PLoS ONE: Drug-Selected human lungekræft Stamceller: Cytokine Network, Tumorgenetisk og metastatisk Properties

Abstrakt

Baggrund

Kræft stamceller (CSCS) menes at være ansvarlig for tumor regenerering efter kemoterapi, selv om direkte bekræftelse af dette er stadig forestående. Vi undersøgte derfor, om narkotikabehandling kunne berige og vedligeholde CSCS og om de høje tumorigene og metastatiske evner CSCS var baseret på deres markant evne til at producere vækst og angiogene faktorer og udtrykke deres beslægtede receptorer til at stimulere tumorcelleproliferation og stromadannelse.

Metode /Fund

Behandling af lunge tumorceller med doxorubicin, cisplatin eller etoposid resulterede i udvælgelsen af ​​narkotika overlevende celler (DSC). Disse celler udtrykte CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, og nuklear β-catenin og tabt ekspression af differentieringsmarkører cytokeratiner 8/18 (CK 8/18). DSC var i stand til at vokse som tumor kugler, vedligeholde selvfornyelse kapacitet, og differentiere. Differentierede forfædre mistede udtryk for CD133, tjente CK 8/18 og købte narkotika følsomhed. I nærværelse af lægemidler, blev differentiering af DSC’er ophævet tillader opformering af celler med CSC-lignende karakteristika. Lung DSC’er demonstrerede høj tumorgen og metastatisk potentiale følgende podning i SCID-mus, som støttede deres klassificering som CSCS. Luminex analyse af humane og murine cytokiner i sonikerede lysater af forældreor- og CSC-afledte tumorer afslørede, at CSC-afledte tumorer indeholdt to til tre gange højere niveauer af humane angiogene og vækstfaktorer (VEGF, bFGF, IL-6, IL- 8, HGF, PDGF-BB, G-CSF, og SCGF-β). CSCS viste også forhøjede niveauer af ekspression af human VEGFR2, FGFR2, CXCR1, 2 og 4-receptorer. Desuden menneskelige CSCS vokser i SCID-mus stimuleret murine stroma til at producere forhøjede niveauer af angiogene og vækstfaktorer.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater tyder på, at kemoterapi kan føre til spredning af CSCS og forebyggelse af deres differentiering. De høje tumorigene og metastatiske potentialer CSCS er forbundet med en effektiv cytokinnetværk produktion, som kan udgøre et mål for øget effektivitet af kræftbehandling

Henvisning:. Levina V, Marrangoni AM, DeMarco R, Gorelik E, Lokshin AE ( 2008) Drug-Selected human lungekræft Stamceller: Cytokine Network, Tumorgenetisk og metastatisk Egenskaber. PLoS ONE 3 (8): e3077. doi: 10,1371 /journal.pone.0003077

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: 25. maj 2008; Accepteret: August 8, 2008; Udgivet: 27 August, 2008

Copyright: © 2008 Levina et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra RO1 CA098642, R01 CA108990, Avon (NIH /NCI), Susan Komen Foundation (AEL), og DOD BC051720 tilskud, tilskud fra Harry Lloyd Charitable Trust, Hillman Foundation og Pennsylvania Department of Health (EG).

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de senere år er blevet genereret betydelige eksperimentelle beviser til støtte af den rolle, en lille population af selvfornyende celler, der kunne opretholde malign vækst [1], [2]. Denne population blev kaldt kræft-initierende celler eller cancer stamceller (CSCS) for deres høje kapacitet til selv-fornyelse, multilineage differentiering og overlegne niveauer af malignitet. CSCS er blevet identificeret og isoleret i forskellige maligniteter, herunder bryst-, hjerne-, prostata-, pankreas-, lunge- og coloncancer [3] – [11]

CSCS blev identificeret under anvendelse af flow-cytometri-baseret cellesortering og NOD. /SCID-mus xenografting. CSCS udtrykker vævsspecifikke celleoverflademarkører: fx bryst CSCS udtrykker CD44 + /CD24

lav [3], og hjerne, prostata-, lunge- og pancreas CSCS udtrykker CD133 + [2], [4], [7], [8 ], [10].

Flow-cytometri-baserede celle-sortering, som muliggør isolering af en “side population” (SP) med beriget cancer stamceller aktivitet blev beskrevet af Goodell et al [12]. SP-celler er karakteriseret ved særskilte lav Hoechst 33342 farvestof farvning, tilskrives ekspressionen af ​​ABCG2, en ATF-bindende kassette (ABC) transporter [13]. SP-celler demonstrerer også en større tumorigen kapacitet end ikke-SP-celler [13] – [15]. Flow-cytometri-baserede metoder til sortering CSCS, anvendelse af specifikke væv CSC markører samt dannelsen af ​​sfæriske klynger af selv-replikerende celler [16] – [18], tillader isolering af en celle population beriget med tidlig Stamform /stamceller .

på grund af deres høje modstand narkotika og tumorgenicitet, er CSCS menes at være ansvarlig for tumor regenerering efter kemoterapi [19], [20], selv om direkte bekræftelse af dette er stadig forestående. Vi hypotese derfor, at CSCS kan beriges og efterfølgende isoleret fra tumorcellepopulationer efter lægemiddelbehandling.

I den foreliggende undersøgelse lægemiddel overlevende celler (DSC) blev isoleret fra humane cancercellelinier behandlet med cisplatin, doxorubicin, eller etoposid . Isolerede DSC’er udstillet høje klonogene kapacitet, berigelse med SP celler, udtryk for CSC celleoverfladen og embryonale stamcellelinjer markører, en evne til selv-fornyelse, generering af differentierede afkom, og høj tumorigent potentiale efter SCID mus transplantation. Vi konkluderede, at disse DSC’er var CSCS.

Det er også blevet foreslået, at CSCS har høj metastatisk potentiale [21]. For nylig blev forholdet mellem pancreatiske CSCS og tumormetastase demonstreret [8]. Vi viste, at narkotika isoleret lunge CSCS har høj metastatisk potentiale.

Det er fortsat uklart, hvilke egenskaber CSCS bibringer forøget tumorigenicitet og metastatisk potentiale. Vi antager, at de tumorigene og metastatiske evner CSCS var baseret på deres markant evne til at producere vækst og angiogene faktorer, som stimulerer tumorcelleproliferation samt fremme dannelsen af ​​tumor vaskulære system for at tilføre ilt og næringsstoffer til lokal tumorvækst eller fjernt vækst efter udbredelse af tumorceller i forskellige anatomiske steder. Således er yderst effektiv produktion af vækst og angiogene faktorer er en fundamental egenskab ved tumor-initierende celler. VEGF er en potent angiogen faktor [22], mens vækstfaktorer, såsom bFGF, EGF, og HGF kan stimulere proliferation af ikke kun tumorceller, men også endotelceller og således åbenbart proangiogene og antiapoptotiske virkninger [23]. Nogle data indikerer, at chemokiner, såsom IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2), og RANTES (CCL5), ikke kun stimulere migration, men også proliferation af tumorceller og stromaceller, herunder endotelceller [24]. For nylig blev det vist, at IL-8 udviser stærk angiogen aktivitet via transaktivering af VEGF receptor 2 (VEGFR2) [25]. Således forskellige typer tumor producerer faktorer (cytokiner, kemokiner, angiogene og vækstfaktorer) har overlappende funktioner i fremme tumorvækst. Talrige forsøg og kliniske data indikerer, at neutralisering af vækst eller angiogene faktorer, eller blokere deres receptor signalering, kan inhibere tumorvækst, hvilket bekræfter vigtigheden af ​​disse faktorer i tumorcelleproliferation [26]. Synes således produktion af vækst og angiogene faktorer CSCS afgørende for deres tumorigene og metastatiske potentialer. Men denne CSC cytokin og vækst /angiogen faktor netværk havde ikke tidligere blevet undersøgt.

Derfor, i den foreliggende undersøgelse, udførte vi en omfattende analyse af forskellige cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer produceret af parentale H460-tumorceller og isolerede CSCS der anvender multiplex xMAP teknologi (Luminex Corp., Austin, TX), som muliggør samtidig analyse af talrige opløselige faktorer. Denne analyse blev udført

in vitro

på dyrkede celler og

in vivo

udnytte den menneskelige tumor xenotransplanteret model i SCID-mus. Humane tumorer, der vokser i SCID-mus består af humane tumorceller og murine stroma. Sonikerede ekstrakter af de xenotransplanterede humane tumorer indeholdt cytokiner produceret af humane tumorceller såvel som af murine stromale celler. Koncentrationer af hver type cytokiner kan analyseres ved anvendelse af multiplex kits udviklet specielt til påvisning af humane eller murine cytokiner. Dette kunne give oplysninger om cytokin netværk produceret af CSCS og deres evne til at stimulere stromadannelse.

Vores undersøgelser viser, at stoffet overlevende lunge tumorceller har karakter af CSCS, og producere forhøjede niveauer af flere cytokiner, kemokiner, vækst og angiogene faktorer og deres receptorer. Disse fund bringer ny indsigt til vores forståelse af de mekanismer, der er ansvarlige for høj tumorigen og metastatisk potentiale lunge CSCS og deres evne til at overleve kemoterapi.

Materialer og metoder

Cellelinjer

Humane dyrkede cancercellelinier, OVCAR-3 (ovarie), MCF-7 (bryst), og H460 (lunge), blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Cellerne blev dyrket i dyrkningsmedier, som anbefalet af ATCC, suppleret med 20% FBS (Millipore Inc., Billerica, MA).

Reagenser

Cisplatin, doxorubicin, etoposid, og Hoechst 33342 var fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Fluorokromkonjugerede antistoffer mod human CD24, CD34, CD44, CD24, CD117, CD90, VLA-4, og VLA-5 var fra Beckman Coulter (Fullerton, CA). Antistoffer mod FGFR2, VEGFR1, VEGFR2, og CXCR1, 2, 4 var fra R . D Systems INC (Minneapolis, MN). Antistoffet mod VLA-6 blev opnået fra ABD Serotec (Raleigh, NY). Antistoffer mod CD 133 og cytokeratiner 8/18 var fra Abcam Inc. (Abcam, Cambridge, MA). Alexa Fluor®-488 konjugeret muse antihuman TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1-4, og antistoffet mod human β-catenin blev indkøbt fra BD Biosciences Inc. (San Diego, CA). Antistoffet mod fosfor-β-catenin var fra Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA). En embryo-stamcelle (ES) markering prøve kit, designet til påvisning af SSEA-1, 3, 4, TRA-1-60, TRA-1-81, og Oct-4, blev opnået fra Chemicon International (Tamecula, Ca). Alexa Fluor®-488 phalloidin og sekundær Ab’er konjugeret med Alexa 488, 546, og 680 var fra Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA).

klonogene assays

Celler blev udpladet ved en densitet af 10-50 celler /cm

2 i 100 mm

2 petriskåle eller i en tæthed på 0,5 celler /brønd i 96-brønds plader og dyrket i 14 dage. For koloni tælling blev cellerne fikseret og farvet med Coomassie brilliant blå.

Flowcytometrianalyse

For side befolkning (SP) analyse af celler, vi brugte standard-protokol [12]. Til hæmning ABCG2 transportør, blev 10 uM fumitremorgin C (Calbiochem /EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA) tilsat 10 min før Hoechst tilsætning. I nogle forsøg blev verapamil (50 pmol /L) tilsat farvestof for at bekræfte SP (data ikke vist). Celler blev analyseret under anvendelse af et MoFlo cytometer (Cytomation, Fort Collins, CO). Excitation af Hoechst farvestof blev udført ved anvendelse af en UV-laser til 351 til 364 nm; fluorescensen blev målt med en 515-nm side population filter (Hoechst blå) og en 608 EFLP optisk filter (Hoechst rød). Instrument gevinster blev justeret for at indstille den vigtigste celle kohorte, som omfatter de fleste af de celler, der indeholder én kopi af DNA i centrum af plottene. CD133 + celler blev sorteret fra forældrenes lungekræft H460 befolkning ved hjælp MoFlo cytometer og standard protokol for immunfluorescensfarvning.

Cellefarvning procedure for Cellomics ArrayScan automatiseret billedbehandling

Cellerne blev fluorescens farvet som beskrevet [27]. Kort beskrevet blev celler dyrket i plader med 96 brønde, vasket med FACS buffer, inkuberet med antistoffer mod CD24, CD34, VLA-4, VLA-5, VLA-6, CD44, CD87, CD90, CD117, FGFR2, VEGFR1 og VEGFR2 konjugeret med FITC, PE, eller PC5, i 1 time, faste i 2% PFA i 20 minutter, vasket i PBS og farvet med Hoechst 33342. for at teste CD133, CXCR1, CXCR2 og CXCR4 ekspression blev celler inkuberet med respektive primære antistoffer og derefter med sekundære antistoffer konjugeret med Alexa 488, 546, eller 680 fluorochromer (Molecular Probes /Invitrogen) i 1 time. Celler blev derefter farvet med Hoechst 33342.

For at detektere intracellulære proteiner blev celler fikseret, permeabilazed og inkuberet med primære antistoffer mod embryonale stamceller markører, β-catenin, og cytokeratiner 8/18 i 1 time og med sekundære antistoffer konjugeret med Alexa 488, 546, eller 680 fluorochromer (Molecular Probes /Invitrogen) i 1 time. For actin cytoskeleton farvning blev celler inkuberet med Alexa Fluor 488 Phalloidin i 1 time. Cellekerner blev derefter farvet med Hoechst 33342 ved 2 mg /ml i 20 min for at identificere de enkelte celler og optimere fokusere

For at plette tumor sfærer, alle manipulationer blev udført under den mikroskopiske kontrol:. Tumor kugler blev forsigtigt placeret i individuelle brønde af ultralav vedhæftende 96 brønds plader, og inkubation med primære og sekundære antistoffer var den samme som beskrevet ovenfor for de adhærente kulturer.

Alle inkubation og fikseringen blev udført ved stuetemperatur.

Cellomics ArrayScan automatiseret billedbehandling

Cellomics ArrayScan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA) blev anvendt til at indsamle oplysninger om distribution af fluorescens-mærkede komponenter i de farvede celler. Det ArrayScan HCS-systemet scanner flere felter i de enkelte brønde, erhverve og analysere hver af celle billeder i henhold til definerede algoritmer. Scanneren er udstyret med emission og excitation filtre (XF93, Omega Optiske, Brattleboro, VT, USA) til selektivt billeddannelse fluorescerende signaler. Data blev taget til fange, udvundet, og analyseret med ArrayScan II dataopsamling og Data Viewer version 3.0 (Cellomics), Quattro Pro-versionen 10.0.0 (Corel, Ottawa, Ontario, Canada), og MS Excel 2002 (Microsoft, Redmond, WA).

Kultur af lungekræft kugler

Suspension vækst blev vurderet i methylcellulose-baserede (MC-baserede) medium som beskrevet [16], [17]. Kort fortalt blev H460-celler og lægemiddel valgt celler resuspenderet i 0,8% MC-baseret serumfrit medium (stamcelle Technologies, Vancouver, Canada) suppleret med 20 ng /ml EGF (BD Biosciences), bFGF og 4 ug /ml insulin (Sigma ) og udpladet med 500-10000 celler /ml i ultralav adhærente brønds plader 24-96 (Corning, Corning, NY). EGF, bFGF (20 ng /ml) og insulin (4 ug /ml) blev tilsat hver anden dag i to uger. Mediet blev udskiftet eller suppleret med frisk vækstfaktorer to gange om ugen. For at vurdere den selvfornyende potentiale af cellerne, blev kugler opsamlet ved forsigtig centrifugering, dissocieret til enkeltcelle-suspensioner, filtreret og dyrkes under betingelser beskrevet ovenfor.

Differentiering Salg

Celler dissocieres fra kugler (tredje generation) blev udpladet med 1 x 10

4 celler /ml på plader med 96 brønde belagt med collagen IV (BD Biosciences) i kulturmedie suppleret med 10% FBS uden vækstfaktorer og overføres til nye plader, når kulturerne nåede konfluens. For at teste selvfornyende potentiale af differentierede celler blev celler overført til halvfast serumfrit medium suppleret med EGF, FGF, og insulin og deres evne til at danne tumor sfærer blev evalueret som beskrevet ovenfor. For at udføre fænotypisk karakterisering af celler fra kugler og celler efter differentiering blev celler podet i 96-brønds plader (5 × 10

3 celler /brønd) og farvet med forskellige antistoffer som beskrevet ovenfor.

kemoterapi modstand undersøgelser

H460 parentale celler, celler opnået fra lungekræft sfærer, og tre uger efter CSCS differentieringsfaktorer celler blev udpladet i plader med 96 brønde belagt med collagen IV (BD Biosciences) og dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS. Efter 24 timer doxorubicin og cisplatin blev tilsat ved de endelige koncentrationer (fra 0,016 til 025 ug /ml og 0.165-3.30 ug /ml). Efter 72 timers behandling blev celler farvet med Hoechst 33342, og antallet af celler pr brønd blev talt med Cellomics Array Scan VTI (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA), som beskrevet [27].

Migration og invasion assay

migration og invasion aktivitet af tumorceller som respons på humant rekombinant IL-8 (100 ng /ml) blev målt i BD BioCoat Matrigel invasion Chambers (BD Biosciences, San Jose, CA) ifølge producent protokol.

Analyse af tumorigene og metastatiske egenskaber af DSC og H460 tumorceller

Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjer, som Pittsburgh University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og National Institute of Health guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. SCID-mus, 7-8 uger gamle (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), blev opretholdt i dyret facilitet fra University of Pittsburgh Cancer Institute (UPCI).

For at sammenligne tumorigene egenskaber, H460 celler og DSC blev høstet og injiceret (i 200 pi PBS) subkutant (sc) i SCID-mus ved koncentrationer på 5 × 10

3-5 × 10

5 celler per mus (5 mus pr gruppe) uden Matrigel. Tumorer blev målt to gange om ugen. Mus blev aflivet, når deres tumorer målt ca. 2 cm i diameter.

For at analysere evnen hos H460-celler og CSCS at danne metastaser, 5 × 10

4-celler blev inokuleret intravenøst ​​(iv) i halevenen af SCID-mus. SCID-mus var T, B og NKT-cellen-deficiente men havde aktive NK-celler, der kunne eliminere humane tumorceller cirkulerer i blodet. At depletere NK-celler, blev SCID-mus inokuleret intraperitonealt (i.p.) med 0,2 ml anti-asialo GM1 IgG (fortyndet 1:20) 24 timer før i.v. inokulering af tumorceller [28]. Efter 60 dage blev musene aflivet; lunger, lever og nyrer blev fjernet og fikseret i Bouins opløsning; og metastatiske knuder blev talt under et dissektionsmikroskop.

Udarbejdelse af tumorekstrakter

tumorer dyrket subkutant i SCID-mus blev fjernet og lynfrosset i flydende nitrogen. Frosne tumorvæv blev udskåret, sonikeret i 20 s og centrifugeret ved 15.000 g i 10 minutter til fjernelse af cellerester. Tumor ekstrakter blev opbevaret ved -80 ° C.

Multiplex analyse af cytokiner Salg

Analyse af humane cytokiner og vækstfaktorer i cellekulturmedium og i sonikerede tumorlysater blev udført under anvendelse multiplexing xMAP teknologi (Luminex Corp., Austin, TX). Multiplex kits til påvisning af 49 humane cytokiner: IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL -13, IL-15, IL-17, GM-CSF, IFN-α, TNFa, MCP-1, MCP-2, MCP-3, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, VEGF, bFGF , G-CSF, eotaxin, HGF, MIG, GROa, sIL-2R, sVCAM-1, CTACK, LIF, M-CSF, NGF, PDGF-BB SCF, SCGF-β, SDF-1α, TNF β, TRAIL IFN γ, EGF, TNFRI, TNFRII, DR5, IL-1Rα, og sIL-6R blev indkøbt fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Multiplex kit til påvisning af SFA’er, sFasL, TGFa, fractalkin, sCD40L, TRAP, CS154, MIF, sVCAM-1, sICAM-1, MPO, Adiponectin, MMP-9, og tPAI-1 blev erhvervet fra Linco /Millipore (St. Louise, MO). Kittet til påvisning af MMP-2 og MMP-3 blev indkøbt fra R 0,05

Resultater

Isolering af CSCS baseret på deres modstand mod kemoterapeutiske medikamenter

æggestokkene OVCAR -3, bryst MCF-7, og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) H460-celler blev behandlet med cisplatin (1-5 uM), etoposid (1-5 uM) eller doxorubicin (0,067 til 0,125 ug /ml) i Tre dage. Et stort flertal af cellerne døde. I løbet af de næste 7 dage nogle overlevende celler lignede senescentceller med forstørret og fladtrykt morfologi [30]. Disse “ældede” celler blev større i størrelse og døde under uge 2-4. I den første uge efter lægemiddelbehandling, lille, rund, eller spindel-formede celler med lavere vedhæftning blev opdaget, og deres voksende kolonier gradvist erstattet den “ældede” celler i lægemiddelbehandlede kræft cellepopulationer (figur 1A). Vi antog, at narkotika overlevende små celler var CSCS. For at verificere dette, blev de udvidede narkotika overlevende celler (DSC) analyseret for deres klonogene kapacitet, SP fænotype, CSC markører, selvfornyelse kapacitet, evne til at skelne, og tumorigen og metastatisk potentiale.

A , morfologi forældrenes MCF7, OVCAR3 og H460 celler og narkotika overlevede celler (DSC)

MCF-7 og H460 celler blev behandlet med doxorubicin (0,125 mg /ml).; OVCAR-3 celler blev behandlet med cisplatin (3,3 ug /ml). Efter 48 h lægemidler blev fjernet, og lægemiddel-overlevende celler (DSC) blev dyrket i 3-4 uger.

B, Øget kolonidannelse med DSC’er isoleret fra parental MCF7 (bryst), H460 (lunge) og OVCAR-3 (ovarian) cancercellelinjer. Salg Celler blev podet 0,5 celler /brønd i plader med 96 brønde med kulturmedie suppleret med 10% FBS, og cellerne blev dyrket i to uger. Procentdelen af ​​kolonidannelse blev beregnet. *** – P 0,001.

C, Analyse af side befolkning (SP) i DSC og forældrenes MCF7, OVCAR-3 og H460 cellelinjer

. Tumor celler blev farvet med 5 ug /ml Hoechst33342 (HO). Nogle celler blev forbehandlet med 10 pM fumitremorgin C (FTC) i 10 minutter forud for Hoechst tilsætning (HO + FTC). Celler blev resuspenderet i RPMI med 20% FBS og 2 pg /ml propidiumiodid og sorteret under anvendelse MoFlo cytometer. Data for levedygtige celler blev analyseret for parametriske sammenhænge og kommenteret hjælp FCS Express.

Clonogenicity af DSC’er

klonogene kapacitet forældrenes H460, OVCAR3, og MCF7 celler og DSC befolkninger blev testet som beskrevet i Materialer og Metoder. Mindre end 40% af forældrenes celler var i stand til at danne kloner, mens klon-dannende evne DSC’er var mere end dobbelt højere (figur 1B).

Analyse af SP fænotype

Analyse af SP fraktioner afslørede, at testede parentale cellelinier afveg i andelen af ​​SP fraktion, der spænder fra 0,6% i OVCAR3, 0,5% i MCF7, til 5,2% i H460 celler (figur 1C). SP cellefraktioner var væsentligt højere i DSC populationer varierende fra 10,7% i MCF7, 15,6% i OVCAR3 til 35,3% i H460. En særskilt lav Hoechst 33342 farvning af SP celler er blevet tilskrevet udtryk for ABCG2, en ATF-bindende kassette (ABC) transportør [13]. For at evaluere ABCG2 transporter aktivitet, fumitremorgin C (FTC), blev en ABCG2 specifik inhibitor anvendes. SP brøkdel af DSC celler faldt betydeligt i tilstedeværelsen af ​​FTC (figur 1C), hvilket bekræfter opregulering af ABCG2 transporter i DSC.

Analyse af CSCS og embryonale stamceller (ESC) markører

Den Cellomics Array Scan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher) blev anvendt til billedbehandling og analyse af ekspressionen af ​​CSCS og embryonale stamcellelinjer markører i DSC. Denne tilgang er baseret på en kombination af mikroskopi og flowcytometri metoder i en 96-brønds format. Fordelene ved den fremgangsmåde omfatter: Der er behov for 10 gange mindre celler end for flowcytometrianalyse, multi-spektral fluorescens mikro-imaging er automatiseret, og billederne gemmes, visualiseres og analyseres ved hjælp af kraftige softwareprogrammer

Analysen. afslørede, at DSC population fra MCF-7-celler var CD44 positive med lave niveauer af CD24-ekspression (data ikke vist), hvilket svarer til den tidligere identificerede fænotype af bryst CSCS [3]. De DSC’er fra æggestokkene OVCAR-3 linie udtrykte CD44 + og ES markør Oct-4 (data ikke vist).

Til dato er human lunge CSCS dårligt karakteriseret [10], [15]. Vi fokuserede derfor næste på karakterisering af CSC ejendomme i DSC’er fra lunge H460 tumor cellelinje. Analyse af CD34, CD24 /CD44, CD87, og CD90 celleoverflademarkører viste ingen differentiel ekspression mellem H460 parentale og DSC populationer (data ikke vist), hvorimod isolerede humane lunge DSC’er blev beriget for CD133 + -populationen (figur A, B). Vi analyserede næste udtryk for embryonale stamceller (ESC) markører, podocalyxin antigener, TRA-1-60, TRA-1-81, glycolipid antigener, scenen antigener SSEA-3, 4, og transskription faktor Oct-4, i H460 parentale celler og isolerede DSC’er. Højere udtryk for TRA-1-81, SSEA-3, og Oct-4 blev fundet i isolerede DSC’er i forhold til forældrenes H460 celler (Figur 2C, D), understøtter vores antagelse, at DSC åbenbart markører i forbindelse med SCs.

H460 celler og DSC’er, vokser i plader med 96 brønde, blev fikseret og inkuberet med primært Abs mod CD133, TRA-1-81, SSEA-3, Oct-4, eller cytokeratins8 /18 og derefter med sekundær Abs. Cellekerner blev farvet med Hoechst 33342. Cell billeder blev erhvervet ved hjælp af Cellomics ArrayScan HCS Reader (20X, 40X mål) og analyseret ved hjælp af Target Activation BioApplication Software Module.

A, Immunofluorescerende billeder af tumorceller. B, Fluorescensintensitet (pix) af CD133 afbildet mod objektet område.

Hvert punkt repræsenterer en enkelt celle. Celler til højre for den røde linje er CD133 + (ovenfor IgG-kontrol-farvning).

C, Billeder af tumorceller immunofluorescently farvede tumorceller til TRA-1-81, SSEA-3 og Oct-4

ES cellemarkører. D. Fluorescens intensiteten af ​​TRA-1-81, SSEA-3 og Oct-4, plottet mod objekt område. Hvert punkt repræsenterer en enkelt celle. Celler til højre for den røde linje er positive (over IgG-kontrol-farvning). E,

Billeder af immunofluorescently farvede tumorceller for cytokeratins8 /18.

F,

Fluorescens intensitet cytokeratins8 /18 i H460 celler (sorte prikker) og DSC (grå prikker) plottet mod objekt området

.

Lave niveauer af differentiering markør cytokeratiner (CK) udtryk i DSC’er

lungekræft celler vides at udtrykke type i CK18 og type II Ck8 cytokeratiner, kendt differentiering markører i disse celler [31]. Vi sammenlignede ekspression af Ck8 /18 i H460 celler og DSC’er. I sammenligning med parentale H460 cellelinien, DSC’er udtrykte meget lave niveauer af Ck8 /CK18 (figur 3D, E), hvilket indikerer en differentiering status af de isolerede DSC’er lav.

Celler blev fikseret og inkuberet med Alexa Fluor® 488 phalloidin eller med primær Abs mod β-catenin og med sekundær Alexa Fluor 488 konjugeret Abs. Næste celler blev farvet med Hoechst33342. Cell billeder blev erhvervet ved hjælp af Cellomics ArrayScan HCS Reader (20X mål) og analyseres ved hjælp af Rum Analyse BioApplication Software Module og Target Activation BioApplication Software Module.

A, Billeder af H460 celler og DSC’er immunofluorescently farvet for β-catenin (A).

B,

En gennemsnitlig fluorescensintensitet af nuklear β-catenin i H460 (sort linje) og DSC (grå linie)

.C,

En gennemsnitlig fluorescensintensitet af cellulære fosfor tilsam- β-catenin i H460 (sort linje) og DSC (grå linie). D, Cytoskellet billeder af H460 celler og DSC’er immunofluorescently farvet for phalloidin og Hoechst33342.

β-catenin udtryk

Wnt signalering proteiner har vist sig at spille en rolle i at kontrollere stamcelle selvfornyelse. β-catenin er en central aktør i Wnt-vejen, transmission Wnt signaler til kernen og spille en afgørende rolle i tumorigenese [32] – [34]. Her analyserede vi den intracellulære fordeling af β-catenin i H460 celler og DSC’er. DSC viste væsentligt højere niveauer af total og nuklear β-catenin end parentale H460 celler (figur 3A, B), hvorimod phosphoryleret β-catenin var til stede ved lavt niveau i DSC’er sammenlignet med parentale H460 celler (figur 3C). Det vides, at i differentierede celler, hvor Wnt signalering er fraværende, er niveauet af β-catenin reguleret af en multiproteinkompleks “ødelæggelse kompleks”, som binder og phosphorylerer β-catenin, således målrette den til ubiquitinering og proteolytisk nedbrydning [32]. I stamceller hvor Wnt-ligander præsenteres, er denne “ødelæggelse kompleks” hæmmes, forhindrer β-catenin phosphorylering og nedbrydning, hvilket fører til en stabilisering og nuklear translokation af β-catenin [32] – [34]. Således høje nukleare ophobning af β-catenin og lave niveauer af phosphoryleret β-catenin foreslå den aktive Wnt signalering i DSC.

Analyse af celle migration og ekspressionen af ​​VLA adhæsionsmolekyler

Vores morfologisk analyse af DSC og parentale H460 celler afslørede forskelle i celleform og adhæsionsegenskaber, hvilket tyder potentielle forskelle i deres cytoskeletorganisation. For at teste denne hypotese anvendte vi Alexa 488 phalloidin at visualisere F-actin. Som vist i figur 3D, parentale H460 celler har en rund form og ensartet fordeling af F-actin i cytoplasmaet, hvorimod nogle DSC’er har lamellipodial udvidelse og actin pigge på forkant af cellerne. Disse resultater antyder, at DSC’er har en større “vandrende fænotype” end parentale H460 celler. Vi undersøgte vandrende kapacitet H460 celler og DSC’er anvendelse af en

in vitro

migration og invasion assay under anvendelse af IL-8 som kemoattraktant. Betragtninger, kun 13,7% af forældrenes H460 celler invaderet gennem Matrigel, 87,5% af DSC var invasiv.

Adhæsionsmolekyler, herunder integriner, lette celle overlevelse signalering og er involveret i motilitet, intercellulær adhæsion, kemotaksi, og metastase [35]. Vi sammenlignede ekspressionen af ​​integriner VLA-4, VLA-5, og VLA-6 i H460 celler og DSC’er. Vi fandt, at DSC’er havde signifikant højere niveauer af VLA-5 og lavere niveauer af VLA-6 i sammenligning med parentale celler, hvorimod VLA-4-niveauer var ens i begge subpopulationer (figur 4D). Berøvelse af tumorcelleadhæsion kan udløse apoptose. Denne form for apoptose, der induceres som følge af tabet af cellens vedhæftning til et substrat, blev benævnt anoikis. Den lave adhæsion af DSC’er kan nedsætte deres afhængighed af nogle overlevende signaler og føre til resistens over for anoikis. Anoikis-resistente celler udviste højere metastatisk evne [36].