Abstrakt
Introduktion
Upassende DNA methylering er ofte forbundet med menneskelig tumor udvikling, og i specifikke tilfælde, der er forbundet med de kliniske resultater. Tidligere rapporter DNA methylering i lav /mid non-muskel invasiv blærekræft (NMIBC) har foreslået, at specifikke mønstre af DNA methylering kan have en rolle som diagnostiske eller prognostiske biomarkører. I betragtning af den aggressive og klinisk uforudsigelige karakter af høj kvalitet (HG) NMIBC, og den nuværende mangel på den foretrukne behandlingsform (Bacillus: Calmette-Guerin), roman methylering analyser kan ligeledes afsløre biomarkører for sygdom resultat, som kunne risikere-stratificere patienter og vejlede kliniske behandling ved første diagnosticering.
Metoder
Promotor-associerede CpG ø methylering blev bestemt i primær tumor væv af 36 indledende præsentation high-grade NMIBCs, 12 lav /mellemliggende-grade NMIBCs og 3 normale blære kontroller. Generne
HoxA9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
blev udvalgt til undersøgelse på grundlag af tidligere rapporter og /eller prognostisk anvendelighed i lav /mellemliggende kvalitet NMIBC. Methylering blev bestemt ved Pyrosekventering natrium-bisulfit omdannede DNA, og derefter korreleret med genekspression anvendelse af RT-qPCR. Methylering blev desuden korreleret med tumor adfærd, herunder tumor recidiv og progression til muskel invasiv blærekræft eller metastaser.
Resultater
ISL1
gener ‘promotor-associeret øen var mere hyppigt methyleret i tilbagevendende og progressive high-grade tumorer end deres ikke-tilbagevendende modstykker (60,0%
vs
. 18,2%,
s
= 0,008).
ISL1
HoxA9
viste signifikant højere betyde methylering i tilbagevendende og progressive tumorer sammenlignet med ikke-tilbagevendende tumorer (43,3%
vs
. 20,9%,
p
= 0,016 og 34,5%
vs
17,6%,
s
= 0,017, henholdsvis). Samtidig
ISL1 /HoxA9
methylering i HG-NMIBC pålideligt forudsagt tumor recidiv og progression inden for et år (positiv prædiktiv værdi 91,7%), og var forbundet med sygdomsspecifikke dødelighed (DSM).
konklusioner
I denne undersøgelse vi rapporterer methylering forskelle og ligheder mellem de kliniske undertyper af høj kvalitet NMIBC. Vi rapporterer den potentielle evne til methylering biomarkører, ved første diagnose, til at forudsige tumor recidiv og progression inden for et år af diagnose. Vi fandt, at specifikke biomarkører pålideligt forudsige udfaldet sygdom og derfor kan hjælpe med at guide patienten behandling på trods af den uforudsigelige kliniske forløb og heterogenitet af high-grade NMIBC. Yderligere undersøgelser er påkrævet, herunder validering i en større patient kohorte, at bekræfte den kliniske anvendelighed af methylering biomarkører i høj kvalitet NMIBC
Henvisning:. Køkken MO, Bryan RT, Haworth KE, Emes RD, Luscombe C, Gommersall L, et al. (2015) Methylering af
HoxA9
ISL1
forudser Patient Outcome i High-Grade Non-Invasiv blærekræft. PLoS ONE 10 (9): e0137003. doi: 10,1371 /journal.pone.0137003
Redaktør: Bing-Hua Jiang, Thomas Jefferson University, UNITED STATES
Modtaget: Maj 14, 2015; Accepteret: August 11, 2015; Udgivet 2. september, 2015
Copyright: © 2015 Køkken et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af North Staffordshire Medical Institute, Research Awards udvalget, “Pump-Prime” Grant, og The University Hospital of North Midlands NHS Trust Cancer velgørenhedsfond. BCPP er finansieret af Cancer Research UK, University of Birmingham og Birmingham The Black Country og West Midlands Nord og Syd Omfattende Lokal Research Networks, og sponsoreret af University of Birmingham. Den BCPP biospecimen kollektionen er støttet af midler fra Birmingham Experimental Cancer Medicine Centre. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
High-grade non-muskel invasiv blærekræft (HG-NMIBC) er en klinisk vigtig sub-type blære overgangsordning celle karcinom (TCC), der tegner sig for 10-15% af alle TCC på præsentationen [1] .Den uforudsigelige HG-NMIBC med hensyn til tilbagefald og progression til invasiv eller metastatisk sygdom, præsenterer mange udfordringer for en vellykket forvaltning. Med ingen robuste metoder til forudsigelse resultater (recidiv, progression, Bacillus: Calmette-Guerin (BCG) manglende) ved første diagnosticering, patienter kan være under-behandlet med intravesikal terapi alene eller over-behandlet med øjeblikkelig cystektomi, begge med tilskrevet negative resultater patient [2,3].
Flere undersøgelser har beskrevet vigtigheden af epigenetiske ændringer i tumorigenese, oftest synlige som upassende DNA methylering inden genpromotor-associeret CpG-øer, og /eller ændringer, der fører til histon hale modifikation ( s) [4,5] .Disse modifikationer indvirkning på genekspression og fremme tumorigenese overvejende ved silencing af tumor-suppressor og /eller apoptotiske vej gener [5,6]. En sådan epigenetisk-medieret gen-nedregulering er blevet demonstreret i NMIBC og muskel-invasiv blærekræft (MIBC), og er rapporteret at være forbundet med tumor recidiv, progression, invasion, og metastase, men også tidlige begivenheder i tumor udvikling såsom “feltet -defect ‘fænomen [7,8]. Nylige undersøgelser fremhæve den potentielle kliniske anvendelighed af epigenetiske biomarkører i blærekræft, beskriver tumor, blod og urin DNA methylering markører af for eksempel NMIBC tilbagefald eller kemo-resistens i MIBC [9-11].
promotor associerede CpG Island methylering af
HoxA9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
gener er hyppige fund i blærekræft. I disse tilfælde synes methylering er forbundet med aggressive tumor egenskaber, og kan uafhængigt forudsige sygdomstilbagefald, progression, eller sygdomsspecifikke dødelighed (DSM) [9,12,13]. Men de fleste af disse rapporter undersøger heterogene kohorter, som omfatter overvejende lav /mellemliggende kvalitet NMIBC; høj kvalitet NMIBC ikke er blevet betragtet diskret for sygdom og /eller undertype specifikke epigenetiske modifikationer.
Vi vurderede en unik kohorte af patienter med HG-NMIBC for upassende promotor-associerede CpG Island methylering ved første præsentation og fjernelse af den primære tumor (er) i forhold til kendte prospektivt indsamlet etårige resultater af no-gentagelse, gentagelse og progression (til MIBC eller metastatisk sygdom), og i forhold til lav /mellemliggende kvalitet NMIBC. Identifikation upassende methylering ‘ved diagnose “af HG-NMIBC tilladt en foreløbig identifikation af nye og potentielt klinisk nyttige prognostiske biomarkører.
Materialer og metoder
Menneskelig vævsprøver
Den primære tumor og normal blære væv brugt blev leveret af blærekræft Prognose Programme (BCPP, Nottingham Research etiske komité: 05 /Q2404 /173) [14], University of Birmingham Menneskelige Biomaterials Resource Centre (National Research Ethics service (North West 5) : 09 /H1010 /75), og universitetshospitalerne i North Midlands NHS Trust (National Research Ethics service (South Central-Oxford C): 12 /SC /0725). Alle prøver blev opnået efter informeret skriftligt samtykke og under godkendelse af passende nationale etiske anmeldelse boards (referencenumre ovenstående). Alle prøver blev bekræftet histologisk; gentag trans-urethral resektion eller cystectomy blev udført, og /eller intravesikal terapi, forudsat, hvor foreslået af European Association of Urology retningslinjer [15]. Alle primære humane væv (tabel 1) blev opbevaret ved -80 ° C før nukleinsyreekstraktion.
DNA ekstraktion og bisulfit modifikation
Genomisk DNA blev ekstraheret fra tumor og kontrol væv anvendelse af en standard phenol-chloroform ekstraktion procedure [16] og efterfølgende bisulfit-modificeret som tidligere beskrevet [4]. Bisulfit konvertering af DNA blev bekræftet i alle tilfælde ved succesfuld PCR ved anvendelse af primere specifikke for en graensevaerdi-omdannet DNA (primersekvenser leveres i underbyggende oplysninger S1 Table). At øge den relative mængde og stabiliteten af bisulfit omdannede DNA blev hel-genom-amplifikation (WGA) udført som tidligere beskrevet [4] (beskrevet yderligere i underbyggende oplysninger S1 Text).
Pyrosequencing af bisulfit-konverterede DNA
CpG ø sekvenser blev identificeret fra UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/), og importeres til PyroMark Assay design 2.0 Software til primer design (Qiagen, Manchester, UK). Afhængig af hyppigheden og tætheden af CpG-dinukleotider inden for sekvensen af interesse, designede primere omfattede 4-7 på hinanden følgende CpG’er i hvert gen (primer sekvenser i S1 og en angivelse af genomisk placering i S2 tabel). Efter PCR-amplifikation af målsekvensen, blev Pyrosequencing udføres med en PyroMark Q24 Pyrosequencer hjælp PyroMark Q24 Software 2.0 og PyroMark Gold Q24 Reagenser (Qiagen), som tidligere beskrevet [17] (S1 Text).
Methylering var strengt defineret i tumorer som omfatter en gennemsnitshøjden af methylering tværs af de adspurgte på mere end fire standardafvigelser (4SD) over middelværdien i normale kontroller [4] CpG’er. Antallet af tumorer methylerede (af denne definition) for enhver given gen beskriver
frekvens
af methylering, mens den gennemsnitlige procentvise methylering af alle CpG’er adspurgte beskriver
betyder niveau
af methylering for en tumor i en bestemt gen.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA blev ekstraheret fra kontrol- og tumorprøver ved hjælp af en standard guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-protokol [16], og komplementær DNA syntetiseret som beskrevet tidligere [18] .Thermal cykling hjælp SYBR (III) Green blev som tidligere beskrevet [19], med målgener normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (
GAPDH
) (S1 tabel) som endogen kontrol (S1 Tekst). Relativ kvantificering af transkript-ekspression blev udført ved anvendelse af 2
-ΔΔ cyklus tærskel (CT) metoden [20]. Reduceret udskrift udtryk i hver tumor blev betragtet signifikant, hvis lavere end en 3 gange reduktion i forhold til at betyde udtryk i kontrolprøver det modsatte var tilfældet for øget udskrift udtryk [18] (S1 Text).
Informatik og statistik
Microsoft Excel 2010 og STATA (v8, Stata Corporation, TX) blev anvendt til at udføre Fishers eksakte , Studerende ‘t, og log-rank analyser, og følsomhed, specificitet og positive og negative prædiktive værdier af methylering med hensyn til kliniske resultater.
resultater
Hyppigheden af methylering inden lav /mellemliggende – og høj kvalitet NMIBC
Vi oprindeligt bestemt status methylering af de seks kandidatgener i høj- og lav /mellemliggende-grade tumor kohorter af Pyrosequence analyser af bisulfit-konverterede DNA. Upassende methylering af promoter-associeret CpG øer (S2 tabel) var en hyppig fund i begge kohorter for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
gener i forhold til normal blære (tabel 2).
tabel 2 viser, at methylering frekvens i lav /mellemliggende-grade tumorer var lavere for
ISL1
end for alle andre gener undersøges (2/12 tumorer; 16,7%), skønt ved sammenligning, methylering frekvens forhøjes inden HG tumorer (17/36, 45,0%,
s
= 0,091). Omvendt hyppigheden af methylering var lavere i HG-NMIBCs for
HoxA9
(20/36; 55,6%) sammenlignet med lav /mellemliggende-grade tumorer (10/12, 83,3%,
s
= 0,167); (Data opsummeret i tabel 2).
For yderligere at undersøge mulige årsager til de observerede forskelle i frekvensen af methylering mellem høj- og lav /mellemliggende-grade tumor kohorter for specifikke gener, vi bestemt gen-specifikke methylering frekvenser i forhold til de kliniske karakteristika af HG tumorer, der omfatter etårige kliniske resultater af no-gentagelse, gentagelse, og progression.
for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
, methylering frekvenser i tilbagefald og progression tumorer var marginalt større end deres ikke-tilbagefald modstykker, og var generelt stort set til de frekvenser, tilsyneladende i lav /mellemliggende kvalitet tumorer (figur 1).
fra venstre mod højre, tumor kohorte methylering frekvens /andel, som bestemt ved pyrosekventering inden
HoxA9
,
ISL1
,
SPAG6
,
NKX6-2
,
ZIC1
og
ZNF154
, for den lave /Intermediate-grade kohorte (LG), no-recidiv (nR) og tilbagefald og progression tumorer (R + P) hhv. De fyldte søjler repræsenterer andelen af methylerede tumorer i forhold til kontroller i hvert enkelt tilfælde. Forskelle mellem frekvenserne af methylering er angivet som statistisk signifikant ved ‘*’, hvor
s
0,05, som bestemt ved Fishers eksakte eller Chi-squared test (to-halet). Methylering blev defineret som beskrevet i de materialer og metoder.
HoxA9
viste en tilsvarende øget methylering frekvens i tilbagefald og progression tumorer i forhold til deres ikke-tilbagefald modstykker, men som vist i figur 1, methylering frekvens på ingen-tilbagefald tumorer var signifikant lavere sammenlignet med den observeret i lav /mellemliggende-grade tumorer (
s
= 0,036). Selvom udviklingen i en stigning i methylering frekvens i recidiv og progression (i forhold til ingen gentagelse) tumorer var tydelig for alle de undersøgte gener, dette var tydelige mere markant for
ISL1
gen. I dette tilfælde, methylering frekvens var signifikant større i tilbagefald og progression tumorer i forhold til no-recidiv (15/25 (60,0%)
vs
2/11 (18,2%),
s
= 0,031), og også til deres lave /mellemliggende-grade modstykker (15/25 (60,0%)
vs
2/12 (16,7%),
s
= 0,017) (figur 1) .
Mean methylering niveauer inden lav /mellem- og høj kvalitet NMIBC
Vores methylering analyser viste også betydelige forskelle i og mellem middelværdien og vifte af methylering niveauer inden for de enkelte tumorer (fig 2). Derfor vil der ud over de ovenfor beskrevne analyser, vi vurderet også betyde methylering niveauer i HG og lav /mellemliggende kvalitet kohorter og inden for HG tumor undertyper, at afgøre, om niveauet af methylering viste noget forhold til kliniske karakteristika.
Paneler (a) til (f), der repræsenterer
HoxA9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
ZNF154
hhv. Hvert panel viser individuelle tumor methylering værdier, som bestemt af Pyrosekventering, repræsenteret ved grå cirkler inden kontrol (c), lav /Intermediate-grade (LG), no-recidiv (NR) og recidiv og progression (R + P) tumor grupper. De solide vandrette bjælker repræsenterer det samlede gennemsnit methylering inden for hver kontrol eller tumor gruppe; forskelle mellem midlerne er angivet som statistisk signifikant ved ‘*’, hvor
s
0,05 bestemt af Studerende-t test. Den dobbelt-pil repræsenterer cut-off punkt, hvorover tumorer defineres som methylerede forhold til normale blære kontrol.
Det gennemsnitlige niveau af methylering var større, omend ikke væsentligt, i HG i forhold til deres lav /mellemliggende-grade modstykker til
ISL1
,
SPAG6
,
NKX6-2
,
og ZNF154
gener (Tabel 2). Denne stigning nærmede betydning for
ISL1
(22,1% vs. 36,5%,
s
= 0,061). Paradoksalt nok, det gennemsnitlige niveau af methylering for
HoxA9
var lavere i HG i forhold til deres lave /mellemliggende-grade modstykker, igen nærmer betydning (29,3% vs. 44,0%,
s
= 0,057) ( tabel 2).
med denne fremgangsmåde, har vi også bestemt genspecifikke methylering niveauer i HG tumorer og i forhold til deres kliniske resultater. Mean methylering niveauer inden
ISL1
HoxA9
var signifikant højere i tilbagefald og progression tumorer i forhold til deres ikke-tilbagefald modstykker (43,3% vs. 20,9%,
s
= 0,016 og 34,5% versus 17,6%,
s
= 0,017, henholdsvis) (figur 2). Den gennemsnitlige methylering niveau stigning fra no-gentagelse til gentagelse og progression tumorer var ikke signifikant for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
korrelation af methylering inden kliniske resultater af høj kvalitet NMIBC
Vi næste bestemmes sammenhængen mellem genspecifikke methylering med kliniske resultater inden for HG tumor kohorte.;
HoxA9
ISL1
blev vurderet som den eneste gener, der viser en signifikant forskel i frekvens eller grad af methylering.
HoxA9
promotor methylering viste 72,7% specificitet og en 84,2% positiv prædiktiv værdi (PPV) for tumor tilbagefald og /eller progression inden for et år af første diagnose, mens methylering i
ISL1
promotor demonstreret specificitet på 81,8% og PPV 87,5% for de samme kliniske resultater, vist i tabel 3. Endvidere samtidig methylering af
HoxA9
ISL1
ved første diagnosticering forudsagt etårig tilbagefald og /eller progression, med en PPV på 91,7%, samtidig med at en specificitet på 90,9%. Til nøjere vurdere association mellem disse potentielle biomarkører og resultatet sygdom, vi ansat logistiske regressionsanalyse. Tabel 3 viser, at når de betragtes individuelt, methylering af enten
HoxA9
eller
ISL1
opnået statistisk signifikans med tumor tilbagefald og /eller progression (
s
= 0,050 og
p
= 0,047 henholdsvis). Men i kombination, mens biomarkører var mindre signifikant associeret med udfald sygdom (
s
= 0,067), demonstrerede de en stærkere odds ratio af tumor tilbagefald og /eller progression end når enten blev betragtet særskilt (7,86 vs 4,74 og 5,73, henholdsvis)
Ud over tumor adfærd, vi også overvejet promotor methylering som en indikator for sygdomsspecifik dødelighed:. i dette tilfælde,
HoxA9
promotor methylering viste 57,1% specificitet og en 70,6% negativ prædiktiv værdi (NPV) for sygdomsspecifikke dødelighed, mens
ISL1
methylering foreslog 57,1% og 60,0% for disse resultatmål.
methylering-associerede ændringer i genekspression i high-grade NMIBC
Kvantitativ RT-PCR blev anvendt til at evaluere associationer mellem methylering og genekspression i fire af de seks gener i en undergruppe af 10-14 tumorer i sammenligning med kontroller. Figur 3 viser, at i forhold til kontroller, 90,1% (29 af 32) methylerede tumorer viser reduceret transcript ekspression, og 75,0% (24 af 32) udviser signifikant reduceret ekspression. Omvendt 56,3% (9 af 16) methylerede tumorer viste ekspressionsniveauerne ligner, eller i nogle tilfælde højere end, at tilsyneladende i kontrol.
Kvantitativ RT-PCR-analyser af
HoxA9
,
ISL1
,
SPAG6
ZNF154
udskrift udtryk i individuelle high-grade tumorer (HG). Ekspression er rapporteret i forhold til gennemsnittet af tre normale blære kontrol (C, trekanter), hvis gennemsnitlige værdi udtrykkes som lig med 100%. Udfyldte og ikke-udfyldte cirkler betegner methylerede eller ikke-methylerede tumorer, og repræsenterer middelværdien fra to uafhængige forsøg udført tredobbelt. De vandrette bjælker i kontrolområdet kolonne repræsenterer gennemsnittet af kontrollerne, en 3 gange reduktion under dette ligger den dobbelte pil i hvert gen plot, der repræsenterer cut-off for væsentligt reduceret ekspression i tumorer i forhold til kontrol.
diskussion
epigenomic landskab for blærekræft er et område af stigende forskningsmæssig interesse [21], specielt i relation til at identificere klinisk levedygtige biomarkører. På grund af de nuværende begrænsninger i at forudsige de forskellige kliniske resultater observeret i HG-NMIBC og den nuværende BCG mangel, biomarkører, der vejleder kliniske beslutninger er af særlig betydning [22,23]. Som beskrevet ovenfor vores analyser viste hyppige, og i nogle tilfælde differential methylering, til stede ved første HG-NMIBC diagnose, som syntes at korrelere med tumor egenskaber og kliniske parametre.
De seks gener udvalgt til analyser er overvejende medlemmer af transkriptionsfaktor-familier, primært regulerer gen-ekspression, enzym-bindende, og celledifferentiering [24]. Deres valg til analyser var på grundlag af deres hyppige uhensigtsmæssig methylering i blærekræft [9,12,13,25]. I tidligere rapporter,
HoxA9
ZNF154
methylering er blevet forbundet med tumor tilbagefald, og
ISL1
methylering med tumor progression i overvejende lav /mellemliggende-grade tumorer [9, 13].
Vores indledende analyser viste lignende methylering frekvenser i lav /mellem- og HG-NMIBC for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
. I disse tilfælde methylering frekvenser lignede dem tidligere rapporteret i litteraturen [9,12,13,25]. Men en forskel i hyppigheden af methylering var tydelig mellem de lave /mellemrunder og HG-NMIBC kohorter for
HoxA9
og
ISL1
gener: selv om methylering hyppigheden af
HoxA9
promotor i lav /mellemprodukt-grade tumorer var den samme som tidligere beskrevet i litteraturen [12,13], blev det konstateret ved markant lavere frekvens i HG-NMIBC. Omvendt for
ISL1
, methylering frekvens i lav /mellemliggende-grade tumorer var lavere end tidligere beskrevet af andre [13]; dog methylering frekvens stigning, der er tydelig i de tilbagefald og progression tumorer er mere i overensstemmelse med disse rapporter.
Den differentierede methylering frekvens i
HoxA9
ISL1
kan vedrøre til flere confoundere, herunder metoden i denne undersøgelse anvendes til at definere tumor methylering, og de relativt få lav /mellemprodukt-grade tumorer til analyser. Men overensstemmelsen mellem vores methylering data og dem rapporteret af andre for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
, bekræfter, at robusthed i vores tilgang. På dette grundlag, vi ræsonnerede, at forskellene i methylering frekvens observeret for
HoxA9
ISL1
kan være konsekvent til forskellige kliniske karakteristika og /eller resultater inden for vores HG tumor kohorte; et fænomen ligeledes beskrevet i for eksempel bryst-, colon- og hypofysetumorer [4,26,27]. Vi udførte derfor HG-NMIBC undertype analyser og fandt, at methylering profiler af tilbagefald og progression tumorer, selv om det ligner hinanden, var for det meste helt adskilt fra deres ikke-tilbagefald modstykker; på dette grundlag, vi grupperet tilbagefald og progression tumorer for analyser
methylering frekvens i tilbagefald og progression tumorer var konsekvent højere på tværs af alle seks gener i forhold til deres ikke-tilbagefald modstykker.; disse forskelle blev mest udtalt for
HoxA9
ISL1
og opnået statistisk signifikans for
ISL1
. Paradoksalt nok, i
HoxA9
, ingen tilbagefald, tilbagefald og progression tumorer var mindre hyppigt methylerede end i deres lav /mellemliggende kvalitet tumor modstykker. Selvom årsagerne til dette er uklare, kan mulige forklaringer vedrører nummer, eller heterogenitet, af tumorer undersøgt, om vi ikke kan udelukke, at der er epigenetiske forskelle i bestemte gener mellem lav /mellem- og høj kvalitet tumorer. Omvendt methylering frekvens i tilbagefald og progression tumorer i
ISL1
var markant større end i deres lav /mellemliggende kvalitet modstykker. Lignende forklaringer til dem, der er beskrevet for
HoxA9
kunne redegøre for disse observationer.
Gennem kvantitative Pyrosequence analyser, vi bestemt gennemsnitlig methylering tværs af flere CpG sites der viser, at yderligere til methylering frekvens forskelle, der eksisterer forskelle i methylering niveauer mellem tumor kohorter for bestemte gener. Konkret forskelle i gennemsnitlige methylering niveauer mellem lav /mellem- og HG tumorer, og også mellem nej-gentagelse, og deres tilbagefald og progression tumor modparter, analogt med observationer rapporteret af andre i bryst og tyktarmskræft undertyper [26,27 ]. For både
HoxA9
ISL1
, var der en signifikant stigning i den gennemsnitlige niveau af methylering i tilbagefald og progression tumorer i forhold til deres ikke-tilbagefald modstykker.
observerede forskelle i methylering frekvens og betyde methylering niveau mellem disse klinisk divergerende undergrupper, tyder på, at hyppigheden og /eller betyde niveau af methylering stiger med tumor aggressivitet. Lignende tendenser er blevet rapporteret i andre tumortyper [26,27], og dette menes at repræsentere ophobning af epigenetiske afvigelser over tid, svarende til akkumulering af genetiske mutationer og genomisk instabilitet tilsyneladende under tumorprogression [28].
Da vores resultater støtter tidligere sammenslutninger af
HoxA9
ISL1
methylering med tumor egenskaber og opførsel [9,13], vi vurderet potentielle kliniske korrelater til
HoxA9
ISL1
methylering, herunder deres prognostisk potentiale. I vores HG-NMIBC kohorte,
HoxA9
eller
ISL1
methylering ved første diagnosticering pålideligt forudsagt tumor recidiv eller progression inden for et år. I denne sammenhæng, samtidig methylering af både
HoxA9
ISL1
forbedret den positive prædiktive værdi til 91,7%, sammenligner positivt med andre postulerede biomarkører for tilbagevendende /progressiv sygdom i NMIBC [13,29] . Desuden logistisk regression syntes at bekræfte, at disse resultater ikke var deraf til methylering i et enkelt gen. Endvidere og som beskrevet tidligere [9,13], samtidig methylering i
HoxA9
ISL1
var forbundet med DSM og reduceret samlet overlevelse, men dette ikke nåede statistisk signifikans. I den forbindelse anerkender vi, at antallet af tumorer til rådighed for undersøgelse og i mangel af lignende rapporter, at de foreninger, vi rapporterer mellem uhensigtsmæssig methylering og HG-NMIBC sygdom resultat vil kræve validering i større, uafhængige tumor kohorter.
Endelig, for at afsløre potentiel funktionel relevans af methylering inden high-grade sygdom, vurderede vi forholdet mellem methylering og genekspression; på tværs af de fire gener undersøgt, fandt vi en sammenslutning af unormal methylering med reduceret udskrift udtryk, i overensstemmelse med resultater fra andre grupper [9,13]. Disse resultater var ikke signifikant, muligvis i forbindelse med antallet af tumorer studeret, eller passageren /driver fænomen, hvorved epigenetiske mærker kan være til stede, men ikke som forårsager ændret genekspression [30].
Disse resultater er den første til at rapport ligheder og forskelle i gen-associerede methylering i HG-NMIBC forhold til lav /mellemliggende-grade tumorer. Vi har desuden vist, at bestemte methyleringsmønstre ved første diagnose forudsige etårige HG-NMIBC kliniske resultater, der peger på den spændende potentiale for methylering som prognostisk biomarkør i dette klinisk uforudsigelig sygdom. Yderligere undersøgelser udnytter genom-dækkende array-analyser er forpligtet til yderligere at karakterisere epigenetiske forskelle og ligheder mellem lav /mellemliggende-og HG-NMIBC, og at afsløre biomarkører, der kan tjene som terapeutiske mål eller vejlede klinisk ledelse, såsom timing, dosis og længden af BCG-behandling, eller tidspunktet for cystektomi.
Støtte Information
S1 Table. . Primer table
Liste over bisulfit-konverterede PCR primere, Pyrosequencing (sekventering) primere, og RT-qPCR primere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137003.s001
(DOCX)
S2 Tabel. CpG island information
Tabel notering den genomiske placering af promotor-associerede CpG øområder vurderede for hvert af de seks gener
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0137003.s002
(DOCX)
S3 Table. . Rå datafil
Excel regneark, der indeholder middelværdier for Pyrosekventering og RT-qPCR data
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137003.s003
(XLSX)
S1 tekst. . Supplerende materialer og metoder
Yderligere beskrivelse af vævsprøver primære, og yderligere beskrivelse af DNA-ekstraktion, natriumbisulfit-konvertering, Pyrosequencing, RNA ekstraktion og RT-qPCR procedurer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137003. S004
(DOCX)
tak
Vi vil gerne takke alle West Midlands Consultant Urologer og deres enheder, der er involveret med BCPP, samt BCPP forskning sygeplejersker og Margaret Grant, Deborah Bird, Jennifer Barnwell, Duncan Nekeman og Eline van Roekel.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.