Abstrakt
LIN28B er involveret i “stemness” og tumorudvikling ved negativt at regulere modning af
Lad-7
microRNA familiemedlemmer. I denne undersøgelse viste vi, at LIN28B udtryk fremmer migration og gentagelse af tyktarmskræft. Immunhistokemi og reverse-transskription polymerase kædereaktioner blev udført for at afsløre LIN28B udtryk i tyktarmskræft væv microarrays, paraffinindlejrede kirurgiske operativt fjernede væv og kræftceller. Tab af funktion, blev migration og spredning analyser udført for at afgrænse de potentielle roller LIN28B i tyktarmskræft. LIN28B blev opreguleret i tyktarmskræft væv sammenlignet med normal slimhinde, og dets overekspression korreleret med reduceret overlevelse patient og øget tumortilbagevenden. LIN28B undertrykkelse hæmmede migration af SW480 kolon kræftceller og lettet cytotoksicitet induceret af oxaliplatin i SW480 og HCT116 kolon kræftceller. Afslutningsvis LIN28B overekspression bidrager til kolon tumorudvikling, og LIN28B kan tjene som et diagnostisk værktøj og terapeutisk mål for tyktarmskræft
Henvisning:. Pang M, Wu G, Hou X, Hou N, Liang L, Jia G et al. (2014) LIN28B Fremmer Colon Cancer Migration og Gentagelse. PLoS ONE 9 (10): e109169. doi: 10,1371 /journal.pone.0109169
Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan
Modtaget: Juli 6, 2014 Accepteret: August 28, 2014; Udgivet 31. oktober, 2014
Copyright: © 2014 Pang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut for Folkesundhed i provinsen Sichuan (110.167). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
LIN28
blev oprindeligt identificeret i
C. elegans
og viste sig at være ansvarlig for timingen af udvikling [1]. LIN28 inducerer pluripotens udtrykt i somatiske fibroblaster sammen med
OCT4
,
SOX2
KLF4
.
LIN28B
, som homolog af
LIN28
, blev først klonet fra og vist sig at være overudtrykt i humane hepatocellulært carcinom celler og kliniske prøver i 2006 [2]. LIN28B er en udviklingsmæssigt reguleret RNA-bindende protein, der fremmer tumorigenese ved at blokere den post-transkriptionel processering af tumor-undertrykkende pri- /præ-
lad-7
microRNA [3], [4]. Evne LIN28B at regulere
Lad-7
, en
bona fide
tumor-suppressor, er i overensstemmelse med dets udviklingsmæssige rolle i reguleringen af celledeling og differentiering. Interessant, flere undersøgelser vist, at
LIN28B
selv er også et mål for
Lad-7
familiemedlemmer, herunder miR-125b [5]. Udover
Lad-7
, LIN28B kan også binde mRNA af intestinale stamcelle markører, såsom
LGR5
PROM1
[6]. Sammenfattende LIN28B fremmer transformation primært ved at undertrykke
Lad-7
. Konkurrencen mellem LIN28B og
Lad-7
kan være kritisk for normal cellebiologi og kan accelerere tumor udvikling, når denne balance forstyrres.
LIN28B
er hypermethyleret i somatiske væv [ ,,,0],7], og dens afvigende reaktivering kan fremme tumorudvikling [8]. LIN28B ofte overudtrykt i flere kræftformer, især avancerede typer såsom progressiv hepatocellulært carcinom [2], [9], epitelial ovariecancer [10], Wilms tumor og kimcelletumorer [9]. Ud over at blive ramt af forhenværende microRNA’er er LIN28B aktiveres ved flere onkogene veje. C- /N-myc inducerer LIN28B udtryk i flere menneskelige og mus tumormodeller, hvilket resulterer i
Lad-7
undertrykkelse og celledeling [11], [12].
MitCN
amplifikation resulterer også i LIN28B overekspression [10], og det er blevet rapporteret, at c-Myc er relateret til sporadisk tyktarmscancer og familiær polypose coli [13], hvilket indebærer en rolle for LIN28B i coloncancer.
på trods af store resultater i kirurgi, kemoterapi og udvikling af nye molekylære målrettede lægemidler, såsom bevacizumab (Avastin), forekomsten af tyktarmskræft fortsætter med at stige [14]. Hvert år svulster i tyktarmen er ansvarlige for 655, 000 dødsfald globalt. Fordi
Lad-7
fungerer som en potentiel vækst suppressor i humane colon cancerceller [15], vi undersøgte LIN28B udtryk i tyktarmskræft væv til at bestemme balancen mellem LIN28B og
Lad-7
udtryk . Vi undersøgte LIN28B ekspression i humane coloncancer-tumorer via væv microarray og fandt, at LIN28B blev signifikant opreguleret i tumorvæv sammenlignet med normal colon mucosa. For yderligere at analysere overlevelsen af patienter med tyktarmskræft, valgte vi en ekstra kohorte af postoperative patienter med detaljerede patologi optegnelser og opfølgende data fra 2004 til 2009. Som forventet, LIN28B overekspression korreleret med reduceret overlevelse patient og en øget sandsynlighed for tumor tilbagefald . Desuden fandt vi, at tavshed LIN28B hæmmede migration af SW480 celler og sensibiliseret SW480 og HCT116 kolon kræftceller til oxaliplatin-induceret cytotoksicitet.
Patienter og metoder
Tumor væv analyse
prøver af humane coloncarcinomer og normale koloner blev opnået fra et humant coloncarcinom vævsarray (CO2161; US Biomax), som indeholdt 204 adenocarcinomer, 4 signetring cellecancere og 8 normale colon mucosa prøver. Detaljerede kliniske oplysninger, herunder differentiering status og TNM sortering, blev også leveret for hver prøve. En yderligere kohorte af 149 kolon carcinoma prøver blev indsamlet fra prøver, der var blevet kirurgisk resektion i 2004 fra samtykkende patienter på Nanfang Hospital (Southern Medical University, Guangzhou, Kina), ifølge en Institutional Review Board-godkendt protokol. Hver af disse sager blev fulgt, i detaljer, og med juni 2009. Vi bekræftede TNM klasse for prøver fra begge kohorter. I alt blev 357 tyktarmskræft tumorer og 8 normale colon prøver anvendt til IHC analyse. Den detaljerede oplysninger om alle tumorer og patienter er angivet i tabel 1. undersøgelsesprotokollen Den blev godkendt af den etiske gennemgang bestyrelse Nanfang Hospital. Vi har fået skriftlig informeret samtykke fra alle undersøgelsens deltagere. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og relevante politikker i Kina
To patologer scoret det LIN28B farvningsintensitet efter følgende skala:. En score på 0/1 blev brugt til betyde svag /lav LIN28B intensitet (0-25% positiv rate); en score på to repræsenterede mellemliggende intensitet (25-50% positive rate); og en score på 3 blev anvendt til høj intensitet farvning ( 50% positive sats). Tumorer af grad 1, 2 og 3 svarer til tumorer klassificeres som godt differentieret, moderat differentieret eller dårligt differentieret, henholdsvis ved hjælp af mikroskopi.
log rank test (Mantel-Cox og Breslow) blev udført for at sammenligne overlevelsen og gentagelse fordelinger af de forskellige intensitet grupper (0-2 vs. 3). Sammenhængen mellem farvning intensitet og overlevelse eller fornyet blev bestemt ved anvendelse af en chi-square analyse, og en 95% konfidensinterval blev beregnet til at bestemme statistisk signifikans.
Cell kultur
SW480, Caco2 og HCT116 colon cancer cellelinier blev indkøbt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og blev dyrket i Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM; Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, South Logan, UT, USA). Alle cellelinjer blev opretholdt i en CO 5%
2, befugtet atmosfære.
oligoribonukleotider
En LIN28B-specifikke siRNA og en negativ kontrol lille RNA (NC), blev bygget af Genepharma ( Shanghai, Kina). LIN28B- og GAPDH-specifikke primere blev syntetiseret af Takara (Takara Biotechnology, Dalian, Kina).
Cell transfektion
RNA oligoribonucleotider blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens instruktioner . Mellem 50 og 100 nM af RNA oligoribonucleotider blev anvendt til hver transfektion.
Semi-kvantitativ revers-transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) og kvantitativ revers-transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR)
Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) og blev derefter behandlet med DNase I (Tiangen Biotech, Beijing, Kina). CDNA’et for QRT-PCR blev syntetiseret med PrimeScript RT reagenskittet og gDNA viskelæder (Takara). amplifikationsprocedure PCR for GAPDH var som følger: 94 ° C i 3 min; 30 cykler af 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; og en terminal forlængelse ved 72 ° C i 5 min. Amplifikationen af LIN28B blev udført som følger: 95 ° C i 2 min; 30 cykler ved 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; og et sluttrin ved 72 ° C i 5 min. De QRT-PCR-analyser blev udført ved hjælp af SYBR PrimeScript RT-PCR-kit (Takara) for GAPDH og LIN28B.
Immunoblots
cytosolprotein fraktioner blev fremstillet under anvendelse af RIPA buffer (Beyotime Biotechnology, Haimen, Kina). Antistofferne anvendt til immunoblots var specifikke for LIN28B (1:10, ab71415; Abcam, Cambridge, MA, USA) og GAPDH (G9295; Sigma-Aldrich, USA). Western blots og IHC blev udført ifølge standardprocedurer.
Migrationsanalyse
SW480-celler (1 x 10
4-celler i 100 pi serumfrit medium), som var blevet transficeret med NC eller si-LIN28B blev placeret i top kammer Transwell kultur retter (8 um; BD Biosciences, San Jose, CA). Det nedre kammer blev fyldt med 600 pi af konditioneret medium. Efter 24 timer blev celler, som ikke havde migreret til det nedre kammer fjernet fra den øvre overflade af Transwell membran med en vatpind. Migrerede celler på den nedre membranoverfladen blev fikseret, farvet med 0,1% krystalviolet og afbildes.
Cellelevedygtighed analyse
SW480 eller HCT116-celler, som var blevet transficeret med enten NC eller si- LIN28B, blev podet i tre eksemplarer på plader med 96 brønde i en koncentration på 1 × 10
4 celler pr. Efter at cellerne havde levet op til pladerne, blev de inkuberet med forskellige koncentrationer af oxaliplatin (fx 100, 10, 1, 0,1, 0,01 og 0,001 mg /ml; Jiangsu Hengrui Medicine Co, Ltd, Jiangsu, Kina) til 4 timer og blev derefter overført til komplet medium i yderligere 20 timer. Ved den angivne tidspunkt blev 10 pi CCK-8-opløsning (Dojindo, Kumamoto, Japan) tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Absorbansen (A) blev registreret ved 450 nm ved anvendelse af en pladelæser. Eksperimentet blev udført tredobbelt, og cellen inhibering blev bestemt under anvendelse af følgende ligning: (1 – testgruppe A /kontrolgruppe A) x 100%. IC
50 (50% hæmmende koncentration) værdi blev beregnet ved anvendelse af specifik software (LOGIT metode).
Statistisk analyse
En log rank test blev udført for at sammenligne overlevelse og gentagelse distributioner for de forskellige intensitet grupper (0-2 vs. 3). Korrelationen mellem farvningsintensitet og overlevelse eller fornyet blev bestemt ifølge en chi-square-analyse, hvor p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. En 95% konfidensinterval beregnet for bekræftelse af statistisk signifikans.
Resultater
LIN28B blev opreguleret i tyktarmskarcinomer
For at undersøge de potentielle roller for LIN28B i tyktarmskræft, vi først sammenlignet LIN28B proteinekspression mellem 208 tumor prøver og 8 ikke-matchede normale mucosa prøver fra et væv microarray bruger IHC. Den farvning intensitet LIN28B blev scoret af to patologer, der var blindet for den kliniske oplysninger. I overensstemmelse med tidligere rapporter [6], [16], LIN28B var signifikant overudtrykt i tumorvæv sammenlignet med normale væv (figur 1, s. 0,001).
IHC viste, at LIN28B markant var opreguleret i tumorvæv sammenlignet med den normale slimhinde, som viste meget lidt LIN28B ekspression. Repræsentative grafer præsenteres.
LIN28B overekspression korreleret med reduceret overlevelse patient og en høj risiko for tilbagefald
Data fra patienter, som gennemgik kirurgi (TNM I-III, paraffin-indlejret kirurgisk resektion væv) blev yderligere analyseret via log rank test for at undersøge indflydelsen af LIN28B overekspression på patientens overlevelse og gentagelse. Denne analyse viste en sammenhæng mellem lav intensitet LIN28B farvning fra prøver af TNM klasse I og II tumorer og øget patientsikkerhed overlevelse (Mantel-Cox p 0,01; Breslow, s 0,01) og en lavere sandsynlighed for tumor recidiv (Mantel-Cox p Breslow p. . 0,01) (figur 2)
(A) Højere LIN28B farvningsintensitet fra trin I, II og III tyktarmskræft korrelerede med reduceret overlevelse patient. (B) Høj LIN28B udtryk var relateret til en højere sandsynlighed for tumor recidiv (p 0,01; log rank test).
Samlet set vores resultater viser, at LIN28B udtryk er tæt forbundet med den samlede patient overlevelse og gentagelse af tyktarmskræft.
LIN28B tab-of-funktion sensibiliseret SW480 og HCT116 celler til oxaliplatin cytotoksicitet
lad-7
tumor suppressor microRNA familiemedlemmer er kendt for at regulere kemosensitivitet [17], mens LIN28B fremmer malignitet primært ved at hæmme
lad-7
biogenese. Således har vi forsøgt at afgøre, om LIN28B kunne påvirke kemosensitivitet til oxaliplatin. Vi undersøgte LIN28B ekspression i tre colon cancer cellelinjer under anvendelse af RT-PCR og Western-blotting (fig. 3A). HCT116 og SW480-celler blev udvalgt til anvendelse i disse forsøg på grund af deres lave og høje niveau af Lin28 ekspression hhv. Oxaliplatin induceret koncentrationsafhængig cytotoksicitet i disse celler (fig. 3B). IC
50 værdi for oxaliplatin var 6,23 ± 0,75 mg /ml for HCT116 celler, og dette blev forøget med 30% til 10,7 ± 2,26 mikrogram /ml i SW480 celler. Dette fund antydede, at forskelle i LIN28B ekspression kan tjene til at modulere kemosensitivitet i colon cancerceller. For at verificere denne hypotese, vi konstrueret LIN28B-specifikke siRNA og styre små RNA. Effektiviteten af si-LIN28B blev bestemt i begge cellelinier (Fig. 4A-D), og derefter blev udført en CCK-8 analyse for at udforske samspillet mellem si-LIN28B og oxaliplatin i HCT116 og SW480 celler. Resultaterne viste en synergistisk virkning mellem si-LIN28B og oxaliplatin (fig. 3C-D), hvilket antyder, at målretningen af LIN28B kan være i stand til at sensibilisere coloncancer celler til oxaliplatin.
(A) RT- PCR og Western blot-analyser evalueret LIN28B ekspressionsniveauer i Caco2, SW480 og HCT116-celler. (B) SW480 og HCT116-celler blev udpladet i plader med 96 brønde og blev inkuberet med de angivne koncentrationer af oxaliplatin. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af en CCK-8 analysekit efter 72 timers eksponering for lægemidlet eller fortyndingsmiddel kontrol. IC
50 værdier blev beregnet efter kurvetilpasning ved anvendelse af XLfit software. (C-D) HCT116 og SW480-celler blev transficeret med NC eller si-LIN28B 24 timer før oxaliplatin (IC
50 værdi) behandling. Hæmningsintensiteten, normaliseret til NC, blev beregnet ved anvendelse CCK-8 absorbans ved de angivne tidspunkter. Dataene er vist som middel gange ændring ± SE (n = 3; t-test).
(A-B) RT-PCR og Western blot-analyser bekræftede effektiviteten af sh-LIN28B knockdown i HCT116 og SW480 celler. (C-D) En QRT-PCR-analyse bekræftede også nedregulering af LIN28B mRNA i disse celler. Dataene er repræsenteret som middelværdien ± SE. (N = 3; Studerendes
t
-test)
nedregulering af LIN28B undertrykt migrationen af SW480 celler
Som LIN28B overekspression var korreleret med tumor tilbagefald og patient overlevelse, vi næste forsøgt at undersøge, om LIN28B udtryk påvirker migrationen af tyktarmskræft celler. Vi slået ned LIN28B ekspression under anvendelse siRNA, og Transwell analyse viste, at suppression af LIN28B signifikant inhiberede migration af SW480-celler (fig. 5).
Cellerne blev transficeret med 50 nM NC eller si-LIN28B og var lov til at migrere gennem et Transwell kammer. Repræsentative grafer præsenteres.
Diskussion
Flere stemness-relaterede gener, som der henvises til som onkoføtale gener, menes at fremme tumorigenese ved re-udtryk i somatiske celler. Tilstedeværelsen af CD133
+ cancer stamceller eller cancerceller-initierende celler kan forklare metastase, gentagelse og kemo-resistens for tyktarmskræft [18], [19].
Lad-7
er involveret i reguleringen af selvstændige fornyelse og tumorigenicitet af brystkræft-initierende celler [20] og er også undertrykt i colon cancerceller [15]. LIN28B overekspression er kendt for at bidrage til carcinogenese ved at blokere biogenese af
Lad-7
, der fik os til at vurdere, om balancen mellem tumor-fremmende LIN28B og tumor-undertrykkende
Lad-7
var ændret på tyktarmskræft [21]. Vi fandt, at LIN28B ekspression blev opreguleret i colon tumorvæv, og dette udtryk korreleret med reduceret overlevelse patient, og en større sandsynlighed for tilbagefald. Derudover lyddæmpning af LIN28B sensibiliserede tyktarmskræft celler til cytotoksicitet induceret af oxaliplatin og hæmmede deres migration
in vitro
.
Lin28
udtrykkes i forskellige stamcelle-populationer, skønt sit udtryk i terminalt differentierede somatiske væv er knappe. For nylig, når de udtrykkes i kombination med
OCT4
,
NANOG
SOX2, Lin28
viste sig at fungere som en erstatning for
c-myc
til omprogrammere humane somatiske fibroblaster til pluripotens [22]. Som homolog af Lin28,
LIN28B
er primært blevet klonet fra hepatocellulære carcinomer og dets overekspression har vist sig at fremme cancercelleproliferation [2]. Aktiveringen af LIN28B resultater i reduceret undertrykkelse af
Lad-7
mål, såsom
HMGA2
,
Dicer1
[10],
KRAS
[23 ] og
c-Myc
, og aktiveringen af tilsvarende onkogene signalveje. Interessant,
LIN28B
og dens opstrøms regulator
c-myc
[12] er også mål for
Lad-7
; dermed en
c-myc-LIN28B-lad-7
akse, eller feedback loop, der kan tjene til at undertrykke tumorvækst, kan eksistere. Således kan tab af kontrol over denne akse accelerere tumorvækst
Som tidligere nævnt,
LIN28B
er reguleret af flere onkogene faktorer.; medlemmer af
MYC
familie, herunder
C-Myc
,
N-myc
MitCN
kan aktivere LIN28B, hvilket tyder på, at
LIN28B
er et vigtigt mål for
MYC
og kan forklare, hvorfor
LIN28B
kan erstatte
c-myc
for omprogrammering af somatiske celler i pluripotens.
c-myc
transskription faktor kan aktiveres af
Wnt /APC
vej, som er dereguleret i tyktarmskræft [24].
APC
genændringer, hvis ikke arvet, repræsenterer de tidligste molekylære forandringer under udviklingen af tyktarmskræft, mens strukturelle ændringer af
myc, ras, p53
,
MCC
og
DCC
gener anses for at repræsentere sene hændelser [25]. Sammenfattende vores resultater afslører eksistensen af en foreløbig
Wnt /APC
–
Myc
–
LIN28B
–
Lad-7
vej hos kolon carcinogenese . Vi hypotese, at
Wnt /APC
–
Myc
-aktivering er den initierende begivenhed, og at
LIN28B-lad-7-c-myc /LIN28B
feedback accelererer kolon carcinogenese. Dog er yderligere undersøgelser nødvendige for at kontrollere rolle denne feedback loop i carcinogenese.
Metastase og gentagelse er de primære årsager til faldet i samlet overlevelse blandt patienter med maligne tumorer. Det er således af stor interesse at kunne forudsige tumormetastase og fornyet på et tidligt stadium. Desuden forudser tumor tilbagefald til fase II /III-patienter kan vejlede adjuverende kemoterapi. Forbedrede metoder til at identificere stadie II patienter på en høj risiko for tilbagefald [26], som er baseret på de unikke kendetegn ved hver enkelt tumor, kan resultere i tusinder af liv sparede hvert år. Desuden teknikker til at identificere trin III patienter, som har en lav risiko for tilbagefald efter operationen kan spare disse individer fra omkostninger, tid og toksicitet associeret med kemoterapi [27]. I vores undersøgelse LIN28B farvningsintensitet ( 50%) korrelerede med reduceret overlevelse patient. Vigtigt er det, kunne LIN28B udtryk forudsige gentagelse af TNM klasse II /III tumorer efter kirurgisk resektion.
Mens dette manuskript var i forberedelse, en undersøgelse fra King et al. rapporterede, at LIN28B fremmer tyktarmskræft progression og metastase både
in vivo
[16] og
in vitro
gennem
Lad-7
-afhængig og -uafhængige mekanismer [6]. Vores data er i overensstemmelse med disse resultater, og vi også foreslå, at påvisning af ekspressionen af LIN28B kan hjælpe med at afgøre den rette ordning af adjuverende kemoterapi hos patienter med TNM grad II og III coloncarcinomer.
Som konklusion, vores data foreslå en vigtig rolle for
LIN28B
i colon carcinogenese. LIN28B udtryk viste sig at forudsige patientens overlevelse, hvilket indebærer, at
LIN28B
kan være et nyttigt mål for nye molekylære lægemidler.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.