blev derefter podet på den størknede BME lag ved en densitet på 5000 celler /brønd i medium indeholdende 10% FBS og 2,5% BME. Medium blev genopfrisket hver tredje dag. Celle koloni størrelser blev bestemt med ImageJ software fra i alt 4 billeder fra hver af dobbelte brønde for hvert forsøg.

In vivo tumorvækst

A549 lungecancerceller (1 x 10

6 celler) blev injiceret subkutant i både venstre og højre bagben flankerne af 6-uger gamle CD-1 nøgne mus (Charles River, Wilmington, MA). Mus blev huset i SPF betingelser, på en 12 timers lys /mørke-cyklus med ad libitum fodring og vand under hele eksperimentet. Tre dage efter injektionen, mus (4 mus /behandling) blev først behandlet ved oral sondeernæring med vehikelkontrol, eller med tidligere demonstreret effektive koncentrationer af erlotinib (50 ug /g) [33], PF-271 (50 ug /g) [ ,,,0],23], eller en kombination af begge lægemidler i PBS med 5% gelucire (køretøj kontrol). Lægemidler blev derefter indgivet ved oral sondeernæring dagligt i fem på hinanden følgende dage, efterfulgt af to dage uden behandling, og processen blev derefter gentaget under hele forsøget. Målinger af tumorstørrelse blev taget en gang om ugen ved caliper måling og tumorvolumen blev beregnet ud fra følgende formel: tumorvolumen = (bredde)

2 x (længde) /2. Alle eksperimenter dyr blev udført og godkendt af University of Ottawa Animal Care udvalg og var i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af

Dyr for forskning Act

og den canadiske Rådet om Animal Care s

Guide til pasning og anvendelse af forsøgsdyr

(Vol. 1, 2. udg., 1993), og opfylde standarder for praksis i disciplinerne forsøgsdyrsvidenskab og forsøgsdyr veterinærmedicin. Som pr godkendt protokol blev dyrene aflivet ved carbondioxid-kvælning efterfulgt af cervikal dislokation på forudbestemte eksperimentelle endepunkter, herunder a) tumormasse til det punkt, hvor den i betydelig grad forstyrrer normale kropsfunktioner eller forårsager smerte, b) Konsekvent eller hurtig organ vægttab over 20% af kropsvægten c) sårdannelse /infektion af tumorstedet (brud på hudpladen), e) Tumorbelastning . 10% af musens legemsvægt g) Svær respirationsbesvær eller h) ambulant angst eller anden grund

Ex vivo lunge tumor analyse

Kirurgisk operativt fjernede NSCLC tumorer og normal tilstødende lungevæv blev opsamlet efter patologisk vurdering fra fem patienter, der forudsat skriftligt informeret samtykke som pr protokol godkendt af Ottawa Hospital Research Ethics Board ( protokol # 20120559-01H). Patient karakteristika er beskrevet i tabel 1. Væv blev behandlet samme dag til brug i

ex vivo

eksperimenter. En biopsitang (Miltex GmbH, Rietheim-Weilheim, Tyskland) blev anvendt til at opnå 2 mm diameter kerner fra både lunge tumorvæv og normal lungevæv og yderligere opdelt i 1 mm tykke skiver med tre skiver derefter fordelt tilfældigt i tredobbelte brønde på en 24 brønds vævskulturplade. Vævssnit blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS og 100 U /ml antibiotikum /antimycotisk opløsning (Gibco, Waltham, MA) ved 37 ° C og 5% CO

2. Som hvert væv skive er ikke nødvendigvis identisk med hensyn til sin celledensitet eller levedygtighed på tidspunktet for isolation, dagen efter isolation blev levedygtighed vævssnit vurderes per brønd basis før lægemiddeltilsætning efter inkubation i 4 timer med en 10 % alamarBlue løsning (ABD Serotec, Raleigh, NC). Indlæg narkotikabehandling aflæsninger blev derefter normaliseret til disse baseline aflæsninger af levedygtigheden for hver brønd. Vævssnit blev behandlet dagen efter isolering med enten vehikel kontrol (DMSO), erlotinib (10 uM) blev PF-271 (5 uM), eller kombinationen af ​​begge lægemidler i 48 timer og cellelevedygtighed vurderes derefter med 10% alamarBlue opløsning . Fluorescens blev målt (excitation 530 nm /emission 590 nm) med en Fluoroskan Ascent fluorescenspladelæser (Thermo Scientific, Rockford, IL) 4 timer efter tilsætning af alamarBlue.

statistiske analyser

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af Prism 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA). Multiple sammenligninger blev udført af ANOVA mens enkelte sammenligninger blev udført ved uparret Student s

t

tests. Statistisk signifikante forskelle blev bestemt som

P

0.05 fra mindst to uafhængigt udførte eksperimenter.

Resultater

Hæmning af FAK reducerer cellernes levedygtighed i EGFR TKI-resistente NSCLC celler

For at vurdere effektiviteten af ​​behandling EGFR TKI-resistente NSCLC cellelinier med FAK TKI’er, vi udnyttet to EGFR vildtype cellelinier (A549, H1299) med kendt følsomhed over for EGFR TKI’er [34], samt EGFR mutant cellelinie H1975, med erhvervet EGFR TKI-resistens på grund af en T790M mutation i EGFR-genet [35]. Disse tre cellelinier således forsynet os med rimelige eksempler til at teste effektiviteten af ​​tilsætning af en FAK-tyrosinkinaseinhibitoren for erlotinib behandling for mere kraftigt inhiberer væksten af ​​EGFR TKI-resistente NSCLC celler.

Vi først testet FAK inhibitoren PF-228 [36] og vurderet dets evne til dosisafhængigt (fra 0,001 til 25pM) inhibere væksten af ​​NSCLC cellelinier

in vitro

. Behandling af celler med stigende doser af PF-228 viste, at alle tre EGFR TKI-resistente cellelinier (A549, H1299, H1975) var følsom over for dette lægemiddel ved koncentrationer på mere end 1 um (fig 1A). IC50-værdierne for PF-228 bestemmes ud fra grafen, var: 5,6 uM (R

2 = 0,92) i A549, 6,6 pM (R

2 = 0,95) i H1299 og 10,4 uM (R

2 = 0,80 ) i H1975. Interessant, levedygtighed to EGFR TKI-følsomme cellelinier (HCC827, HCC4006) [34] var meget højere (~ 75% af cellerne resterende levedygtige sammenlignet med kontrol-behandlede) end de EGFR TKI-resistente cellelinier (~ 10% af cellerne tilbage levedygtige sammenlignet med kontrol behandlet) ved den højeste dosis af PF-228 testet (25 pM) (fig 1A), selv om årsagen til denne forskel i rentabilitet endnu ikke er forstået. Da de to cellelinjer, som havde indbygget modstand mod erlotinib og var begge EGFR vildtype syntes at være mere følsomme over for FAK inhibitor end H1975 celler, som var EGFR mutationer resulterer i erhvervet følsomhed, vi undersøgt, om celler indledningsvist følsomme overfor erlotinib blev også mere følsomme over for FAK ved at få erhvervet lægemiddelresistens. HCC4006 celler, som skulle være blevet resistente over for erlotinib efter seriepassage i stigende koncentrationer af erlotinib op til 3 uM, resulterede i cellekloner med betydeligt mindre følsomhed over for erlotinib med IC50’er på 1,3 uM (R

2 = 0,87) og 16,8 uM (R

2 = 0,73) for resistente kloner 1 og 2 i sammenligning med kontrolceller, der blev serielt passeret i lige store volumener af DMSO kontrol med en IC50 på 0,21 uM (R

2 = 0,91) (fig 1B). Det skal bemærkes, at begge disse kloner udviste erlotinib modstand ved tilsvarende eller højere niveauer til de resistente forældrelinjer valgte (med IC50’er spænder over 1.2μM, 5.3μM og 5.9μM for A549, H1299 og H1975 henholdsvis). Erlotinib resistente HCC4006 celler viste øget følsomhed for FAK-inhibitorer med IC50’er på 8,0 uM (R

2 = 0,96) og 8,7 pM (R

2 = 0,95) for kloner 1 og 2 sammenlignet med kontrol HCC4006 klon med en IC50 på 12,3 uM (R

2 = 0,90) (fig 1C). Mens erlotinib resistente cellekloner viste, forøget følsomhed over for FAK-inhibitorer, forblev mindre følsomme over for PF-228 sammenlignet med EGFR vildtype iboende erlotinib resistente A549 eller H1299 celler. Det er derfor usandsynligt, at den vigtigste mekanisme for erhvervet resistens over for erlotinib i EGFR mutant NSCLC afhænger væsentligt FAK aktivitet.

(A) Cellelevedygtighed blev vurderet efter behandling med PF-228 med varierende doser i 48 timer i komplet medier med 5% FBS. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assay med levedygtigheden af ​​DMSO-behandlede celler sat til 100%. Dataene angiver middelværdien ± SEM for log [inhibitor] vs. normaliseret respons fra to uafhængigt udførte eksperimenter. (B) HCC4006 celler serielt dyrket i stigende koncentrationer af erlotinib op til 3 uM blev bekræftet resistente sammenlignet med parentale celler efter MTT-analyse af celler behandlet med stigende koncentrationer af erlotinib. Data afbildes som middelværdien af ​​log [inhibitor] vs normaliserede respons ± SEM (N = 2). (C) Erlotinib resistente HCC4006 celler er mere følsomme over for FAK inhibitor PF-228 end parentale HCC4006 celler. Cellerne blev behandlet med stigende koncentrationer af PF-228 og cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-assayet. Dataene er angivet som middelværdien af ​​log [inhibitor] vs normaliserede respons ± SEM (N = 2). (D) Relativ proteinekspression mellem erlotinib resistente (A549, H1299, H1975) og følsom (HCC827, HCC4006) parentale cellelinjer. (E) A549-cellelysater blev immunpræcipiteret for endogen FAK og underkastet

in vitro Salg kinaseassays i nærværelse af enten DMSO (vehikelkontrol) eller PF-228 (1 uM eller 5 uM). Autoradiografi afslørede FAK fosforylering (FAK AUTORAD) og western blotting angivne totale niveauer af FAK (IB: FAK).

Vi vurderede også, om følsomheden over for FAK hæmmere observeret i de parentale NSCLC cellelinjer blev forbundet med basal ekspression af eventuelle større proteiner i disse drug target pathways. Følsomheden over for FAK lægemiddel ikke syntes at korrelere med generelle niveauer for FAK, EGFR eller p1 integrin proteiner, da disse niveauer optrådte variabel i både følsomme og ufølsomme cellelinjer (Fig 1D). Eftersom de tre EGFR TKI-resistente NSCLC cellelinier havde IC50-værdier for PF-228 i området fra 5 til 10 um, og at vores laboratorium tidligere havde observeret hæmning af både autophosphorylering og kinaseaktiviteten af ​​FAK ved 5 uM PF-228 [20] bekræftede vi aktiviteten af ​​denne inhibitor i A549-celler efter

in vitro Salg kinase assays for FAK autophosphorylering. Tilsætningen af ​​PF-228 til kinasereaktionen inhiberede FAK autophosphorylering i A549-celler (Fig 1E) med lignende resultater observeres i H1299 og H1975 cellelinier signifikant (data ikke vist). Således blev udført efterfølgende eksperimenter under anvendelse koncentrationer af PF-228 i området 1-10 uM.

FAK inhibitor PF-228 virker synergistisk med erlotinib til mere effektivt at reducere cellernes levedygtighed i EGFR vildtype NSCLC-celler

Som behandling med FAK TKI alene syntes at inhibere levedygtighed af de testede i figur 1 EGFR TKI-resistente NSCLC celler, vi næste ønskede at bestemme, om tilsætning af PF-228 kunne sensibilisere celler til erlotinib, eller i det mindste , resultere i en additiv reduktion i cellelevedygtighed ud over den for behandling med erlotinib alene. Celler blev således behandlet med erlotinib (1-25 uM) eller PF-228 (1-10 uM) alene og i kombination, og cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-aktivitet. Alle tre cellelinjer testet udstillet resistens mod erlotinib behandling alene, selv ved meget høje koncentrationer (dvs. 25 uM, Fig 2A) bekræfter resultaterne af tidligere undersøgelser vedrørende EGFR TKI modstand i både EGFR vildtype og T790M mutation-holdige cellelinjer [34, 35,37-39]. Når erlotinib og PF-228 blev anvendt i kombination observerede vi en øget cytotoksisk virkning i A549, H1299 og H1975-celler, som vi havde hypotese (Fig 2A). Chou-Talalay fremgangsmåde blev anvendt til at bestemme arten af ​​lægemiddelkombination virkning [31]. Kombinationen index (CI) blev bestemt ved at plotte den påvirkede fraktion hvor Cl-værdier mindre end 1 anses synergistiske, CI-værdier større end 1, betragtes antagonistisk, og Cl-værdier lig med 1 betragtes additiv. Kombinationen af ​​erlotinib og PF-228 resulterer i reduceret cellelevedygtighed blev fundet at være synergistisk i alle tre testede cellelinjer (Fig 2B). Som et sekundært system, vi beskæftigede anvendelse af menneskelige lungekræft patient tumoreksplantater til yderligere teste effektiviteten af ​​FAK TKI’er i lunge kræftceller. Tumor eksplanteret fra uselekterede patienter, der gennemgår torakotomi for tidlige fase lungekræft blev behandlet

in vitro

med erlotinib eller FAK TKI’er alene eller i kombination. Behandlingen af ​​eksplanteret lungetumor med erlotinib alene viste en beskeden, men ikke statistisk signifikant fald i cellelevedygtighed (figur 2C, venstre panel). Der blev også observeret lignende beskedne reduktioner af cellelevedygtighed i tilstødende normale lungevæv efter erlotinib behandling alene (Fig 2C, højre panel). Vi observerede, at patientens lungekræft var også følsomme over for FAK TKI hæmning med en tendens til mere effektiv hæmning, når de anvendes i kombination med erlotinib (Fig 2C). På trods af den lille prøvestørrelse og variabilitet i forbindelse med test i heterogene væv (dvs. forskellige forhold mellem tumor til stroma kan forekomme i hver patientprøve), blev vi opmuntret af den indlysende fordel af lægemidlet kombination løbet erlotinib behandling alene, svarer til, hvad vi observerede i vores cellelinie eksperimenter. Af yderligere betydning, tilstødende normale lungevæv syntes at være upåvirket af FAK TKI behandlinger alene eller i kombination med erlotinib (Fig 2C), hvilket tyder på en potentiel selektiv hæmning af NSCLC tumorer.

(A) Celler blev behandlet med PF -228 og erlotinib i 48 timer og analyseret for celleviabilitet hjælp MTT-assayet. Dataene angiver middelværdien ± SEM for cellelevedygtighed præsenteret som en procentdel af kontrol DMSO-behandlede celler (100% levedygtige) fra to uafhængigt udførte eksperimenter. (B) Fraktion påvirket /Kombination index (CI) grunde angiver synergistiske cytotoksicitet af erlotinib og PF-228. Initiativerne 1 betragtes synergistisk, CIs 1 betragtes antagonistisk, og cis = 1 betragtes additiv. (C) FAK hæmning reducerer cellernes levedygtighed i human lunge tumor væv, men ikke normal lungevæv

ex vivo

. Væv fra fem uselekterede patienter blev behandlet i 48 timer med vehikelkontrol (DMSO), erlotinib (10 uM), PF-271 (5 uM), eller kombinationen af ​​erlotinib og PF-271. Cellelevedygtighed blev vurderet for både tumorvæv og normalt væv ved alamarBlue fra tre brønde pr tilstand med hver brønd indeholdende tre 2 mm x 1 mm vævsstykker. Fluorescens blev normaliseret til basisliniefluorescensen aflæsninger for hver brønd taget før lægemiddelbehandling. Forsøg blev udført uafhængigt på hver patientprøve Middel fluorescens er angivet for hver tilstand som en vandret linje og statistisk signifikante forskelle blev bestemt ved ANOVA og angivet som

P

værdier over sammenligningen.

for at bestemme, om den observerede nedgang i cellelevedygtighed korreleret med et øget niveau af apoptose i behandlede celler, analyserede vi SubG1 population af celler efter behandling med enten erlotinib eller PF-228 alene eller i kombination under anvendelse af propidiumiodid-farvning af DNA-indhold og flowcytometri-analyse. I A549-celler, kombinationen behandling af erlotinib og PF-228 (5 uM behandling) resulterede i en statistisk signifikant stigning i SubG1 population af celler sammenlignet med kontrol (~ 6 gange stigning), ud over at udvise en signifikant stigning i procentdel af SubG1 celler i forhold til både erlotinib behandling alene (

P

0,001) og PF-228 behandling alene (

P

0,001) (figur 3A).