PLoS ONE: Identifikation og vurdering af plasma MikroRNA’er for tidlig opdagelse af tyk- Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret kræft. Cirkulerende microRNA (miRNA) er blevet foreslået som potentielt lovende markører til tidlig diagnose af CRC. Vi havde til formål at identificere og evaluere et panel af miRNA, der kunne være egnet til CRC tidlig opdagelse.

Metoder

miRNA blev profileret af TaqMan MicroRNA Array og screenet for differentiel ekspression i 5 puljer af plasmaprøver af CRC patienter (N = 50) og 5 puljer af neoplasme-fri kontrol (N = 50). Yderligere miRNA blev udvalgt fra en litteraturgennemgang. Identificerede kandidater blev evalueret i uafhængig validering prøver med hensyn til diskrimination af CRC patienter (n = 80) eller avancerede adenom patienter (N = 50) og neoplasme-fri kontrol (N = 194). Diagnostisk ydeevne panel af miRNA blev vurderet ved multipel logistisk regression, ved hjælp af bootstrap analyse til at korrigere for over-optimisme.

Resultater

Fem miRNA identificeret til at være forskelligt udtrykt fra TaqMan MicroRNA Array (miR -29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p), og syv miRNA indberettet som udtrykkes forskelligt i litteraturen (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145 , -181b) blev udvalgt til validering. Ni af de tolv miRNA (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) viste sig at være udtrykkes forskelligt i CRC patienter og kontroller i validerings- prøver. Optimismen korrigeret areal under kurven var 0,745 (95% konfidensinterval: 0,708-0,846). Ingen af ​​de udvalgte miRNA viste signifikant forskellig ekspression mellem avancerede adenom patienter og neoplasme-fri kontrol.

Konklusion

Den identificerede panel af miRNA kunne være af potentiel anvendelse i udviklingen af ​​en multi-markør blod baseret test til tidlig opdagelse af CRC. Virkning: Undersøgelsen understreger det store potentiale af plasma miRNA til forbedring af aktuelle tilbud af ikke-invasiv CRC screening

Henvisning:. Luo X, Stock C, Burwinkel B, Brenner H (2013) Identifikation og vurdering af Plasma MikroRNA’er til tidlig opdagelse af tyktarmskræft. PLoS ONE 8 (5): e62880. doi: 10,1371 /journal.pone.0062880

Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italien

Modtaget: December 22, 2012; Accepteret: 26 marts 2013; Udgivet: May 14, 2013 |

Copyright: © 2013 Luo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med over 1,2 millioner nye tilfælde og 608,700 dødsfald pr år, kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden hos kvinder, og den fjerde mest almindelige dødsårsag af kræft på verdensplan [1]. På grund af sin typisk meget langsom udvikling over mange år, perspektiver for tidlig påvisning er meget bedre end for mange andre former for kræft. Det skønnes, at over 95% af tilfældene af CRC ville drage fordel af helbredende kirurgi, hvis diagnose blev foretaget på et tidligt eller præmaligne polyp fase [2], [3]. En række afsløring procedurer tidlige er blevet udviklet og er i stigende grad anvendes, herunder endoskopiske undersøgelser, stool- og blod-baserede tests. Blod tests synes at være særligt attraktive, da de er minimalt invasiv og måtte modtage høje niveauer af vedhæftning, når den anvendes som primær screeningstest i befolkningen baseret screening. Et stort antal blodmarkører er blevet foreslået og evalueret, herunder protein, cytologiske, mRNA, og DNA-markører [4], [5], men diagnostiske resultater har mest været utilstrækkelig til anvendelse som et vigtigt værktøj i befolkningen-baserede screening. Desuden har de fleste undersøgelser påberåbes små convenience prøver fra kliniske indstillinger og temmelig lovende resultater fra små undersøgelser har ofte ikke replikeres i efterfølgende skala valideringer større.

MikroRNA’er (miRNA) er 18~22 nukleotid ikke-kodende RNA at post-transkriptionelt regulere genekspression og styre forskellige cellulære mekanismer [6]. Der er stigende tegn på, at miRNA er almindeligt dysreguleret i kræft og kan have potentiale ansøgning om kræft diagnose, prognose og behandling [7]. Endvidere har seneste udvikling af miRNA microarrays foretaget store profilering undersøgelser i kræftpatienter muligt.

Stabiliteten af ​​cellefrie miRNA i kropsvæsker muliggør cirkulerende miRNA at være potentielle biomarkører for invasiv diagnose af kræft og andre sygdomme [8 ]. Adskillige nyere undersøgelser fundet nogle cirkulerende miRNA, såsom MIR-29a, MIR-92a og MIR-221, der skal udtrykkes forskelligt i CRC patienter og derfor at være af potentiel anvendelse som ikke-invasive biomarkører for CRC-screening [9] – [11 ].

Formålet med denne undersøgelse var at identificere og evaluere et panel af plasma miRNA, der kan tjene som biomarkører for tidlig påvisning af CRC.

Materialer og metoder

undersøgelse design og undersøgelsespopulationen

sager med sporadisk CRC blev rekrutteret før initiering af behandlingen på University Clinic of Heidelberg i forbindelse med Dachs + undersøgelsen, som er en satellit undersøgelse Dachs, en løbende case-kontrol undersøgelse gennemført i Rhein-Neckar-regionen i Tyskland [12], [13].

Patienter med avancerede kolorektale adenomer og kontroller fri for kolorektale neoplasmer blev tilfældigt udvalgt af deltagere fra screening koloskopi rekrutteret i BLITZ studiet, en løbende undersøgelse designet til at vurdere hidtil ukendte lovende markører til tidlig diagnose af CRC og tidligere beskrevet detaljeret andetsteds [14] – [16]. Kort fortalt blev patienterne rekrutteret, og blodprøver blev taget ved gastroenterologer kontorer på et forberedende besøg, typisk omkring en uge før screening koloskopi.

Både Dachs + og BLITZ undersøgelsen blev godkendt af de etiske komitéer i Medicinske Fakultet ved universitetet i Heidelberg og de medicinske bestyrelsen i Baden-Wuerttemberg og Rheinland-Pfalz. . Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager

Vores undersøgelse omfattede to hovedfaser, en markør identifikation fase og en markør valideringsfase:

I markør identifikation fase, lovende miRNA blev screenet ved TaqMan MicroRNA Array i poolede plasma prøver fra 50 CRC patienter og 50 neoplasme-fri kontrol, ved hjælp af fem puljer af plasmaprøver fra ti CRC patienter hver, og fem puljer af plasmaprøver fra ti neoplasme-fri kontrol hver. Desuden beskrev syv miRNA skal udtrykkes forskelligt i CRC sager og kontroller i tidligere publikationer blev identificeret fra en systematisk litteraturgennemgang (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145, -181b) [17 ].

i markør valideringsfasen blev udtryk af de identificerede miRNA evalueret i uafhængige prøver af (i) 80 CRC tilfælde og 144 kontroller fri for kolorektale neoplasmer og (ii) 50 patienter med fremskredne adenomer og 50 kontroller fri for kolorektale neoplasmer.

laboratorieprocedurer

(i) Prøveforberedelse og RNA-ekstraktion.

Blodprøverne blev opsamlet i EDTA-rør. Blodprøver fra kræftpatienter blev taget før operation eller anden behandling, og blodprøver fra deltagere, som gennemgik screening koloskopi blev taget før koloskopi. Blodprøverne blev centrifugeret ved 2123g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev overført til nye rør. Plasmaprøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Total RNA indeholder små RNA blev ekstraheret fra 200 pi (prøver, der anvendes i identifikationen fase) eller 115 pi (prøver, der anvendes i valideringsfasen) plasma ved hjælp af en kombination af Trizol LS-reagens (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) og miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) samt 5 fmol /pl cel-mIR-39 som eksternt præparat kontrol som beskrevet tidligere [18]. Prøver blev elueret i et endeligt volumen på 30 pi.

(ii) MicroRNA profilering fra plasmaprøver.

Profilering blev udført ved hjælp af TaqMan MicroRNA Array (Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA) som muliggør kvantificering af 667 humane microRNA. (tabel S1) Megaplex revers transkriptionsreaktion og præ-amplifikationsreaktion udføres af G-Storm GS2 Thermal Cycler (G-Storm, UK). Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført under anvendelse 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Tærskelcyklen (Ct) defineres som det antal cyklusser, der kræves for det fluorescerende signal at krydse grænsen i QRT-PCR. Raw Ct-værdier blev beregnet under anvendelse af SDS softwareversion 2.2 anvendelse automatiske baseline indstillinger og en tærskel på 0,1 blev indstillet. Kun miRNA hvis Ct-værdi var lig med eller under 33 i det mindste enten sagen eller kontrolgruppen blev taget hensyn til yderligere analyse af data. Data normalisering blev udført som beskrevet af Kroh et al. [19].

(iii) Real time kvantitativ PCR-verifikation.

Valgte miRNA blev målt ved anvendelse TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems) ifølge producentens protokol. Triplikater af QRT-PCR af hver prøve blev udført ved anvendelse LightCycler 480 Real-time PCR-system (Roche Applied Science, Tyskland). ACt blev beregnet ved at fratrække de Ct-værdier for intern kontrol fra Ct-værdier for miRNA af interesse, og betyde ACt værdier blev sammenlignet mellem cases og kontroller. Multiplex analyser blev udført ved hjælp af foruddefinerede puljer af RT-primere (tabel S2). Effektiviteten af ​​de enkelte miRNA s assay blev bestemt ved at konstruere en standardkurve under anvendelse af en række af total RNA fortyndinger. Alle analyser viste god linearitet (R

2 0,96) mellem Ct-værdier og log over start- mængde af total RNA af hver fortynding (data ikke vist)

Statistiske Analyser

mirna ekspressionsniveauer blev sammenlignet mellem CRC patienter og neoplasme-fri kontrol og mellem avancerede adenom patienter og neoplasme-fri kontroller under anvendelse af Wilcoxon-Mann-Whitney-test (herefter: Wilcoxon test). Sammenligning af miRNA ekspressionsniveauer mellem CRC patienter og neoplasme-fri kontrol i markør identifikationsfasen blev udført ved anvendelse af præcise version af Wilcoxon-testen. Alle tests var to-sidede og P-værdier på 0,05 eller mindre blev betragtet som statistisk signifikant.

Multipel logistisk regression blev anvendt til at vurdere fælles anvendelse af den identificerede panel af miRNA forudsige CRC i markør valideringsfasen . Receiver opererer karakteristiske (ROC) kurver blev bygget og områder under ROC kurver (AUC) blev beregnet både fra ukorrigeret (tilsyneladende) og justeres ( “optimisme-korrigeret”) anslår at vurdere diskrimination af forudsigelsen model mellem patienter med og uden CRC. The.632 + bootstrap metode (med 1000 gentagelser) blev anvendt til at justere for overfitting af den tilsyneladende misklassifikation fejl og overvurdering af AUC af de ikke-justerede estimater [20], [21]. 95% konfidensintervaller (CI) for de justerede og ujusterede skøn blev opnået ved almindelige bootstrap analyser (med 1000 gentagelser).

Korrelationen af ​​plasma miRNA ekspressionsniveauerne tværs af de 324 deltagere i valideringsfasen blev vurderet ved Spearman korrelationskoefficienter.

SAS-version 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) blev anvendt til at udføre Wilcoxon test og R-version 2.15.0 (R Foundation for Statistisk Computing, Wien, Østrig) blev anvendt at udføre alle andre analyser. De R-pakker “Daim” og “boot” var ansat til at udføre bootstrap analyser [22], [23].

Resultater

Undersøgelse Befolkning

I alt 424 individer blev inkluderet (130 CRC patienter, 50 avancerede adenom patienter og 244 neoplasme-fri kontroller) i undersøgelsen. Demografiske karakteristika af undersøgelsespopulationen og distribution af tumor stadier er opsummeret for markøren identifikation fase og markøren valideringsfasen i tabel 1.

Identifikation af differentielt udtrykte miRNA i CRC Patienter og Neoplasma-fri Controls

i microarray analyser, fem miRNA fandtes at være statistisk signifikant overudtrykt i plasmaet fra CRC patienter sammenlignet med neoplasme-fri kontrol (mIR-29a: p = 0,016, mIR-106b: p = 0,008, miR -133a: p = 0,032, miR-342-3p: p = 0,008, miR-532-3p: p = 0,016, eksakt Wilcoxon test)

Evaluering af intern kontrol for Real Time kvantitativ PCR

.

i vores microarray data, vi observeret nogen signifikant forskel i forhold til de Ct-værdier for miR-188-5p (p = 0,83, Wilcoxon test) og miR-16 (p = 0,40, Wilcoxon test) mellem CRC og neoplasma-fri kontroller. RNU6B og miR-16 har været de mest udbredte endogene kontrol miRNA for QRT-PCR i miRNA undersøgelser [8]. Derfor blev de nævnte tre miRNA betragtes som interne kontroller for miRNA kvantificering. Imidlertid ekspressionsniveauer af RNU6B og MIR-188-5p i plasmaet var for lav til at blive kvantificeret ved TaqMan MicroRNA Assay (gennemsnitlig Ct-værdier var større end 35). Derfor blev miR-16 valgt som intern kontrol, som det viste høj overflod og mindre variation i udtrykket. Ingen signifikant forskel blev observeret i form af Ct-værdier for miR-16 (p = 0,40, Wilcoxon test) mellem CRC og neoplasme-fri prøver.

Validering i en uafhængig Prøve på CRC Patienter og Neoplasma-fri Controls

for at bekræfte de fem miRNA (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) identificeret i microarray analyse og yderligere syv miRNA (miR-18a, -20a, -21 , -92a, -143, -145, -181b), som tidligere blev rapporteret at være udtrykkes forskelligt i CRC (undtagen miR-92a, var de alle fra undersøgelser baseret på vævsprøver) [17], QRT-PCR blev udført for at analysere udtryk for de valgte miRNA i vores validering sæt (224 plasmaprøver i alt fra 80 CRC patienter og 144 neoplasme-fri kontroller).

(i) Angivelse af miRNA.

Ni miRNA ( mIR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) viste højere ekspression i plasmaet fra CRC patienter end i neoplasme-fri kontrol (mIR-18a: p 0,0001, mIR-20a: p = 0,001, mIR-21: p 0,0001, mIR-29a: p = 0,001, mIR-92a: p = 0,004, mIR-106b: p = 0,028, mIR-133a: p = 0,0002, miR-143 0,0001, miR-145: p = 0,0004, Wilcoxon test). Nr miRNA viste sig at være nedreguleret. De tilsvarende udtryk i plasma af CRC patienter og neoplasme-fri kontrol (normaliseret til miR-16) er vist i figur 1.

Kassegrafer med mindste observation, lavere kvartil, median, øvre kvartil og største observation er vist. De whiskers udvides til de bemærkninger, der ikke mere end 1,5 gange længden af ​​kassen (interkvartile område) væk fra kassen. Mere ekstreme observationer betragtes vildskud. P-værdier er baseret på Wilcoxon test.

(ii) Forholdet mellem miRNA og klinisk-patologiske funktioner i CRC patienter.

Vi undersøgte sammenhængen mellem miRNA ekspressionsniveauerne og nogle klinisk-patologiske træk. MIR-181b udtryk niveau var højere hos patienter med lymfeknudemetastaser end hos patienter uden lymfeknudemetastaser (p = 0,024, Wilcoxon test). Ingen af ​​miRNA viste nogen sammenhæng med tumor eller tumor stadie. Ligeledes blev der ikke foreninger set med alderen, hverken i tilfælde heller ikke i neoplasme-fri kontrol (data ikke vist).

For at vurdere, om ekspressionsniveauerne af de undersøgte miRNA er forbundet med udviklingen af ​​CRC, var patienterne stratificeret efter AJCC etaper. Generelt ekspressionsniveauer var meget ens i tidlige og sene fase kræftformer. MIR-18a, 20a, 21, 29a, 133a, 143 og 145 blev fundet at være overudtrykt i plasma fra CRC patienter med tidlige stadier sammenlignet med neoplasme-fri kontrol. MIR-18a, -20a, -21, -92a, -133a, -143, -145 og -181b viste højere ekspressionsniveauer i plasma af CRC patienter på sene stadier i forhold til neoplasme-fri kontrol. MIR-181b viste højere udtryk i plasmaet af sene stadie CRC patienter end tidlige stadie CRC patienter (Tabel 2).

(iii) Multivariat analyse.

Med panel af 12 miRNA (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p, -532-3p), ROC-analyser givet ukorrigeret AUC af 0,803 (95% CI: 0,774-0,888) og et justeret, dvs. optimisme-korrigeret, AUC på 0,745 (95% CI: 0,708-0,846). ROC kurver er afbildet i figur 2. For hvert miRNA, er ROC kurver afbildet i fig S1.

Korrektion for over-optimisme blev gjort ved the.632 + bootstrap metode. Forkortelser:. AUC, areal under modtager opererer kurve

Angivelse af miRNA i Advanced adenom Patienter og Neoplasma-fri Controls

Avancerede kolorektale adenomer repræsenterer en forløber etape af CRC. For at vurdere potentiel anvendelse til tidlig opdagelse af selv avancerede adenomer blev de identificerede 12 miRNA bestemt af QRT-PCR i plasmaprøver fra 100 undersøgelsens deltagere (50 med avanceret adenom og 50 neoplasme-fri kontroller). blev ikke observeret nogen statistisk signifikante forskelle i miRNA ekspressionsniveauerne i plasmaet af avancerede adenom patienter og neoplasme-fri kontrol.

Korrelationer udtryksformer Niveauer af plasma miRNA

Blandt deltagerne i valideringsfasen, stærk korrelationer blev observeret mellem ekspressionsniveauer af mIR-18a og mIR-20a (r = 0,800, p 0,001), som begge kodes i mIR-17-92 klynge; MIR-143 og MIR-145 (r = 0,762, p 0,001), som begge er indkodet i miR-143/145 klynge; og miR-29a og miR-106b (r = 0,694, p 0,001), to nært bosiddende miRNA på kromosom 7q. Ekspressionsniveauerne for nogle andre miRNA som ikke placeres sammen i genomet blev også stærkt korreleret. På den anden side blev MIR-92a, som også er kodet i MIR-17-92 klynge ikke stærkt korreleret med MIR-18a eller MIR-20a (r = 0,340 og 0,251 henholdsvis) (tabel S3).

diskussion

i denne undersøgelse sammenlignede vi ekspressionsniveauerne af tolv miRNA i plasmaprøver fra CRC patienter og neoplasme-fri kontrol. Til vores viden, dette er den første rapport om cirkulerende miRNA for CRC detektion ved hjælp TaqMan MicroRNA Array for miRNA profilering. Fem miRNA (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) blev identificeret fra microarray analyser og syv blev valgt fra litteraturen (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145, -181b) til yderligere undersøgelse [17]. I vores validering undersøgelse blev ekspressionsniveauerne af miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, og -145 fundet at være signifikant højere hos CRC patienter end hos neoplasm- frie kontroller. ROC-analyse af de identificerede miRNA korrigeret for over-optimisme ved bootstrap gav en AUC på 0,745 (95% CI: 0,708-0,846). Dette resultat sammenlignes favorabelt med resultaterne af andre blod- tests til CRC påvisning [5].

Diagnostiske karakteristika cirkulerende miRNA for CRC blev tidligere evalueret i to nylige undersøgelser. Ng et al. rapporterede 0,89 følsomhed og 0,70 specificitet ved en bestemt skæringspunkt af MIR-92a, og en AUC på 0,885 (95% CI: 0,83-0,94) baseret på 90 CRC patienter (TNM stadium I /II /III /IV: 6 /34/23/27) og 50 kontroller [10]. Huang et al. rapporteret 0,830 følsomhed og 0,847 specificitet og en AUC på 0,883 (95% CI: 0,830-0,937) opnået i en multivariat analyse, herunder miR-29a og miR-92a baseret på 100 CRC patienter (TNM stadie I /II /III /IV : 27/25/38/10) og 59 kontroller [9]. Således begge undersøgelser fundet højere AUC-estimater end opnået i den foreliggende undersøgelse. Disse undersøgelser havde ikke justeret for over-optimisme. Mens 95% konfidensinterval (0,774-0,888) af det justerede AUC i vores undersøgelse omfattede AUC rapporteret af Ng et al. og Huang et al., justering for over-optimisme svækket AUC med ca. 6 procent enheder. Ikke desto mindre, selv vores ukorrigerede AUC estimat var lidt lavere end de tidligere rapporterede dem, trods det større antal inkluderet miRNA. Faktorer, der kunne til dels udgør disse forskelle omfatter fase distribution af CRC’er og chance. Procentdelen af ​​tidlige stadie CRC patienter (AJCC stadie I og II) var højere i vores undersøgelse (59%) end i de tidligere rapporterede undersøgelser (44% og 52%, henholdsvis) og sandsynligvis tættere på distributionen etape forventes i en screening indstilling [5]. Imidlertid blev der ikke observeret nogen væsentlig forskel på ekspressionsniveauerne ved scenen i vores undersøgelse.

tyktarms adenomer repræsenterer en forløber fase af adenocarinoma. En tidligere undersøgelse havde rapporteret, at den differentierede udtryk for plasma miR-29a og miR-92a også kunne skelne avancerede adenom patienter fra neoplasme-fri kontrol, selv om diskrimination var mindre udtalt end for CRC patienter [9]. I vores undersøgelse blev ingen af ​​de undersøgte miRNA fundet signifikant forskelligt udtrykt i de avancerede adenom patienter sammenlignet med neoplasmen-fri kontrol. Disse resultater antyder, at de undersøgte miRNA ikke kan være anvendelige til diagnose af avancerede adenomer. Imidlertid kan manglende betydelige forskelle også skyldes begrænset magt til at opdage moderate forskelle med prøvens størrelsen af ​​vores substudie sammenligner bærere af avancerede adenomer og neoplasme-fri fag betragtning af observerede manglende differentieret udtryk for individuelle miRNAer, en multivariat model for forudsigelse af avancerede adenomer blev ikke anvendt.

Selvom den differentielle ekspression af plasma miR-18a, -20a, -21, -106b, -133a, -143, -145 og -181b i CRC patienter blev undersøgt i nogle vævsprøve baserede undersøgelser [24] – [27], det er, så vidt vi ved, den første undersøgelse rapportering om ekspressionen af ​​disse miRNA i plasmaprøver fra et stort antal patienter med CRC og neoplasme-fri kontrol. Statistisk signifikante forskelle i ekspression af alle analyserede miRNA undtagen miR-181b, miR-342-3p og miR-532-3p blev observeret. Interessant nok viste vore data, at ekspressionsniveauerne af MIR-133a -143 og -145 signifikant overudtrykt i plasmaet fra CRC patienter sammenlignet med neoplasmen-fri kontrol, hvilket synes at være i modstrid data konsekvent viser mindre ekspression af disse tre miRNA i kræft i vævsprøve baserede undersøgelser [28] – [34]. Yderligere undersøgelser med et større antal af patienter og samtidige målinger af miRNA udtryk i plasma og væv kan være berettiget til at afklare dette spørgsmål.

Et almindeligt problem i forskning vedrørende cirkulerende miRNA er, at der ikke er etableret konsensus intern kontrol. Vi evaluerede miR-16, miR-188-5p og RNU6B, og på grund af den konsekvente, stabil og høj ekspression på tværs af alle plasmaprøver blev miR-16 valgt som intern kontrol i plasma prøve baserede tests, men mere empiriske valideringer er stadig behov for en konsensus på robuste og nøjagtige interne kontroller.

de ni miRNA fundet at være overudtrykt i plasma fra CRC patienter i vores undersøgelse er også blevet undersøgt med hensyn til de andre sygdomme i tidligere forskning [9] [10], [33], [35] – [48]. (Tabel 3) For eksempel plasma MIR-21 blev fundet at være overudtrykt i en lang række forskellige maligniteter, herunder hepatocellulær carcinom, prostatacancer, og gastrisk cancer [35], [36], [42], [46] – [49]. Disse fællestræk i miR-21 udtryk mønster i forskellige kræftformer suggestes at miR-21 kan fungere som et onkogen. Funktionelle undersøgelser viste, at MIR-21-mål tumorsuppressorgener, såsom phosphatase og tensin homolog (PTEN) og omvendt regulerer dets ekspression [50]. PTEN er rangeret den anden mest almindeligt muterede tumorsuppressorgen efter p53. Det kan inaktiveres ved mutation med tab af heterozygositet, promotor methylering, miRNA interferens og nogle andre mekanismer i en række cancere, herunder hjerne, prostata, livmoderkræft [51]. Differentiel udtryk for nogle miRNA i flere kræftformer støtter forslag om, at de typisk bør kombineres med yderligere miRNA, når de anvendes til påvisning af specifikke kræftformer.

Der er nogle begrænsninger, der skal tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne af denne undersøgelse. Først stikprøvestørrelsen stadig er lille, især i markør udvælgelsesfasen. For det andet, en masse miRNA ‘forekomster i plasma er for lavt til at være nøjagtigt kvantificeres ved QRT-PCR derfor nogle potentielle relevante markører kunne ikke komme i betragtning. For det tredje, er det fortsat skal bestemmes, i hvilket omfang modificeret ekspressionsniveauer af miRNA findes blandt CRC patienter i denne undersøgelse er CRC specifikke.

Konklusioner

Plasma miRNA synes at være potentielt nyttige biomarkører for tidlig påvisning og diagnose af CRC. Mens forskning i plasma baseret miRNA profilering er stadig på meget tidligt tidspunkt i forhold til forskning i væv baseret miRNA profilering, kan det har potentiale til at bidrage til udvikling af nye metoder af ikke-invasiv, blod baseret CRC screening. Alligevel kan den diagnostiske ydeevne af det identificerede panel af miRNA endnu ikke tilstrækkelig til at konkurrere med udførelsen af ​​andre ikke-invasive undersøgelser, især immunokemiske afføringen blodprøver [52]. Yderligere forskning på en multi-markør blod baseret test, kunne potentielt herunder panel af miRNA er identificeret i denne undersøgelse være en lovende tilgang til at øge repertoiret for ikke-invasiv kræftscreening.

Støtte oplysninger

figur S1 .

Receiver opererer karakteristiske kurver ved hjælp af 12 udvalgte microRNA (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p og miR- 532-3p) for diskrimination af 80 kolorektal kræftpatienter og 144 neoplasme-fri kontrol. Forkortelser: FPR, falsk positive rate. TPR, sand positiv sats. . AUC, areal under modtager opererer kurve

doi: 10,1371 /journal.pone.0062880.s001

(DOC)

tabel S1.

667 menneskelige microRNA testet ved hjælp af TaqMan MicroRNA Array

doi:. 10,1371 /journal.pone.0062880.s002

(DOC)

tabel S2.

RT-primer puljer anvendes til multiplex Real-Time kvantitativ PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0062880.s003

(DOC)

tabel S3.

Spearman korrelationskoefficienter på microRNA ekspressionsniveauerne blandt 324 deltagere i valideringen (p 0,001 hvis ikke kommenteret)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0062880.s004

(DOC)