PLoS ONE: Design af et High-Throughput Somatisk Mutation Profilering Panel Specifikt for Gynækologisk Cancers

Abstrakt

Somatiske mutationer spiller en stor rolle i tumor initiering og progression. Mutationen status for en tumor kan forudsige prognosen og guide målrettede behandlinger. Størstedelen af ​​teknikker til at studere onkogene mutationer kræver høj kvalitet og kvantitet DNA eller er analytisk udfordrende. Massespektrometri baseret mutationsanalyse er imidlertid en relativt simpel og høj-throughput metode egnet til formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE) tumor materiale. Målrettede gen paneler ved hjælp af denne teknik er blevet udviklet til flere typer af kræft. Disse nuværende kræft hotspot paneler er ikke fokuseret på de gener, der er mest relevante i gynækologisk cancer. I denne undersøgelse, rapporterer vi design og validering af en roman, massespektrometri baseret panel specielt til gynækologiske maligniteter og præsentere frekvenserne af fundne mutationer. Brug frekvens data fra online katalog af somatiske mutationer i Cancer, valgte vi 171 somatiske hotspot mutationer i de 13 vigtigste gener for gynækologisk cancer, bliver

BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS nationale tilsynsmyndigheder, PIK3CA, PPP2R1A

PTEN

. I alt 546 tumorer (205 livmoderhalskræft, 227 endometrie, 89 æggestokkene, og 25 vulva carcinomer) blev brugt til at teste og validere vores panel, og undersøge forekomsten og spektrum af somatiske mutationer i disse typer af kræft. Resultaterne blev valideret ved at teste dobbeltprøver og ved allelspecifik qPCR. Panelet præsenteres her bruger massespektrometri viser at de kan gentages og high-throughput, og er nyttigt i FFPE materiale af lav kvalitet og kvantitet. Det giver nye muligheder for at studere et stort antal gynækologiske tumor prøver i daglig praksis, og kunne være nyttige i guidede terapi udvalg

Henvisning:. Spaans VM, Trietsch MD, Crobach S, Stelloo E, Kremer D, Osse EM et al. (2014) Design af et High-Throughput Somatisk Mutation Profilering Panel Specifikt for Gynækologiske kræftformer. PLoS ONE 9 (3): e93451. doi: 10,1371 /journal.pone.0093451

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 18. december 2013; Accepteret: 4 mar 2014; Udgivet 26. marts, 2014

Copyright: © 2014 Spaans et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Susanne Muller arbejder som forsker for Sequenom, Hamburg Tyskland. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Cancer genomer bære somatiske mutationer, og mutationen spektrum varierer efter tumortype og subtype [1] , [2]. Evaluering en bred vifte af vigtige cancer genmutationer tværs af forskellige kræftformer har potentiale til at identificere klinisk relevante mutationer. Undersøgelser af melanom, lunge-, tyktarms-, og brystcarcinomer har vist, at somatisk mutation status kan anvendes til at forudsige prognose og vejlede tumorspecifikke behandlingsstrategier [3] – [6]. Gynækologiske maligniteter udgør 15-20% af alle nye kræfttilfælde hos kvinder over hele verden, og tal fortsætter med at stige [7], men carcinogenese af gynækologiske maligniteter er forskelligartet og den rolle, somatiske mutationer er endnu ikke fuldt belyst [1].

i det sidste årti, somatiske mutationer og deres rolle i målrettet terapi er blevet undersøgt hos gynækologiske maligniteter, men endnu ikke i samme omfang som i andre typer af cancer, såsom bryst- og coloncancer. Mutation profilering af gynækologiske maligniteter kan identificere nye lægemiddelkandidater og hjælpe med at forudsige patientens prognose og tumor respons på behandlingen. Forskning har afsløret overlappende genetiske ændringer samt lignende ramte signalveje i de forskellige typer af gynækologiske tumorer [8] – [14]

Når man studerer stort antal patientmateriale, vi står over for to typer problemer:. Teknisk anvendelighed og tumorspecificitet. I dag er kun et begrænset antal gener screenet i klinisk praksis. Det forventes, at dette tal vil stige betydeligt i den nærmeste fremtid. Derfor kræves der en hurtig og pålidelig metode til at påvise mutationer. Denne teknik skal være egnet til DNA ekstraheret fra formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv, som ofte er af lav kvalitet, eller fra små vævsbiopsier, som er af lav mængde. Matrix-assisteret laser desorption /ionisering tid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF) har vist sig at opfylde alle disse kriterier [15] -. [17]

Som for tumor specificitet, i øjeblikket, flere onkogen paneler baseret på forskellige teknikker er (kommercielt) til rådighed. Disse paneler er med held blevet anvendt i at studere store mængder tumor prøver, for at trække de landskaber af somatiske mutationer, der kendetegner tumortyper [18] – [22]. Et udvalg af gener og mutationer er relevante for tumor undertyper har med succes ført til design af tumor specifikke paneler [15], [16], [23]. Endnu er der ingen paneler til rådighed, der er specielt designet til at målrette gynækologiske tumorer. Derfor er vi til formål at udvikle en high-throughput mutation panel angivet for gynækologiske maligniteter.

En meta-analyse af COSMIC (Katalog over somatiske mutationer i Cancer) online database [24], blev udført for at designe en MALDI -TOF-baseret, high-throughput mutation panel, der dækker somatiske mutationer i 13 gener, der hyppigst rapporterede at være involveret i gynækologiske maligniteter. Vi testede og validerede dette panel i et sæt af 546 hals-, endometrial, ovarie- og vulva carcinoma prøver. Her præsenterer vi udformningen af ​​en gynækologisk cancer specifik panel og hyppigheden af ​​somatiske mutationer identificeret ved hjælp af det.

Materialer og metoder

Alle menneskelige vævsprøver i denne undersøgelse blev anvendt i overensstemmelse med den medicinske etiske retningslinjer, der er beskrevet i kodeksen for korrekt sekundær anvendelse af humant væv etableret af det hollandske Federation of Medical Sciences (www.federa.org findes en engelsk oversættelse af koden here:

https://www.federa.org/sites/default/files/digital_version_first_part_code_of_conduct_in_uk_2011_12092012.pdf).

Patients modtage oplysninger om sekundær anvendelse af væv, der er udtaget til diagnostisk brug. De kan aktivt gøre indsigelse mod sekundær brug. Derfor disse retningslinjer, al menneskelig materiale, der anvendes i denne undersøgelse er blevet anonymiseret. På grund af denne anonymisering procedure, er retrospektiv forskning ikke kræver etisk godkendelse fra Institutional Review Board og individuelle patienters tilladelse er ikke nødvendig.

Panel design

først, PubMed og COSMIC [24] søgninger blev udført for at vælge gener og mutationer til optagelse i gynækologisk-specifik mutation panel. Selektion var baseret på, hvorvidt en mutation gentagne gange blev fundet at være muteret i gynækologiske maligniteter. for det andet, for at dække en stor procentdel af de rapporterede varianter pr gen, blev de hyppigste mutationer valgt for at få en rimelig gynækologisk -tissue-specifik dækning, som kun hotspot mutationer var egnede til analyse med MALDI-TOF-teknikken. Vi sigtede mod at vælge gener, hvor mindst en af ​​de undersøgte gynækologiske cancertyper (f.eks vulva, cervix, endometrie eller ovariecancer), mindst 30% af alle rapporterede mutationer opstod på mindre end 10 forskellige steder på genet

Etablering af en gynækologisk specifik ‘hotspot’ gen panel -. GynCarta 1,0

Rådgivning PubMed og COSMIC databaser viste klart et overlap i top ti gener muteret i livmoderhalsen, endometrie og ovariecancer. Få somatiske mutation undersøgelser er blevet udført på vulvacancer og dermed for denne tumortype vi påberåbt frekvenser findes i lignende typer tumor (fx planocellulært karcinom i huden på andre sites, og planocellulært karcinom i hoved og hals). De hyppigst muterede gener, der opfyldte vores inklusionskriterier blev udvalgt til panelet. Det første panel vi udpeget “GynCarta 1,0” (Sequenom, Hamburg, Tyskland) bestod af 89 analyser (12 multiplekser) for at detektere 154 mutationer i 12 gener, der opfyldt vores inklusionskriterier:

BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, PIK3CA

, og

PTEN

.

Assay design

MySequenom.com online assay designværktøjer blev brugt til at designe somatisk mutation påvisningsassays. En maksimal multiplex niveau på 12 assays pr brønd blev anvendt. Hvis det er muligt, blev mutant allel extension toppe udformet som først opdaget allel toppe og de vilde typen udvidelse toppe som den sidste detekterede allel toppe til at reducere faren for falske positiver fra salt addukter. Alle assays blev valideret på vildtype DNA, negative kontroller og udvalgte kendte positive mutation prøver.

mutationsdetektion

Mutation detektion blev udført ved Leiden University Medical Center efter fabrikantens protokol (Sequenom, Hamburg , Tyskland) som tidligere [29] beskrevne. Kort fortalt blev vildtype og mutante DNA amplificeret ved multiplex-PCR. Reje-alkalisk phosphatase behandling inaktiveret overskydende nukleotider. En primerforlængelsesreaktion (IPLEX Pro) blev udført med masse-modificeret terminator nukleotider, og produktet blev spottet på en SpectroCHIP (Sequenom, Hamburg, Tyskland). Mutant og vildtype alleler blev derefter diskrimineret hjælp MALDI-TOF massespektrometri.

Dataanalyse

Data blev analyseret med MassARRAY Typer Analyser software (Typer 4.0.22, Sequenom, Hamburg, Tyskland). Mutationer blev påvist ved en tærskel af den mutante allel peak minimum 5%. Tre efterforskere blindet til tumor identifikation manuelt revideret output, og en konsensus bestemmelse blev nået. Statistiske analyser blev udført med IBM SPSS statistik data Editor version 20.0. De uafhængige Students

t

-test blev anvendt til at sammenligne baseline variabler, og Fishers eksakte test blev anvendt til at analysere kategoriske og normalfordelte numeriske data.

P

-værdier ≤0.05, svarende til 95% konfidensintervaller, blev betragtet som statistisk signifikant. Alle tests blev tosidede.

Prøver

Først et træningssæt af 51 FFPE prøver (26 livmoderhalskræft, 17 endometrie, 6 æggestokkene og 2 vulvacancer prøver) blev brugt til at teste effektiviteten af designet panel. Efter mindre tekniske justeringer og forbedringer af panelet, blev antallet af patienter for hver vævstype udvidet.

I alt DNA fra 548 tumorprøver fra livmoderhalsen (

N =

209), endometrie (

N =

227), æggestokkene (

N =

89), og vulva (

N =

25) carcinom patienter blev isoleret. To livmoderhalskræft prøver mislykkedes for alle massespektrometri analyser og blev udelukket fra yderligere analyser. Følgende baseline parametre blev indsamlet: alder, FIGO (International Federation of Gynækologi og Obstetrik) fase, histopatologisk diagnose, tumor klasse eventuelt og humant papillomvirus (HPV) positivitet og skriver i tilfælde af livmoderhalskræft og vulva tumorer (tabel 1)

DNA isolation

DNA blev isoleret fra FFPE væv blokke for 505 prøver og fra frisk frosset (FF) væv i 43 ovariecarcinomer. Tre til fem 0,6 mm væv diameter kerner af variabel længde blev taget fra FFPE blokke fra et udvalgt område omfatter -70% tumorceller. I 34 prøver blev tumorceller fordelt diffust, og derfor mikro-dissektion blev udført på 10 hæmatoxylin-farvede 10-um snit til opnåelse af en høj procentdel af tumorceller. DNA-isolering blev udført som beskrevet før [25] efterfulgt af DNA-oprensning (NucleoSpin Tissue kit, Machery-Nagel, Tyskland) eller blev udført fuldautomatisk ved anvendelse af Vævspræparat System (Siemens Healthcare Diagnostics, NY, USA) [28].

DNA kvalitet

DNA af alle prøver blev isoleret og testet for kvalitet; 493 (90%) prøver scorede ≥1 til DNA kvalitet ved hjælp af PCR, og dette blev anset for tilstrækkeligt. To prøver, både cervikale karcinomer med en DNA-kvalitet score på 0, mislykkedes i alle analyser, hvilket giver en succesrate på 99,99%. Begge prøver blev udelukket fra yderligere analyse. Generelt prøver med lav kvalitet DNA var mere tilbøjelige til at svigte i visse analyser, men 27 ud af 48 prøver (56%) med DNA kvalitetsresultater af 0 blev analyseret med succes i alle assays, og 40 ud af 48 (83%) lav prøver kvalitet blev analyseret med succes i mere end 90% af assayene. Procentdelen af ​​succes analyserede prøver var ikke signifikant forskellig mellem FFPE og friske frosne prøver. Dette bekræfter, at MALDI-TOF mutation påvisningsmetode er yderst velegnet til analyse af lavere kvalitet, FFPE ekstraheret DNA.

Validering

I alt 546 tumor prøver blev inkluderet i denne undersøgelse. For at vurdere assay reproducerbarhed blev 57 (10%) prøver testet in duplo og en anden 26 (5%) i tre eksemplarer. Af de oprindeligt påviste mutationer i disse prøver, blev 95% (40/42) bekræftede i to eksemplarer og 97% (30/31) blev bekræftet i tre eksemplarer. Ikke-skabelon (

N

= 4) og vildtype leukocyt DNA (

N

= 2) kontroller blev inkluderet i hver multiplex at opnå negativ og vildtype MALDI-TOF spektre. Desuden er der for en random30% (163 prøver),

KRAS

PIK3CA

mutationer valideret ved anvendelse allel-specifik qPCR som beskrevet tidligere [26] på 7 mutation varianter af

KRAS

(p.G12C, p.G12R, p.G12S, p.G12V, p.G12A, p.G12D, p.G13D) og 3 mutation varianter af

PIK3CA

(p.E542K, s. E545K, p.H1047R), og en konkordans på 99,4% blev opnået. (Figur 1) GynCarta panel detekteret flere mutationer end allelspecifik qPCR gjorde. Dette kunne forklares ved det faktum, at massespektrometri kan detektere mutante alleler med en lavere frekvens (ned til 5%) end allel-specifik PCR er (ned til 20%). Det faktum, at vi ikke finde nogen mutationer i vildtype kontrol-DNA, eller i nogen af ​​H

2O negative kontroller styrker vores tro på, at disse yderligere mutationer er sande mutationer snarere end falske positiver.

overensstemmelse mellem MALDI-TOF mutation genotypning (GynCarta, Sequenom, Hamburg, Tyskland) og allel-specifik qPCR for 3

PIK3CA

og 7

KRAS

mutationer blev bestemt for 164 (30% af det samlede kohorte af 546 carcinomer) prøver at validere resultaterne. Overensstemmelse blev beregnet for alle vildtype-vildtype kampe (1546 i alt) og alle mutation-mutation kampe (45 i alt) i alle reaktioner (164 * 10, 1640 i alt). Mislykkede reaktioner blev udelukket, fordi sammenligning ikke var muligt (4 * 3 for

PIK3CA

og 4 * 7 for

KRAS

, 40 i alt). Dette førte til en overensstemmelse mellem (1546 + 45) /(1640-1640) = 0,994. WT = Vildtype; MUT = mutant.

Forbedring af panelet og skabe GynCarta 2,0

Med de første mutationsmønstre data fra GynCarta 1.0 og litteratur rapporter om nye onkogene mutationer, var vi i stand til at forbedre GynCarta 1.0 panel ved at fjerne analyser af mutationer, der ikke blev registreret (

CDKN2A

D108Y, D108XA, Y108XC;

FGFR3

Y373C, A391E, K650Q, K650E, K650T, K650M, S371C;

KRAS

G13S og

NTM

G13V, G13A, G13D, G13C, G13R, G13S) og ved at tilføje 10 nye hotspot mutationer af de allerede er inkluderet gener. Denne måde, dækningen af ​​

FGFR2

PIK3CA

blev øget fra 59% til 71% og fra 72% til 76%, hhv. Endvidere assays, der havde vist sig at være vanskelig at fortolke på grund af små artefakt toppe blev forbedret. Under afprøvning og validering periode,

PPP2R1A

, en ny gen af ​​interesse, var dukket fra litteraturen [27] – [29]. Ni mutationer af dette gen blev også tilføjet til panelet, hvilket skaber ‘GynCarta version 2.0 «. En komplet oversigt over de mutationer, der indgår i GynCarta 2.0 mutation panel er angivet i tabel 2, med den ekstra analyser, der er anført med fed skrift. Analyserne for GynCarta 2.0 blev organiseret på en sådan måde, at i alt 13 multiplexere kunne bruges til at analysere den fulde panel, koncentrerer de nye analyser på 4 multiplex. Disse 4 multiplex blev brugt til at analysere de 497 prøver af bekræftelsen sæt.

Resultater

Mutationer identificeret ved hjælp GynCarta 1,0 og 2,0

Mutation genotypebestemmelse hjælp GynCarta 1.0 afsløret 395 mutationer i 273 (50%) prøver. De fleste mutationer blev påvist i endometriske carcinomer (177 prøver (64%)), efterfulgt af ovariecarcinomer (33 prøver (37%)), cervikale carcinomer (67 prøver (33%)) og vulva carcinomer (5 prøver (20% )).

PIK3CA

blev muteret hyppigst (122 prøver), efterfulgt af

PTEN Hotel (97 prøver) og

KRAS

(64 prøver). Ingen mutationer blev fundet i

BRAF

FOXL2

Mutation genotypebestemmelse hjælp GynCarta 2.0 detekteret yderligere 36 mutationer:. 4 om

FGFR2

og 5 på

PIK3CA

.

PPP2R1A

mutationer blev påvist i 27 prøver (7 cervikale, 18 endometrie, 2 æggestokkene og 0 vulva prøver).

Da panel version 1.0 og 2.0 havde nogle overlappende analyser, vi var i stand til at sammenligne resultaterne af begge paneler. Vi har ikke afsløre eventuelle afvigende mutation opkald, men vi var i stand til at analysere analyser, der var svære at fortolke i GynCarta 1.0 fordi disse analyser var forbedret i GynCarta 2.0. Vi opnåede også en succes udgang for 3 prøver, der var mislykkedes i GynCarta 1.0. De mutation frekvenser for hvert locus er sammenfattet i tabel 3. mutation spektret visualiseres i figur 2.

spektrum og frekvenser af mutationer identificeret ved hjælp af MALDI-TOF i 546 gynækologiske karcinomer. Mutationen spektret vises (fra top til bund) for livmoderhalskræft (

N

= 205), endometrie (

N

= 227), æggestokkene (

N

= 89) og vulva karcinomer (

N

= 25). Fra venstre mod højre,

N

er antallet af prøver med mutationen, ‘%’ er den procentdel af muterede prøver inden kohorten, og bjælker repræsenterer de procentsatser grafisk: blå, 4 mutationer per prøve (

N

= 6); rød, 3 mutationer per prøve (

N =

29); grøn, 2 mutationer per prøve (

N =

65); og gul, en mutation per prøve (

N =

189).

De fundne mutationsfrekvenser blev sammenlignet med de forventede antal mutationer baseret på frekvenserne angivet i COSMIC database [23] og korrigeret for panelet dækning (tabel 4).

PIK3CA

mutationer blev fundet dobbelt så hyppigt som forudsagt i livmoderhalskræft (

N

= 23 forudsagt og

N =

51 fundet) og i endometriecancer (

N

= 32 forudsagt og

N =

71 fundet).

PTEN

mutationer blev også påvist oftere i endometriecancer end forudsagt (

N =

35 forudsagt og

N =

104 opdaget). Dog ingen

PTEN

mutationer blev påvist i vulvacancer selvom

N =

8 mutationer blev forudsagt [19].

Desuden ingen

BRAF

eller

FOXL2

mutationer blev påvist i denne kohorte, trods den høje dækning af begge gener fra panelet. Dette kunne forklares ved, at

FOXL2

er stærkt forbundet med granulosa celle tumorer i æggestokkene [30], en undertype af kræft i æggestokkene, der blev udelukket fra vores undersøgelse kohorte.

GynCarta 2.0 kan anvendes til differentiering tumortyper

En visuel illustration opsummerer mutationsfrekvenser i de forskellige tumortyper er afbildet i figur 2. Som vist i figur 2, gynækologiske tumorer udviser betydelig overlapning i somatiske mutationer, selvom vævsspecifikke profiler kan også forstås.

endometriecancere har den højeste mutationsfrekvens i 78% af prøverne med mindst én mutation. Som forudsagt, de hyppigst muterede gener i gynækologisk cancer er gener af Pakt /mTOR pathway, men inden denne vej, variere mutationelle frekvenser mellem tumortyper. For kræft i æggestokkene,

KRAS

er den hyppigst muterede gen (18%), mens

PIK3CA

er mest påvirket i livmoderhalskræft (24%) og

PTEN

i endometrie cancer (39%). Selvom antallet af vulva carcinomer inkluderet er små, vulvacancer synes at have en anden mutations spektrum i forhold til andre gynækologiske maligniteter med

CDKN2A Hotel (12%) og

HRAS Hotel (8%) mest ofte påvirket.

En interessant forskel kan observeres, når man sammenligner

PIK3CA

fordeling mellem livmoderhalskræft og de øvrige tumortyper. I endometrie (og ovariecancer),

PIK3CA

mutationer findes hyppigst på hotspots placeret på exon 9 og exon 20, med en jævn fordeling mellem disse exons (33% og 45%). I livmoderhalskræft dog mutationer næsten udelukkende forekommer på loci på exon 9 (47 ud af 50 (94%)

PIK3CA

mutationer). Denne klare forskel (

s

0,0001) kan anvendes i klinisk praksis, når differentiere primær livmoderhalskræft fra primær endometriecancer

Diskussion

Efterspørgslen efter individuel kræft. terapi er steget i de senere år. Nye genotypebestemmelse teknikker gør det muligt tumorer der skal karakteriseres ud fra deres genomiske profiler, som har afsløret nye mål for tumor-specifik behandling, forudsat indsigt i tumorrespons at kemo- og radiotherapies, og hjalp forudsige patientresultatet [3] – [6], [ ,,,0],9], [12], [14]. Gynækologiske maligniteter udgør 15-20% af alle maligniteter hos kvinder på verdensplan [7]. De kliniske konsekvenser af somatiske mutationer i forskellige gynækologiske maligniteter er endnu ikke fuldt forstået. I den foreliggende undersøgelse har vi designet et panel, der er meget specifik for en bred vifte af gynækologiske cancere, at undersøgte tumor-specifik mutation spektrum af 162 mutationer af 13 gener. Brug af denne panel, fandt vi, at i denne serie somatiske mutationer var til stede i 36% af alle cervicale carcinomer, i 78% af endometriale carcinomer, i 37% af ovariecarcinomer og i 20% af vulva carcinomer.

Somatic mutation spektre blev tidligere undersøgt i gynækologisk cancer også ved hjælp af MALDI-TOF [17], [18], [22], [31] – [33]. Men de fleste af disse undersøgelser anvendte generiske kræft gen paneler baseret på de rapporterede frekvenser i alle solide tumorer eller brugte allerede eksisterende paneler, der var designet til generel onkologi [17], [22], [31] – [33]. Disse allerede eksisterende, kommercielt tilgængelige paneler er ikke justeret til området for gynækologisk onkologi, med den ulempe, der indeholder gener, som ikke er involveret i gynækologiske kræftformer såsom

FLT3

KIT

, eller udelade gener, der har vist sig at være involveret relativt hyppige i gynækologisk cancer, såsom

PIK3CA

. Derfor har vi skabt et MALDI-TOF-baserede mutation panel designet specielt til at opdage en bred vifte af de mest almindelige hotspot mutationer, der er blevet rapporteret i forskellige typer af gynækologiske tumorer. Lignende mutation paneler er designet specielt til melanomer, kolon carcinomer og ikke-småcellet lungecancer [15], [16], [20]. Ved at bruge en gynækologisk specifik panel, vi studerede eneste relevante mutationer, herunder for eksempel

PIK3CA

PPP2R1A Hoteller, som der ikke er medtaget i generelle paneler som OncoCarta (Sequenom, Hamburg, Tyskland) og med en bedre og mere specifik dækning (for eksempel

CTNNB1

). Som et resultat, kan de rapporterede frekvenser af gen-involvering varierer betydeligt. For eksempel i vores serie for endometriecancer, en

KRAS

mutation på 17% blev påvist. Dette er i modsætning til studiet af Cote et al [32], at anvendelse af en generisk kræftpsykologisk panel, rapporterer en

KRAS

mutation på kun 1% i endometriecancer. Fra andre undersøgelser ved hjælp af forskellige teknikker, er det kendt, at

KRAS

er muteret i 15-20% af alle livmoderkræft [18], [34]. Dette eksempel viser, at pålideligheden af ​​undersøgelser under anvendelse af en MALDI-TOF tilgang alvorligt påvirkes af valget og omfanget af dækningen af ​​generne inkorporeret i panelet.

Tilfredsstillende dækning af generne i vores panel blev opnået for mutationerne vi undersøgte, og mutationen spektre genereres i denne undersøgelse er således en pålidelig repræsentation af mutationsfrekvenser i gynækologiske maligniteter i de gener, der er udvalgt til dette panel. Men nogle relevante gener, såsom

TP53

ARID1a

, [8], [13], [34] – [39] indgik ikke i vores panel, fordi de ikke opfylde kriterium for en “hotspot gen”. Begge gener har mutationer spredt bredt i hele genet og derfor ikke egnet til en MALDI-TOF tilgang. Der er nogle loci i

TP53

ARID1a Hoteller, som hyppigere muteret; men disse dækker ikke mere end 20% af alle sine kendte mutationer. Herunder nogle af disse loci i vores panel undervurdering af den sande mutations hyppigheden af ​​disse gener i gynækologiske kræftformer. Deres mutationsfrekvenser kunne studeres bedre at bruge andre metoder til påvisning, såsom Sanger sekventering eller ved næste generation sekventering (NGS).

Vi beslutter at omfatte 22 analyser for tumorsuppressorgen

PTEN

, hvilket resulterer i en 40% dækning, som kunne anses for suboptimal ved hjælp af denne fremgangsmåde. Mutationen frekvens rapporterede her er derfor sandsynligt, undervurderer den sande somatiske mutations hyppighed af

PTEN

. Derudover kan tab af PTEN også være forårsaget af andre molekylære forandringer, såsom LOH og promotor hypermethylering [40]. Derfor er yderligere brug af andre teknikker, såsom immunhistokemi rådes til at vurdere den sande status PTEN.

CDKN2A

er ikke virkelig et hotspot muterede gen også, men det blev tilføjet til panelet grund af dets høje forudsagte relevans i vulvacancer, og fordi vi forventede at opnå en rimelig dækning af genet. Tumorer, der indgår i COSMIC database viser ofte fuldstændig tab af, eller større deletioner i

CDKN2A

gen, en type mutation, der ikke let kan påvises ved MALDI-TOF massespektrometri. Men da

CDKN2A

mutationer i pladecellekræft i huden er rapporteret til at være oftere punktmutationer end (stor) sletninger, mener vi, at tilføje

CDKN2A

punktmutationer til panelet kan give værdifulde oplysninger, især for vulvacancer. Selvom tallene er meget lave, resultater af forskning på

CDKN2A

imutations i vulva og penis pladecellekræft styrke denne hypotese [41].

FBXW7

synes at have en lav dækning af panelet, men dette er påvirket af, at det er blevet undersøgt og fundet at være muteret i et forholdsvis lille antal gynækologiske tumorer. Når man overvejer det store antal tilgængelige data fra forskning i tyktarmskræft, den forventede dækning er ca. 35%.

Nye teknologier som næste generation sekventering er i stand til at opdage mutationer i flere gener uden at udvælgelse af og kan derfor overvinde begrænsninger af en masse-spektrometri tilgang. Med NGS, kan komplette gener af interesse analyseres og derfor alle mutationer vil blive fundet. bioinformatisk analyse af de data, der produceres af NGS kan dog være udfordrende og er stadig i udvikling. Derudover kan der differentieres mellem ikke-patogene somatiske varianter og patogene mutationer være tidskrævende og kompleks [42]. Til sammenligning MALDI-TOF dataanalyse er meget mere ligetil, især når man analyserer mutationer med kendt klinisk relevans. Panelet vi præsenterer her dækker de hyppigste mutationer i gynækologisk cancer, med nogle få undtagelser. Mutationen spektre vi har opdaget er sammenlignelige med de spektre, rapporteret i NGS og exome sekventering undersøgelser, der fokuserer på gynækologisk cancer [8], [43], [44]. Derfor MALDI-TOF massespektrometri har potentiale til anvendelse i et klinisk miljø, at detektere mutationsstatus af relevante gener i en hurtig og pålidelig måde. En anden klar fordel ved massespektrometri baseret mutation analyse er fleksibilitet til at tilføje og slette analyser fra et panel, som også vist i denne rapport, så nye indsigter eller kliniske krav kan vedtages nemt.

Den somatiske mutation landskab gynækologiske kræftformer produceret af denne undersøgelse (figur 2), og ved offentligt tilgængelige mutation biblioteker viser overlappende og særlige mutation profiler mellem gynækologiske tumorer. Mutationer i PI3K /Akt-pathway er hyppige og overlapper hinanden, men nogle karakteristiske mutationer blev identificeret. Et eksempel er den konstatering, at

PIK3CA

exon 20 mutationer kun sjældent forekommer i livmoderhalskræft, mens de er en hyppig fund i livmoderkræft. Dette fund kan være af værdi i et klinisk miljø, når der er usikkerhed om tumorer primære oprindelse, især i cervikale adenokarcinomer, der er HPV negative og placeret i livmoderen segment af livmoderen lav. Det illustrerer, at somatiske mutations oplysninger kan være nyttige til klassificering tumorer [45].

Somatisk mutation profilering kan også afsløre nye indsigter i tumortyper, der ikke godt karakteriserede endnu, såsom vulvacancer. Vulvacancer er en sjælden sygdom, der kan opstå ved en HPV-afhængig eller en HPV-uafhængig vej. Carcinogenesen af ​​HPV-uafhængig vulva carcinomer er stort set ukendt. I den foreliggende undersøgelse, 25 vulva carcinomer (heraf 19 HPV-negative tumorer) blev analyseret, og en

PIK3CA

, 3

CDKN2A

, og 2

HRAS

mutationer var fundet i HPV-negative carcinomer. Ingen mutationer blev påvist i nogen af ​​de 13 undersøgte gener i de 6 HPV-positive tumorer. Mutationen spektrum af vulvacancer synes forskellig fra spektret af andre gynækologiske cancere, men viser ligheder med mutationen spektrum af pladecellecarcinom har i hoved og hals [46], en tumortype, der deler morfologiske og ætiologiske karakteristika med vulva pladecellecarcinom . Det faktum, at vulvacancer ikke opstår i Mullarian opstod strukturer, som de andre tre tumortyper i denne undersøgelse gør, kunne også være en forklaring på forskellene i spektret, som vi har fundet. Resultaterne af vores undersøgelse omgående yderligere undersøgelser af de roller

HRAS

CDKN2A

i vulvacancer.

Afslutningsvis vi designet, valideret og anvendt en roman massespektrometri -baseret mutation panel til at identificere somatiske mutationer i en stor gruppe af gynækologiske maligniteter. Vi har vist, at denne nye panel er reproducerbar, high-throughput, og egnet til lav kvalitet og mængde DNA fra FFPE prøver. Vore data understøtter potentialet for somatisk mutation profiler som et redskab til at klassificere tumortyper i gynækologisk tarmkanalen. Desuden afslørede vores resultater, at PI3K-Akt signalvej er mest fremtrædende påvirkes i gynækologiske maligniteter, begrunder yderligere undersøgelse af

PI3K

/AKT /mTOR målrette behandlinger i gynækologisk onkologi.