PLoS ONE: metabolomiske karakterisering af human prostatacancer knoglemetastaser afslører øget kolesterol

Abstrakt

Baggrund

Metastase til benet er en klinisk vigtige elementer i prostatakræft (PCA). Nuværende diagnostiske metoder kan ikke forudsige metastatisk PCa på en hærdelig fase af sygdommen. Identifikation af metaboliske veje involveret i væksten af ​​knoglemetastaser har derfor potentiale til at forbedre PCa prognosticering samt terapi.

Metode /vigtigste resultater

Metabolomics blev anvendt til studiet af PCA knoglemetastaser (n = 20) i sammenligning med tilsvarende normale knogle (n = 14), og endvidere af maligne (n = 13) og godartet (n = 17) prostatavæv og tilsvarende plasmaprøver opnået fra patienter med (n = 15) og uden (n = 13) diagnosticeret metastaser og fra mænd med benign prostata sygdom (n = 30). Dette blev gjort ved anvendelse af gaskromatografi-massespektrometri for prøve karakterisering og kemometriske bioinformatik til dataanalyse. Resultaterne blev bekræftet i en særskilt test sæt med metastatisk og normal knoglevæv fra patienter med andre kræftformer (n = 7). Signifikante forskelle blev fundet mellem PCA knoglemetastaser, knoglemetastaser af andre kræftformer, og normale knogler. Desuden identificerede vi metabolitter i primær tumor væv og i plasma, som væsentligt var forbundet med metastatisk sygdom. Blandt metabolitterne i PCA knoglemetastaser især kolesterol blev noteret. I en test indstille det gennemsnitlige cholesterolniveauet i PCA knoglemetastaser var 127,30 mg /g sammenlignet med 81,06 og 35,85 mg /g i knoglemetastaser af forskellig oprindelse og normal knogle, henholdsvis (P = 0,0002 og 0,001). Immunhistokemisk farvning af PCA knoglemetastaser viste intens farvning af lav densitet lipoprotein receptor og variable niveauer af scavenger receptor klasse B type 1 og 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-reduktase i tumor epitelceller, indikerer muligheder for indstrømning og

de novo

syntese af kolesterol.

konklusioner /betydning

Vi har identificeret metabolitter forbundet med PCa metastaser og specifikt identificerede høje niveauer af kolesterol i PCA knoglemetastaser. Baseret på vores resultater og den tidligere litteratur, dette gør kolesterol en mulig terapeutisk mål for avancerede PCa

Henvisning:. Thysell E, Surowiec I, Hornberg E, Crnalic S, Widmark A, Johansson AI, et al. (2010) metabolomiske Karakterisering af human prostatacancer knoglemetastaser afslører øget kolesterol. PLoS ONE 5 (12): e14175. doi: 10,1371 /journal.pone.0014175

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 14, 2010; Accepteret: November 4, 2010; Udgivet: December 3, 2010

Copyright: © 2010 Thysell et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte : den svenske Cancer Society, det svenske Forskningsråd, Lions Cancer Research Foundation, KEMPE fundament, Knut og Alice Wallenberg fundament, og Nordsverige Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aggressiv prostatakræft (PCA), til sidst spreder til benet, er en almindelig og dødelig sygdom, der kræver tidlig diagnose og effektiv behandling. Nuværende diagnostiske metoder; måle niveauer af prostataspecifikt antigen (PSA) i blodprøver og undersøge nålebiopsier fra prostata under lysmikroskopi, er imidlertid ikke særligt effektive til adskillelse af tilfælde af aggressiv PCa fra de endnu mere udbredt og indolente former for PCa der ofte kan stå uden behandling, eller til adskillelse af kræft fra andre ikke-maligne prostata lidelser [1], [2]. Ved hjælp af en række teknikker flere efterforskere har derfor forsøgt at finde nye diagnostiske metoder og prognostiske markører, der kan adskille aggressive fra mere indolente former for PCa (anmeldt i [3]).

stor indsats har været lagt i anerkendelsen af genetiske og proteom profiler til PCA (gennemgået i [4]), og magnetisk resonans spektroskopi er blevet anvendt til at udnytte metaboliske ændringer forbundet med PCa [5], [6], [7]. Zakian og colleauges giver en god gennemgang om emnet [8]. I en nylig papir, men Sreekumar og kolleger brugte væske og gaskromatografi – tid søgning massespektrometri (GC /TOFMS) at profilere metabolomet i væv, urin og plasma fra PCA patienter og identificerede ændringer forbundet med sygdomsprogression [9] . Konkret de identificerede sarcosin,

N

methyl derivat af glycin, som en potentielt vigtig markør for PCa celle invasion, migration, og aggressivitet. Den Sreekumar studiet sammen med andre nylige undersøgelser [10], [11], [12], [13] virkelig viser, at massespektrometri metoder kunne bruges til at karakterisere metabolomiske ændringer under kræft progression og yderligere at identificere mulige diagnostiske og prognostiske biomarkører eller biomarkør mønstre samt øge vores viden om sygdomsprogression.

Denne undersøgelse blev foretaget med den hypotese, at potentielle nye markører for aggressiv PCa kunne blive opdaget ved at finde faktorer markant opreguleret i knoglemetastaser og derefter undersøge, om den samme faktorer er også steget i blodprøver og i primære tumorer fra patienter med metastatisk sygdom. Vi udførte derfor et metabolomiske undersøgelse af PCA knoglemetastaser i sammenligning med tilsvarende normale knogle, primær PCa tumor og normal prostata væv, ved anvendelse af metastatisk væv opsamlet ved kirurgi for komplikationer af knoglemetastaser [14]. Desuden analyserede vi blodprøver fra patienter med og uden diagnosticerede knoglemetastaser, med det formål at identificere metabolitter, der kunne bruges til at forbedre prognosticering og behandling af fremskreden PSA. Resultaterne blev bekræftet i en separat prøveopstilling herunder også metastatisk knoglevæv fra andre kræftformer. Dette blev gjort ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri for prøve karakterisering og kemometriske bioinformatik til analyse og evaluering [15] data.

Resultater

Prostatakræft knoglemetastaser viser klare metaboliske forskelle i forhold til normal knogle og til knoglemetastaser fra andre cancere, herunder forhøjede niveauer af cholesterol

Gaskromatografi-time of flight-massespektrometri (GC /TOFMS) blev anvendt til at karakterisere PCA knoglemetastaser fra 14 patienter (7 hormon-naive PCA patienter og 7 patienter med CRPC) og tilstødende normalt optræder knoglestykker, der var tilgængelige fra 10 af patienterne (tabel 1). I alt blev 123 kromatografiske toppe svarende til formodede metabolitter findes ved udfoldning [16] efter udelukkelse af toppe, der stammer fra interne standarder, forurening og artefakter. Af de 123 formodede metabolitter, kunne 49 tildeles en identitet ved deres massespektre og tilsvarende retention index (figur 1). Retvinklede partielle mindste kvadrater diskriminere analyse (OPLS-DA) afslørede en tydelig og statistisk signifikant adskillelse (

P

0,001) mellem de normale knogle og knoglemetastaser prøver, uafhængigt af behandling, bestemt ved ANOVA af grænseoverskridende valideret model (figur 2b). Væsentlige forskelle mellem prøven grupper (VIP 0,9, Variabel betydning i OPLS-DA model eller

P

0,05, Mann Whitney U-test) blev fundet for 58,5% (71 af 123) af de formodede metabolitter (figur 2a, tabel S1). Af de 71 væsentligt diskriminerende metabolitter, kunne 34 tildeles en identitet ved deres massespektre og tilsvarende fastholdelse indeks, mens 37 kun blev tildelt en mulig forbindelse, klasse eller forblevet uidentificerede. For at validere den detekterede metabolomiske signatur i knogle metastatisk væv og til at undersøge, om en unik metabolit mønster til PCA eksisterer, blev en række af ekstra prøver profileret i en separat aktion. Denne “testsæt” inkluderet knoglemetastaser prøver fra prostata (6), bryst (3), nyre (2) og planocellulært (2) adenocarcinomer såvel som normale knogle prøver fra tilsvarende patienter fremstillet, profileret og forudsagt som en separat validering kohorte (tabel 1). Forudsigelse af PCA knoglemetastaser og tilsvarende normale knogle prøver (blinde til modellen) ind i OPLS-DA-modellen viste en klar forskelsbehandling mellem prøven klasser i testen sæt (Figur 2c). Derudover en separat OPLS-DA-model gav en signifikant forskel (

P

0,001) mellem PCA knoglemetastaser og tilsvarende normale knogle prøver i testsættet og metabolitterne væsentligt adskiller disse prøve grupper (tabel S2 ) overlappede med stor udstrækning med de signifikante metabolitter fundet i modellen (tabel S1). Desuden OPLS-DA udsat en tydelig og signifikant (P 0,005) adskillelse mellem PCA knoglemetastaser og metastaser fra andre kræftformer (Figur S1)

Identificerede metabolitter er kategoriseret efter kemisk klasse og nummeret. af metabolitter pr klasse signifikant associeret med metastase er indiceret (

P

0,05, Mann Whitney U-test, eller VIP 0,9). Klassifikation af metabolitter i henhold til kemisk klasse (human metabolomet DB, www.hmdb.ca). n = antallet af identificerede metabolitter inden for hver metabolit klasse

A) Sammenhæng belastninger (p [1]) fra OPLS-DA analyse af de betydeligt differentierende metabolitter (

P

0,05, Mann Whitney U-test, eller VIP 0,9) mellem prostatakræft knoglemetastaser og normal knogle, der viser positive værdier for metabolitter med øgede niveauer i knoglemetastaser og negative værdier for metabolitter med nedsatte niveauer i knoglemetastaser. Klassificering af ikke-identificerede forbindelser med kemisk klasse (human metabolomet DB; www.hmdb.ca) B) OPLS-DA score plot viser statistisk signifikant adskillelse (

P

0,001) mellem normal knogle og prostatakræft knoglemetastaser. C) Test sæt forudsigelser af prostatakræft knoglemetastaser og tilsvarende normale knogle prøver (blinde til modellen) ind i OPLS-DA-model viser en klar forskelsbehandling mellem prøven klasser baseret på den detekterede metabolomiske signatur.

Blandt de påviste metabolitter i PCA knoglemetastaser (figur 2a og tabel S1) vi fundet forhøjede niveauer af flere aminosyrer i sammenligning med normal knogle, hvilket indikerer høj aminosyre metabolisme. Derfor blev de øverste 12 kanoniske veje i PCA knoglemetastaser foreslået af systemer pathway-analyse (Ingenuity Systems, Inc.) alle relateret til aminosyre-syntese og metabolisme (tabel S3). Aminosyre metabolisme var også den øverste funktion opført af Opfindsomhed pathway analyse for PCa knoglemetastaser (Tabel S4). Endvidere har vi påvist høje niveauer af cholesterol, myo-inositol-1-phosphat, citronsyre, fumarat, glycerol-3-phosphat og fedtsyrer (Tabel S1), som er relateret til molekylære og cellulære funktioner inden PCA knoglemetastaser som angivet i tabel S4.

Vi specifikt noteret de høje niveauer af kolesterol i PCA knoglemetastaser kolesterol viste den højeste VIP værdi, når differentiere PCA knoglemetastaser fra normal knoglevæv (tabel S1, figur 2a) samt fra andre knoglemetastaser (tabel S5). Desuden har cholesterol været foreslået at fremme udviklingen af ​​kræft og progression (gennemgået i [17]), og blev derfor valgt til yderligere analyse. Den højt kolesteroltal i PCA knoglemetastaser i forhold til normal knogle (

P

= 3.12E-5, figur 3a) blev klart bekræftet i test sæt data (

P

= 0,001, figur 3b). Interessant, kolesterol i PCA knoglemetastaser var også høj i sammenligning med niveauet i knoglemetastaser fra andre kræftformer (P = 0,0002, Figur 3b).

A. Box plot for kolesterol koncentration (mg kolesterol /g væv), der viser signifikant højere niveauer i prostatakræft (PCA) knoglemetastaser forhold til normal knogle. B. Box plot for kolesterol koncentration (mg kolesterol /g væv) i test sæt viser signifikant højere niveauer i PCA knoglemetastaser forhold til normal knogle samt i forhold til knoglemetastaser fra andre kræftformer; bryst, nyre og skællede cancer (BCA, KCA og CSA). C-E. Immunhistokemisk farvning af lav densitet lipoprotein receptor (LDL-R), scavenger receptor klasse B type 1 (SR-B1), og 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A-reduktase (HMG-CoA red.) I PCa knogle metastaser viser intens farvning og angiver mulighederne for tilstrømning samt

de novo

syntese af kolesterol i tumor epitelceller, som foreslået i FF kolesterol tilstrømning og syntese stimuleres af androgen receptor (AR) handling dels via aktivering af sterol regulatorisk element-bindende protein (SREBP) og efterfølgende transskription af LDL-R og HMG-CoA red [24], [25] og androgener kunne leveres fra kolesterol med sin konvertering i flere trin [27], [28].

Prostatakræft knoglemetastaser har maskiner til optagelse og

de novo

syntese af kolesterol

kolesterol udgør en potentiel terapeutisk mål og vi ønskede derfor at undersøge mulige årsager til de højt kolesterolniveau i PCA knoglemetastaser. Celler kan få kolesterol med exogent tilstrømning via low density lipoprotein receptor (LDL-R), scavenger receptor klasse B type 1 (SR-B1) eller ved

de novo

syntese ud fra acetyl-CoA, hvor reduktionen af 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A (HMG-CoA) til mevalonat anses for at være det hastighedsbegrænsende trin [18], [19]. Paraffinindlejrede stykker fra PCA metastaser indgår i GC /TOF-MS-analyse blev derfor immunfarvet for LDL-R, SR-B1 og HMG-CoA reduktase. Alle PCA tilfælde udviste stærk homogen LDL-R-farvning af metastatiske epitelceller og lejlighedsvis mindre intens farvning af hosliggende stromaceller, endotelceller, adipocytter og knogleceller (figur 3c, tabel 2). Epitel farvning af SR-B1 og HMG-CoA-reduktase var mere heterogen, lige fra svag til stærk (tabel 2). Interessant nok viste HMG-CoA-reduktase særlig intens farvning i endotelceller, karvægge, immunceller, og knogleceller (figur 3e), mens SR-B1 sig negativt stroma farvning (figur 3d). Vores resultater viser, at tumor epitelceller i PCa knoglemetastaser muligvis syntetisere kolesterol

de novo

via HMG-CoA reduktase, men også at andre celletyper i knoglemetastaser mikro-miljø udtrykker dette enzym muligvis giver dem mulighed for at give kolesterol der kunne tages op af tumor epitelceller gennem LDL og SRB-1-receptorer (figur 3f). Der var ingen indlysende forhold mellem heterogenitet i SR-B1 og HMG-CoA immunfarvning og de tilsvarende kolesterol i PCA knoglemetastaser (data ikke vist). Interessant, men viste PCA knoglemetastaser generelt stærkere immunfarvning af LDL-R og SR-B1 end knoglemetastaser af forskellig oprindelse (tabel 2), eventuelt bidrager til de relativt højere kolesterol niveau i PCA metastaser (fig. 3) .

Metaboliske forskelle mellem primær prostata tumorvæv fra højrisikopatienter med og uden etablerede knoglemetastaser

primær PCa væv opnået fra patienter med høj-risiko tumorer (defineret som lokalt avanceret eller dårligt differentieret kræft, trin T3-4 og /eller GS 8-10) med (M1, n = 7) eller uden (M0, n = 6) diagnosticerede knoglemetastaser blev profileret i sammenligning med benign prostata prøver (n = 17, tabel 3). Dette resulterede i 157 formodede metabolit toppe, hvoraf 59 kunne tildeles en identitet (Figur 1). Klar og statistisk signifikant forskelsbehandling (P 0,001), bestemt ved ANOVA af cross-valideret model, mellem alle tre prostata væv klasser (godartet, M0, og M1) blev afsløret af OPLS-DA modellering (Figur S2). blev påvist i 13 metabolitter, hvoraf otte blev identificeret (tabel S6 og S7) Væsentlige ændringer i forbindelse med metastatisk sygdom, defineret som metabolit ændringer i M1 vs godartet og M1 vs. M0 (0,9 P 0,05 eller VIP asparagin, threonin, fumarsyre og linolsyre (tabel S1).

Kollienes metabolit profiler i blodplasma fra patienter med høj risiko tumorer med og uden etablerede knoglemetastaser

Undersøgelse af plasma metabolomet fra PCA patienter med (M1, n = 15) og uden (M0, n = 13) diagnosticeret knoglemetastaser og mænd med godartet sygdom var baseret på 179 løses formodede metabolitter, og af dem 50 kunne tildeles en identitet (figur 1). Trods den klare overlap i serum PSA niveauer (tabel 3), en signifikant separation (P 0,003) under anvendelse OPLS-DA modellering blev opnået for forskellen mellem M1 og godartet plasma samt mellem M1 og M0 plasma, bestemt ved ANOVA af krydse validerede modeller. Tyve-syv metabolitter, syv identificeret, blev fundet som ændret signifikant (P 0,05 eller VIP 0,9) i blodplasma fra M1 patienter sammenlignet med patienter med benign (tabel S8) og M0 sygdom (tabel S9). Interessant nok af disse 27, fire metabolitter; glutaminsyre, taurin, og phenylalanin (forhøjet i blodet) og stearinsyre (nedsat i blod) blev også fundet som metastase markører i knogle (tabel S1). En oversigt over alle identificerede metabolitter i de forskellige prøvetyper er angivet i tabel S10 og data findes i en understøttende datafil (Data S1).

sarcosin niveauer i vævs- og plasmaprøver

sarcosin niveauer blev målt separat i prøver under anvendelse AccQ • Tag derivatisering efterfulgt af LC /MS-analyse. Analysen viste en stigning på sarcosin i PCA knoglemetastaser sammenlignet med normale knogle, mens ikke blev observeret nogen forskel i forhold til knoglemetastaser fra andre cancere (Figur S3). Desuden blev ingen klar sygdomsudvikling ses ved sammenligning af sarcosin niveauer mellem godartet prostata og primær prostata tumorvæv, selvom det lave antal (n = 5) af primære tumorekstrakter rådighed for denne analyse gjorde indflydelse på pålideligheden af ​​resultaterne, og også foretaget en sammenligning mellem primær tumor og knoglemetastaser væv upålidelige. Sammenligninger af sarcosin i blodet plasma afslørede ingen signifikante forskelle i relation til PCa eller tilstedeværelsen af ​​knoglemetastaser (data ikke vist).

Diskussion

Vi her, for første gang, rapport en omfattende analyse af metaboliske mønstre i PCA knoglemetastaser i forhold til primær PCa, godartet prostata væv, og normal knoglevæv. Vi har fundet metabolitter, som differentierer PCA knoglemetastaser fra normale knogle prøver og endvidere fra knoglemetastaser af anden oprindelse. Vi fandt også metabolitter, som i modsætning til PSA, viste ændrede plasma og primær tumor niveauer i individer med metastatisk PCa sammenlignet med patienter med høj risiko tumorer, men uden påviselige metastaser. En af vores mest bemærkelsesværdige fund er høje niveauer af kolesterol i PCA knoglemetastaser, som sandsynligvis nås med

de novo

syntese af kolesterol i tumor epitelceller samt tilstrømning af denne metabolit fra omgivelserne via LDL- R og SR-B1.

øget biotilgængelighed af cholesterol i tumorceller kan have høj biologisk relevans for knoglemetastaser vækst, som cholesterol tilskud har vist sig at øge PCa tumorcelleproliferation, migration og invasion

i vitro

[20], mens kolesterol målretning inducerer apoptose [21], formentlig ved at sænke lipidklump kolesterolindhold og derved interfererer med vækstfaktor signalering [21], [22]. Prostata indeholder normalt høje niveauer af kolesterol i forhold til andre organer og forhøjede kolesterolværdier har tidligere været forbundet med PCa [23]. Yderligere forhøjelse af kolesterol i knoglemetastaser kunne naturligvis afspejler stor efterspørgsel efter membran biosyntese i prolifererende celler, men også det faktum, at kolesterol stofskifte er direkte reguleret af androgener (revideret i [24]). Androgener positivt regulere LDL-R-gen transkription og også fremme cholesterolsyntese ved at øge transkription af HMG-CoA-reduktase [25], og dermed det hastighedsbegrænsende omdannelsen af ​​HMG-CoA til mevalonat [26]. Som androgen receptorer udtrykkes og presumingly aktiv i størstedelen af ​​knoglemetastaser i CRPC [14], androgen handlinger sandsynligvis bidrage til de højere kolesterol i PCA metastaser i sammenligning med knoglemetastaser af anden oprindelse. Kolesterol gengæld muligvis bidrager til androgen receptor signalering og dermed kastrationsresistent tumorvækst hos patienter behandlet med androgen-deprivationsbehandling ved sin omdannelse til androgener ved metaboliske enzymer [27], [28]. Følgelig har en vestlig kost og høje serum niveauer af cholesterol blevet forbundet med øget PCa risiko i en række undersøgelser [29], [30], [31], selv om resultaterne ikke været helt klare resultater (gennemgået i [17]) . Interessant, en nylig undersøgelse viser en lavere risiko for at udvikle høj kvalitet PCa for mænd med lavt serum kolesterol niveauer [32], og i tråd med dette, lang tids brug af HMG-CoA reduktasehæmmere ( “statiner”) til forebyggelse af kardiovaskulær sygdom har vist sig at reducere risikoen for PCa progression i aggressiv, dødelig sygdom [33], [34], [35], [36]. Kolesterol-sænkende stoffer har også vist sig at hæmme væksten af ​​PCA celler

in vitro

i model eksperimentelle systemer

in vivo

[37], [38]. Tilsammen disse resultater viser muligheden for at anvende kolesterol inhibitorer som behandlings- eller kemoforebyggende midler til PCA metastase, men nye lægemidler derefter nødvendig som statinerne anvendes i dag primært koncentrere til leveren og dårligt nå perifere organer [17].

Vi fandt høje niveauer af mange aminosyrer inden PCA knoglemetastaser, og aminosyremetabolismen var den mest ændrede funktionelle pathway associeret med PCA knoglemetastaser ifølge Ingenuity pathway analyse. Vores resultater understøtter således den metabolomiske-baserede undersøgelse fra Sreekumar og medarbejdere [9] og også tidligere gen-ekspression-baserede undersøgelser, der viser øget proteinsyntese under PCa progression [39]. Interessant, er en nylig papir høj-tændte, at også niveauet af aminoacyl tRNA syntetaser (aaRSs) steg i PCa progression og desuden er der transskription af nogle aaRSs stimuleret af androgener [40]. Denne bemærkelsesværdige fund kunne muligvis være forbundet med den kendsgerning, at vi fandt forøgede niveauer af visse aminosyrer, såsom threonin, glutamat, phenylalanin inden PCA knoglemetastaser i sammenligning med knoglemetastaser af forskellig oprindelse. Foruden de aminosyrer, andre bemærkelsesværdige metabolitter i vore data (citronsyre, fumarat, glycerol-3-phosphat og fedtsyrer) indikerer høj energi metabolisme, der kunne afspejle den høje del af prolifererende celle i knoglemetastaser [14]. Desuden kunne de høje niveauer af myo-inositol-1-phosphat være et tegn på aktiv cellesignalering involverer inositol-baserede molekyler som sekundære budbringere, såsom inositolphosphater og phosphatidylinositol phosphater. Disse molekyler er involveret i aktiverende protein kinase C og Akt og dermed ved regulering processer, der anses som kendetegnende for kræft, dvs. celleproliferation, apoptose, differentiering, invasion og angiogenese [41]. Samlet ændringer i påvist i denne undersøgelse, som er forbundet med PCA knoglemetastaser metabolomet angivne forstyrrede molekylære og cellulære funktioner af klar betydning for kræft progression. Den relative betydning af disse funktioner er imidlertid vanskeligt at overdrage, da de dels afhænge af metabolit klasser påviselige i GC /TOF-MS-analyse og identiteter opnået inden for tiden tilgængelige biblioteker. Med GC /TOFMS metabolit profilering metode var vi ikke i stand til at opdage sarcosin i prøverne. Men ved hjælp af en målrettet analyse tilgang, fandt vi høje niveauer af sarcosin i knoglemetastaser i overensstemmelse med tidligere fund af forøgede niveauer af sarcosin med PCa progression [9]. Vigtigere selvom, vi ikke se nogen forskel i sarcosin niveauer mellem PCA knoglemetastaser og knoglemetastaser af forskellig oprindelse, hvilket indikerer, at sarcosin ikke PCa specifik, men i stedet er forbundet med fremskreden kræft og metastaser. En mere omfattende billede af specifikke biologiske netværk af betydning for PCa metastaser vækst vil blive opnået som analysemetoder udvikler og biblioteker til identifikation få mere komplet, men kunne også opnås ved at kombinere metabolomiske data med genomiske eller proteomiske data. Hidtil vi specifikt bemærke, at threonin, asparagin, fumarsyre og linolsyre er ikke blot steg i knoglemetastaser men også i den primære prostatavæv fra patienter med verificerede knoglemetastaser sammenlignet med M0 patienter. Essentiel fedtsyre såsom linolsyre er blevet vist at stimulere PCa tumorvækst i modelsystemer [42], [43], og omdannelsen af ​​linolsyre til arachidonsyre og videre ind prostaglandiner kan muligvis stimulere et inflammatorisk respons, der er associeret med patogenese PCA [44].

Hverken kolesterol eller sarcosin blev imidlertid prognostisk for knoglemetastaser i plasma. I stedet blev der fundet høje niveauer af glutaminsyre, phenylalanin og taurin i PCa knoglemetastaser væv og i plasma fra mænd med diagnosticerede PCA knoglemetastaser. Glutaminsyre blev for nylig vist i undersøgelsen fra Sreekumar og kolleger skal øges i PCa væv [9] og interessant, kræftceller, der forårsager knogle forstyrrelser i dyremodeller udskiller glutamat i deres miljø [45]. Som glutamaterge intercellulære kommunikation er vigtig for normal knoglehomøostase via glutamatreceptorer om specifikke knogleceller (gennemgået i [46]) er det muligt at kunne detekteres forstyrrelser indenfor dette system under processen med knoglemetastaser. Vores resultater er også i overensstemmelse med en nylig undersøgelse, der findes højere taurin niveauer i PCa end i godartet væv, når vurderes ved hjælp af magiske vinkel spinning ((1) H HR-MAS) NMR-spektroskopi [47]. Værdien af ​​disse metabolitter som plasma markører for aggressiv PCa skal dog bekræftet i yderligere undersøgelser.

Som konklusion, vi har identificeret metabolitter forbundet med prostatakræft metastaser og specifikt bemærkede høje niveauer af kolesterol i PCA knoglemetastaser. Baseret på vores resultater og den tidligere litteratur, dette gør kolesterol en mulig terapeutisk mål for avancerede PCa. Selv om dette er den største metabolomiske studie af PCA knoglemetastaser udførte det helt sikkert har sine begrænsninger. Tidligere

1H NMR-undersøgelser har afsløret tydelige ændringer i niveauet af citrat og cholin mellem godartet prostata og tumorvæv [5], [6], [7] men noget bekymrende, var vi ikke i stand til at finde sådanne forskelle i citrat niveauer. Hverken kunne vi med vores metode opdage cholin. Disse resultater kan fremhæve begrænsninger vores metode og påpege behovet for supplerende tiltag i jagten på nyttige metabolomiske biomarkører. Desuden det ret lave antal patienter inkluderet og heterogenitet af metastatisk sygdom gør evaluering i yderligere undersøgelser er nødvendige, før betydningen af ​​vores resultater kunne være sikker.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

Undersøgelser blev godkendt af den lokale etik revision bestyrelse Umeå Universitet, og deltagerne gav skriftlig eller mundtlig samtykke.

prøver

knoglemetastaser og tilstødende normalt optræder knogle væv stykker blev opnået fra en serie af frisk frosset biopsier indsamlet fra patienter med kræft diagnose eller mistanke om kræft, der drives for metastatisk rygmarvskompression eller patologiske frakturer (tabel 1). Patienter er blevet grundigt beskrevet i [14].

Blood plasma var tilgængelige fra en række mænd, der fik foretaget transrektale ultralyd-vejledt nål biopsier af prostata, som følge af øget serum PSA-niveauer, og primær PCa og godartet prostata biopsier var vurderbare i nogle tilfælde (Tabel 3). Patienterne i denne undersøgelse blev alle udvalgt til at have høj risiko tumorer defineret som; tilstedeværelse af knoglemetastaser eller et lokalt fremskreden tumor eller en dårligt differentieret kræft (M1 og /eller T3-4 og /eller GS 8-10), mens mænd med godartet sygdom havde mindst to runder af negative biopsier. PCA sager og de godartede sager blev matchet efter gang siden prøveudtagning. Yderligere oplysninger om patienter og prøveforberedelse er givet i støtte tekst (Text S1).

metabolomiske profilering ved hjælp GC /TOF-MS

Inden GC /TOF-MS-analyse af de lavmolekylære metabolitter i plasmaprøver var ekstraheret og derivatiseres som beskrevet tidligere [48]. Vævsprøver blev ekstraheret med H

2O /methanol /chloroform (01:03:01) blanding indeholdende 11 interne standarder A [48] (1 ml pr 15 mg væv) jævnt fordelt over den kromatografiske retentionstid span. Ekstraktionen blev udført på i perlemølle med to wolfram perler og resten af ​​proceduren var den samme som for plasmaprøver. Derivatiserede prøveekstrakter blev derefter injiceret i splitless tilstand ved en CTC Combi Pal autosampler (CTC Analytics AG, Zwingen, Schweiz) til et Agilent 6890 gaskromatograf udstyret med en 10 m × 0,18 mm i.d. kvartsglas kapillarkolonne med en kemisk bundet 0,18 um DB 5-MS stationære fase (J W Scientific, Folsom, Californien, USA). Søjleeffluenten blev indført i ionkilden af ​​et Pegasus III time-of-flight massespektrometer, GC /TOFMS (Leco Corp., St. Joseph, MI, USA). En alkan serie (C10-C40) blev kørt for hver enkelt GC /TOF-MS køre. Flere oplysninger om prøveforberedelse, derivatisering og GC /TOFMS analyser kan findes i de supplerende oplysninger. Reproducerbarhed metoden er blevet rapporteret tidligere [16], [48].

Databehandling

Data forbehandling herunder baseline korrektion, kromatogram justering, tid-vindue indstilling, hierarkisk multivariat kurve opløsning (H-MCR) [11] og normalisering blev udført i MATLAB [udgave 7.3] med brugerdefinerede scripts. Flere detaljer om databehandling kan findes i den bærende oplysninger (Tekst S1)

Dataanalyse og statistik

Orthogonal partielle mindste kvadrater -. Diskriminant analyse (OPLS-DA) [49] var anvendes til at udtrække og fortolke den systematiske variation i løst GC /TOFMS væv og plasma profiler relateret til specifikke reaktioner. Formålet var at ekstrahere metaboliske mønster i relation til PCa og mere specifikt til metastatisk sygdom.